本發(fā)明涉及中藥提取、分離領(lǐng)域，尤其涉及從馬齒莧藥材中提取、分離和鑒別出的新碳架生物堿化合物及其提取分離方法。

背景技術(shù)：

馬齒莧(Portulaca oleracea L.)，又名長命菜、馬莧菜，為馬齒莧科植物。2015版《中華人民共和國藥典》中收載馬齒莧的干燥地上部分入藥，具有清熱解毒、涼血止血、止痢等功效，用于熱毒血痢、癰腫疔瘡、濕疹、丹毒、蛇蟲咬傷、便血、痔血、崩漏下血等，馬齒莧耐旱耐澇，且耐光耐陰，分布廣泛，資源豐富，作為藥食兩用的野生植物備受關(guān)注。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，馬齒莧具有抗炎止痛、抗菌抗病毒、降血壓、降血脂、抗氧化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。研究表明馬齒莧眾多化學(xué)成分為其多樣的藥理作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，馬齒莧主要化學(xué)成分包括黃酮類、香豆素、萜類、甾類、生物堿、氨基酸、各種色素類和礦物質(zhì)類等。其中生物堿是馬齒莧中一類主要的化學(xué)成分，目前已報(bào)道的生物堿類成分有去甲腎上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二環(huán)己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏?；野?；還有環(huán)二肽生物堿和酰胺類生物堿：馬齒莧酰胺A-I、K、L、N-S。

目前從馬齒莧中分離出的化學(xué)成分大多數(shù)是已知的，且結(jié)構(gòu)新穎性較低，因此，對馬齒莧中新化合物的進(jìn)一步開發(fā)和分離是亟待需要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供從馬齒莧中提取的新碳架生物堿化合物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的新碳架生物堿具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤的作用，同時提供一種簡便、快速、環(huán)保且純度高的提取分離方法。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供新碳架生物堿化合物，分子式分別為C₁₈H₂₆N₂O，C₁₈H₂₄N₂O₂，化學(xué)名依次為：

2,2,4,5,7,7,8a-heptamethyl-2,6,7,8,8a,9-hexahydro-3H-cyclopenta[1,2-b:3,4-c']dipyridin-3-one(化合物1，oleracimine)；

2,2,4,5,7,7,8a-heptamethyl-6,7,8a,9-tetrahydro-2H-cyclopenta[1,2-b:3,4-c']dipyridine-3,8-dione(化合物2，oleracimine A)。

化學(xué)結(jié)構(gòu)式依次為：

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明還提供一種馬齒莧中新碳架生物堿化合物的提取分離方法，具體步驟為。

步驟1、取馬齒莧干燥藥材，采用水煎煮提取，水提液濾過，合并濾液直接加熱濃縮，放涼至室溫，得藥液備用。

步驟2、將步驟1中藥液用乙酸乙酯反復(fù)萃取，減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。

步驟3、將步驟2中乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱層析分離，依次用石油醚-丙酮梯度洗脫得到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測，顯色，合并顯色的洗脫部位，將合并后的洗脫部位經(jīng)減壓濃縮至干，得到濃縮物備用。

步驟4、將步驟3中所得濃縮物再經(jīng)預(yù)處理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷鍵合硅膠填料)層析分離，用甲醇-水梯度洗脫，得到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測，顯色，將各顯色的洗脫部位分別減壓濃縮至干，得到濃縮物備用。

步驟5、將步驟4中所得各濃縮物經(jīng)預(yù)處理的Sephadex LH-20(羥丙基葡聚糖凝膠)層析分離，分別以甲醇-水梯度洗脫，得到來源于馬齒莧的新碳架生物堿化合物。

所述ODS和Sephadex LH-20凝膠的預(yù)處理過程為甲醇浸泡過24小時，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。

本發(fā)明的有益效果。

本發(fā)明中所述馬齒莧新碳架化合物的分離和藥理活性研究未被現(xiàn)有的論文期刊所報(bào)道；本發(fā)明提供來源于馬齒莧的新碳架生物堿化合物及一種針對本發(fā)明新化合物的提取分離方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析、ODS中壓柱、及Sephadex LH-20，成功提取分離出碳架獨(dú)特的新生物堿化合物，該方法操作步驟僅為五步，操作方法簡便及快速，提取分離過程主要采用水提取及乙酸乙酯萃取，工藝方法環(huán)保，且經(jīng)該方法分離得到的化合物純度較高均大于90％，此外經(jīng)研究表明以上各化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤作用，因此本發(fā)明兩種新化合物及其鹽和衍生物可以作為其他化合物合成先導(dǎo)物，以及新藥開發(fā)和藥理活性研究的原料，亦可用于制備抗炎、治療疼痛和抗腫瘤的藥物。

附圖說明

圖1為本發(fā)明新碳架生物堿化合物1的紫外光譜圖。

圖2為本發(fā)明新碳架生物堿化合物1的紅外光譜圖。

圖3為本發(fā)明新碳架生物堿化合物1的高分辨質(zhì)譜圖。

圖4為本發(fā)明新碳架生物堿化合物1的¹H-NMR光譜圖。

圖5為本發(fā)明新碳架生物堿化合物1的¹³C-NMR光譜圖。

圖6為本發(fā)明新碳架生物堿化合物1的核磁共振碳譜(DEPT)光譜圖。

圖7為本發(fā)明新碳架生物堿化合物1的核磁共振¹H-¹HCOSY光譜圖。

圖8為本發(fā)明新碳架生物堿化合物1的核磁共振HMBC光譜圖。

圖9為本發(fā)明新碳架生物堿化合物1的核磁共振HSQC光譜圖。

圖10為本發(fā)明新碳架生物堿化合物1的核磁共振NOESY光譜圖。

圖11為本發(fā)明新碳架生物堿化合物2的紫外光譜圖。

圖12為本發(fā)明新碳架生物堿化合物2的紅外光譜圖。

圖13為本發(fā)明新碳架生物堿化合物2的高分辨質(zhì)譜圖。

圖14為本發(fā)明新碳架生物堿化合物2的¹H-NMR光譜圖。

圖15為本發(fā)明新碳架生物堿化合物2的¹³C-NMR光譜圖。

圖16為本發(fā)明新碳架生物堿化合物2的核磁共振碳譜(DEPT)光譜圖。

圖17為本發(fā)明新碳架生物堿化合物2的核磁共振¹H-¹HCOSY光譜圖。

圖18為本發(fā)明新碳架生物堿化合物2的核磁共振HMBC光譜圖。

圖19為本發(fā)明新碳架生物堿化合物2的核磁共振HSQC光譜圖。

圖20為本發(fā)明新碳架生物堿化合物2的核磁共振NOESY光譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1。

本發(fā)明提供一種新碳架生物堿化合物，分子式為C₁₈H₂₆N₂O，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為。

所述新碳架生物堿化合物1根據(jù)結(jié)構(gòu)命名為2,2,4,5,7,7,8a-heptamethyl-2,6,7,8,8a,9-hexahydro-3H-cyclopenta[1,2-b:3,4-c']dipyridin-3-one，表1為該新碳架生物堿化合物的核磁數(shù)據(jù)：¹H-NMR與¹³C-NMR在CDCl₃中。

表1：本發(fā)明新碳架生物堿化合物1的核磁數(shù)據(jù)。

請參閱圖1-10，本發(fā)明一種新碳架生物堿化合物的結(jié)構(gòu)鑒定與推導(dǎo)。

化合物1：黃色粉末，[α]²⁰_D+4.2(c 0.38,MeOH)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、微溶于水。噴稀碘化鉍鉀試液顯紅棕色，提示該化合物為生物堿成分,UV(MeOH)λ_max:448，272nm，IRν_N-H3354，ν_C＝O1666，ν_C＝N1554，δ_N-H1510，ν_C-N1049cm^-1，HRESI(+)TOFMS給出m/z:287.2118[M+H]⁺的準(zhǔn)分子離子峰，分子量為286.2045。結(jié)合¹H-NMR，¹³C-NMR以及DEPT數(shù)據(jù)，推測該化合物可能的分子式為C₁₈H₂₆N₂O，不飽和度為7。¹³C-NMR譜和DEPT譜顯示18個碳信號，分別為7個CH₃(δ：14.3，21.1，27.4，28.6，28.8，29.1，32.5)、2個CH₂(δ：46.8，52.3)、9個季碳(一個羰基碳，δ：206.2；一個碳氮雙鍵的碳，δ：169.4；四個雙鍵碳，δ：110.7,121.3,141.0,143.5；三個脂肪碳，δ：38.9,50.6，65.7)。

¹H-NMR譜顯示一個活潑H信號δ4.07(1H，brs)，表明其可能在一個氨基基團(tuán)。7個甲基信號，分別為δ1.17(3H，s)，δ1.30(3H，s)，δ1.31(3H，s)，δ1.34(3H，s)，δ1.45(3H，s)，δ1.82(3H，s)，δ1.88(3H，s)。2個亞甲基信號分別為δ2.02(1H，d，J＝13.5)，δ1.47(1H，d，J＝13.5)和δ2.56(1H，d，J＝15.3)，δ2.28(1H，d，J＝15.3)，根據(jù)H-H COSY譜可知，7個甲基中H譜δ1.88與δ1.82相耦合，δ1.45與δ1.31相耦合，δ1.17與δ1.34、δ1.30相耦合。而δ1.82與δ1.88相對于其他甲基化學(xué)位移較大，可能與雙鍵相連。

HMBC譜相關(guān)峰表明H₃-13與C-4,C-4a,C-4b,C-5,C-7和C-12；H₃-14與C-7,C-8和C-15；H₃-15與C-7,C-8，C-8a和C-14；H₂-8與C-4b,C-7,C-8a,C-9,C-14,C-15和C-16；H₃-16與C-4b,C-8,C-8a,C-9,C-14和C-15；H₂-9與C-2,C-4a,C-4b,C-8,C-8a,C-9a,和C-16有耦合作用，說明存在一個含亞胺基團(tuán)的六元環(huán)和一個五元環(huán)結(jié)構(gòu)，此兩個環(huán)共用C-4b,和C-8a兩個碳原子，且結(jié)合H-H COSY譜可知，兩個甲基C-14,C-15連接在C-7上，一個甲基C-13連接在C-5上，一個甲基C-16連接在C-8a上。C-5,C-7和C-9a出現(xiàn)在碳譜低場區(qū)(δC-5：141.0,δC-7：50.6,δC-9a：169.4)，說明此三個碳原子與N原子相連。由HMBC相關(guān)譜顯示H₃-10與C-2,C-3和C-11；H₃-11與C-2,C-3和C-10；H₃-12與C-3,C-4,C-4a,C-4b,C-5,C-9a和C-13的耦合關(guān)系可知，另有一含N原子和羰基的六元環(huán)片段與上述一個五元環(huán)共用C-4a和C-9a兩個碳原子，一個甲基C-12連接在C-4上，且結(jié)合H-H COSY譜可知兩個甲基C-10,C-11均連接在C-2上。此外，季碳原子C-2出現(xiàn)在碳譜低場區(qū)(δC-5：65.7)，可推測得知N也與C-2相連且C-2另一端連有羰基。根據(jù)以上信息，此新碳架生物堿為上述結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明提供一種新碳架生物堿化合物，分子式為C₁₈H₂₄N₂O₂，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

所述新碳架生物堿化合物2根據(jù)結(jié)構(gòu)命名為2,2,4,5,7,7,8a-heptamethyl-6,7,8a,9-tetrahydro-2H-cyclopenta[1,2-b:3,4-c']dipyridine-3,8-dione，表2為該新碳架生物堿化合物的核磁數(shù)據(jù)：¹H-NMR與¹³C-NMR在CDCl₃中。

表2：本發(fā)明新碳架生物堿化合物2的核磁數(shù)據(jù)。

請參閱圖11-20，本發(fā)明一種新碳架生物堿化合物的結(jié)構(gòu)鑒定與推導(dǎo)。

化合物2：黃色粉末，[α]²⁰_D-13(c 0.1,MeOH)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、微溶于水。噴稀碘化鉍鉀試液顯紅棕色，提示該化合物為生物堿成分,UV(MeOH)λ_max:446，268nm，IRν_N-H 3470，3290，ν_C＝O 1712，1668，δ_N-H 1628,ν_C＝N 1578,ν_C＝C 1531,ν_C-N 1312cm-1，HRESI(+)TOFMS給出m/z:301.1911[M+H]⁺的準(zhǔn)分子離子峰，分子量為300.1832。結(jié)合¹H-NMR，¹³C-NMR以及DEPT數(shù)據(jù)，推測該化合物可能的分子式為C₁₈H₂₄N₂O₂，不飽和度為8。¹³C-NMR譜和DEPT譜顯示18個碳信號，分別為7個CH₃(δ：14.6,22.1，25.5,27.6,27.8,28.4，28.6)、1個CH₂(δ：43.3)、10個季碳(兩個羰基碳，206.7,212.1；一個碳氮雙鍵的碳，166.8；四個雙鍵碳，δ：110.6,122.2,140.3,142.0；三個脂肪碳，δ：49.3,60.2,65.9)。

¹H-NMR譜顯示一個活潑H信號δ4.01(1H，brs)，表明存在一個氨基基團(tuán)。7個甲基信號，分別為δ1.32(3H，s)，δ1.34(3H，s)，δ1.37(3H，s)，δ1.44(3H，s)，δ1.49(3H，s)，δ1.95(3H，s)和δ2.03(3H，s)。1個亞甲基信號為δ2.85(1H，d，J＝17.1)，δ2.60(1H，d，J＝17.1)。根據(jù)H-H COSY譜可知，6個甲基中，δ1.37與δ1.49相耦合，δ1.44與δ1.34相耦合，δ1.32與δ2.85相耦合。而δ1.95和δ2.02相對于其他甲基化學(xué)位移較大，可能與雙鍵相連。

HMBC譜相關(guān)峰表明H₃-13與C-4b和C-5；H₃-14與C-7,C-8和C-15；H₃-15與C-7,C-8和C-14；H₂-9與C-4a,C-4b,C-8,C-8a,C-9a,和C-16有耦合作用，說明存在一個含亞胺基團(tuán)和羰基的六元環(huán)和一個五元環(huán)結(jié)構(gòu)，此兩個環(huán)共用C-4b,和C-8a兩個碳原子，且結(jié)合H-H COSY譜可知，兩個甲基C-14,C-15連接在C-7上，一個甲基C-13連接在C-5上，一個甲基C-16連接在C-8a上。C-5,C-7和C-9a出現(xiàn)在碳譜低場區(qū)(δC-5：142.0,δC-7：60.2,δC-9a：166.8)，說明此三個碳原子與N原子相連。由HMBC相關(guān)譜顯示H₃-10與C-2,C-3和C-11；H₃-11與C-2,C-3和C-10；H₃-12與C-3,C-4,C-4a和C-4b的耦合關(guān)系可知，另有一含有N原子和羰基的六元環(huán)片段與上述一個五元環(huán)共用C-4a和C-9a兩個碳原子，一個甲基C-12連接在C-4上，且結(jié)合H-H COSY譜可知兩個甲基C-10,C-11均連接在C-2上。此外，季碳原子C-2出現(xiàn)在碳譜低場區(qū)(δC-5：65.9)，可推測得知C-2相連在N和羰基之間。根據(jù)以上信息，此新碳架生物堿為上述結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明還提供上述新碳架生物堿化合物的提取分離方法，具體步驟為。

步驟1：稱取馬齒莧干燥藥材100kg，采用水煎煮提取，水體積用量為藥材的10-15倍，煎煮提取三次，每次煎煮1小時，水提液濾過，合并濾液直接加熱濃縮，放涼至室溫，得藥液備用。

步驟2：將步驟1中所得藥液，用乙酸乙酯反復(fù)萃取4次，乙酸乙酯與濃縮液的體積比例為2:1(v:v)，40℃以下減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。

步驟3：將步驟2中所得乙酸乙酯萃取物干法上樣，經(jīng)硅膠柱層析分離，其中硅膠為200-300目，依次用石油醚-丙酮(1:1、1:2、1:3、1:4、1:5，v:v)梯度洗脫，共得到170個部位(即共得到170個瓶，每瓶400mL)，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測，顯色，合并顯色的85-140洗脫部位(即合并顯色的90-130瓶，棄去1-84瓶與141-170瓶)，將合并后的85-140部位經(jīng)40℃以下減壓濃縮至干，備用。

步驟4：將步驟3中所得物再經(jīng)預(yù)處理的ODS中壓柱層析分離，其中填料粒度為20-40μm，用甲醇-水(10/90，30/70，50/50，60/40，70/30，100/0，v/v)梯度洗脫(加壓，使流速為1ml/min，溫度為室溫)，得到12個部位(即梯度洗脫得12個瓶，每瓶200mL)，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測，顯色，將顯色的部位分別合并，50℃以下減壓濃縮至干，備用。所述ODS的預(yù)處理過程為甲醇浸泡過24小時，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。

步驟5：將步驟4中所得各顯色部位經(jīng)預(yù)處理的Sephadex LH-20柱層析，分別以甲醇-水(80/20，v/v)等度洗脫，得到新碳架生物堿化合物。經(jīng)超高效液相色譜，歸一法測定純度均為90-99％。所述Sephadex LH-20凝膠的預(yù)處理過程為甲醇浸泡過24小時，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。

本發(fā)明新碳架生物堿化合物的抗炎作用。

1、主要材料。

1.1、藥品和試劑：實(shí)驗(yàn)所用新碳架生物堿化合物由上述方法制備，純度為90-99％，精密稱取，用DMSO稀釋至下述各劑量組所需溶液。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(杭州四季青公司)；LPS(美國Sigma公司)；IL-6、TNF-α、PGE₂的ELISA試劑盒(美國Cayman公司)；細(xì)胞裂解液、Griess試劑(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞株：RAW264.7巨噬細(xì)胞(美國ATCC細(xì)胞庫)。

1.3分組：分為對照組、LPS組和實(shí)驗(yàn)組，各一組。

2實(shí)驗(yàn)方法。

2.1細(xì)胞培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2MTT比色法測定細(xì)胞活力，上述三組分別取對數(shù)生長期RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×10⁴個/mL，每孔100μL，溫度37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)過夜后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的本發(fā)明新碳架化合物化合物1(1-50μM)或化合物2(1-50μM)，孵育1h后向LPS組和實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為1μg/mL的LPS，另設(shè)調(diào)零組(含DMSO溶媒的培養(yǎng)液)，每組設(shè)3個復(fù)孔，考察加入藥物后對細(xì)胞的影響。上述各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，在各孔細(xì)胞中加入5mg/mL MTT 20μL，溫度37℃，5％CO₂條件下繼續(xù)孵育4h后，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10min，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀570nm波長處測定各孔吸光值。

2.3利用格里斯(Griess)法測定NO的含量，考察本發(fā)明兩種新化合物對LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的NO產(chǎn)生量的抑制作用。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7傳代后在含10％胎牛血清的高糖細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的本發(fā)明新碳架化合物1(1-20μM)或化合物2(1-20μM)，在37℃，5％CO₂條件下孵育1h后用LPS(終濃度為1μg/mL)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，24h后收集上清液，每組處理重復(fù)3孔。Griess法測定細(xì)胞上清液中NO的含量，根據(jù)不同濃度本發(fā)明兩種新化合物對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響，用以反映NO水平。

2.4ELISA法測定炎癥因子IL-6、TNF-α和炎癥介質(zhì)PGE₂：將對數(shù)生長期RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×10⁵個/mL，每孔1mL，溫度37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)過夜，實(shí)驗(yàn)組加入本發(fā)明新碳架化合物1(1-20μM)或化合物2(1-20μM)，培育1h后，在每孔加入LPS(終濃度為1μg/mL)，共孵育24h，每組處理重復(fù)3孔。ELISA法測定兩種馬齒莧來源新生物堿處理后的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE₂的含量。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明兩種新化合物對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖無影響，安全無毒；并可有效抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7所產(chǎn)生過量炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和炎癥介質(zhì)NO、PGE₂，且呈濃度依賴。

細(xì)胞相對存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4：本發(fā)明對RAW264.7巨噬細(xì)胞相對存活率的影響。

注：^*P<0.05與對照組比較(高濃度組有顯著性差異)。

利用格里斯(Griess)法測定NO的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5：本發(fā)明對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)。

注：^*P<0.05與對照組比較，^#P<0.05與LPS組比較。

ELISA法測定炎癥因子IL-6、TNF-α和炎癥介質(zhì)PGE₂結(jié)果如表6所示。

表6：本發(fā)明對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE₂含量的影響(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)。

注：^*P<0.05與對照組比較，^#P<0.05與LPS組比較。

本發(fā)明新碳架生物堿化合物的鎮(zhèn)痛作用。

1主要藥品和試劑。

實(shí)驗(yàn)所用新碳架生物堿化合物由上述方法制備，純度為99％，精密稱取，用生理鹽水稀釋至下述各劑量組所需溶液。致痛劑為0.6％乙酸，用生理鹽水配制。鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠)，用生理鹽水稀釋至下述劑量溶液。

2實(shí)驗(yàn)動物。

昆明種雄性小鼠，體重為20±2g，清潔級，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。室溫20-25℃，自由飲食，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。

3實(shí)驗(yàn)方法。

取健康小鼠，雌雄各半，共100只小鼠，體重20±2g，隨機(jī)分為兩組空白對照組、六組實(shí)驗(yàn)組(分別為本發(fā)明兩種新碳架生物堿化合物高劑量組(2mg/kg)、本發(fā)兩種明新碳架生物堿化合物中劑量組(1mg/kg)、本發(fā)明兩種新碳架生物堿化合物低劑量組(0.5mg/kg)、兩組陽性藥組(5mg/kg)共計(jì)十組，每組10只。

各組小鼠灌胃給予受試藥物，每日兩次，連續(xù)給藥3天?？瞻讓φ战M給予等體積的生理鹽水，陽性藥組給予鹽酸嗎啡注射液。末次給藥1小時后，各組小鼠腹腔注射0.6％乙酸(0.1mL/10g體重)，觀察30分鐘內(nèi)各組小鼠扭體出現(xiàn)時間、扭體次數(shù)、扭體結(jié)束時間，與空白對照組比較計(jì)算各組鎮(zhèn)痛抑制率。按下式計(jì)算鎮(zhèn)痛抑制率，對各組小鼠扭體次數(shù)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為有顯著差異。

抑制率％＝(空白對照組平均扭體數(shù)－給藥組平均扭體數(shù))/空白對照組平均扭體數(shù)×100％。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

空白對照組小鼠腹腔注射乙酸后表現(xiàn)為顯著的扭體次數(shù)多，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疼痛反應(yīng)；與空白對照組比較，中、高劑量組及陽性藥組扭體次數(shù)及扭體結(jié)束時間均有減少趨勢，本發(fā)明新碳架生物堿化合物高劑量組、中劑量組、低劑量組及陽性藥組潛伏期均有不同程度延長趨勢。結(jié)果表明本發(fā)明新碳架生物堿化合物對乙酸致小鼠扭體反應(yīng)有一定的鎮(zhèn)痛作用。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

表7：本發(fā)明對乙酸致扭體反應(yīng)小鼠的鎮(zhèn)痛作用影響(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝10)。

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001與空白對照組比較。

本發(fā)明新碳架生物堿化合物的抗腫瘤作用。

1主要材料。

1.1藥品和試劑：實(shí)驗(yàn)所用新碳架生物堿化合物由上述方法制備，純度為90～99％，精密稱取，用DMSO稀釋至下述各劑量組所需溶液。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(杭州四季青公司)。

1.2細(xì)胞株：人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人胃癌細(xì)胞BGC-823、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1、人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人宮頸癌細(xì)胞Hela-229、卵巢癌細(xì)胞Ho-8910、人類口腔表皮樣癌細(xì)胞KB(中科院上海細(xì)胞庫)。

1.3分組：分為對照組、實(shí)驗(yàn)組和調(diào)零組(含DMSO溶媒的培養(yǎng)液)。

2實(shí)驗(yàn)方法。

2.1細(xì)胞培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2MTI法檢測細(xì)胞增殖，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×10⁴個/mL，每孔100μL，溫度37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)過夜后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的本發(fā)明兩種新化合物，每組設(shè)3個復(fù)孔，加藥后置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。將含藥培養(yǎng)液吸去，加入體積比為4：1的無血清培養(yǎng)液和MTT(終質(zhì)量濃度為5mg/mL)共100mL，繼續(xù)孵育4h，小心吸去上清液后，每孔加入DMSO 150μL，放于震蕩器上震蕩以使結(jié)晶完全溶解(5min)，酶標(biāo)儀在570nm波長下檢測各孔的吸光度(A)值。然后，計(jì)算各濃度化合物對細(xì)胞生長的抑制率,抑制率公式：細(xì)胞生長抑制率＝(1-A_加藥孔/A_對照孔)×100％，再應(yīng)用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，將抑制率對藥物濃度作曲線，計(jì)算IC₅₀值。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明兩種新化合物對人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、人胃癌細(xì)胞BGC-823、人宮頸癌細(xì)胞Hela-229、人類口腔表皮樣癌細(xì)胞KB、卵巢癌細(xì)胞Ho-8910、的增殖具有抑制作用，且隨藥物濃度增大，抑制率也明顯升高，即呈濃度依賴。本發(fā)明兩種新化合物對上述八種腫瘤細(xì)胞IC₅₀值見表8。

表8本發(fā)明兩種新化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。

綜上所述，本發(fā)明提供兩種新碳架生物堿化合物及其提取分離方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析、ODS中壓柱層析、及Sephadex LH-20柱層析，成功的提取分離出新碳架生物堿化合物，該方法簡便，快速，環(huán)保，且經(jīng)該方法分離得到的化合物純度較高，由于所得兩種化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，從常用中藥馬齒莧中提取出來，其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤作用，因此本發(fā)明兩種新化合物及其鹽和衍生物可以作為天然產(chǎn)物開發(fā)中藥新藥，具有廣闊的前景。