本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及脂滴或脂肪體通過(guò)MLDSR蛋白參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脂滴是一種分布廣泛的細(xì)胞器，從原核生物到真核生物都存在。脂滴是一種具有存儲(chǔ)、新陳代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能的細(xì)胞器。在不同的物種及其細(xì)胞中，脂滴可能具有不同的功能。脂滴的動(dòng)態(tài)變化會(huì)直接影響到人們的日常生活。除了在人類健康和食品質(zhì)量中起著重要作用之外，微生物中脂滴的三酰基甘油是開(kāi)發(fā)生物柴油的主要來(lái)源之一。能源的短缺及環(huán)境的污染要求人們盡快開(kāi)發(fā)出可再生的清潔能源。由于微生物能量轉(zhuǎn)化效率較高，因此利用微生物產(chǎn)能尤其是生物柴油的開(kāi)發(fā)變得極其重要。

由于脂滴存在于從人到細(xì)菌的各個(gè)物種中，以及脂滴常駐蛋白具有很強(qiáng)的保守特性，因此，脂滴可能是最早進(jìn)化出來(lái)的細(xì)胞器，對(duì)于基本生命過(guò)程是至關(guān)重要的。脂滴的單層磷脂膜可以提供一種不同于其他細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的獨(dú)特膜質(zhì)環(huán)境。這種特殊的化學(xué)和物理環(huán)境可以提高某些細(xì)胞過(guò)程的特異性和效率。

為了進(jìn)一步確定細(xì)菌中脂滴的功能，我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)目前發(fā)現(xiàn)的含有脂滴及甘油三酯較多的兩種菌株Rhodococcus jostii RHA1(RHA1)和Rhodococcus opacus PD630(PD630)的脂滴蛋白質(zhì)組進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)了一種能改變脂滴大小的、主要的脂滴蛋白，并將其命名為microoganism lipid droplet small(MLDS)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在這些蛋白脂組數(shù)據(jù)中，很多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子富集在脂滴組分中。(Ding等人，2012年Identification of the major functional proteins of prokaryotic lipid droplets.和陳等人，2014年，Integrated omics study delineates the dynamics of lipid droplets in Rhodococcus opacus PD630。)由此，我們推測(cè)脂滴可能會(huì)通過(guò)這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子來(lái)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)。

本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)，將其命名為MLDSR蛋白質(zhì)：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質(zhì)；

b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

c)將序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

其中，序列2由168個(gè)氨基酸殘基組成。

為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。

表1、標(biāo)簽的序列

上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與MLDSR蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。

本發(fā)明提供的與MLDSR蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：

A1)編碼MLDSR蛋白質(zhì)的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；

A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；

A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；

A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；

A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；

A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

A11)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。

上述相關(guān)生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其編碼序列是序列1所示的cDNA分子或基因組DNA分子；

2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由507個(gè)核苷酸組成，編碼序列2所示的氨基酸序列。

這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。

上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。

上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供MLDSR蛋白質(zhì)的新用途。

本發(fā)明提供了MLDSR蛋白質(zhì)在作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子為MLDS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供MLDSR蛋白質(zhì)或上述生物材料的新用途。

本發(fā)明提供了MLDSR蛋白質(zhì)或上述生物材料在調(diào)控目的基因的表達(dá)水平中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述表達(dá)水平為轉(zhuǎn)錄水平。

上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為正向調(diào)控和負(fù)向調(diào)控。

本發(fā)明還提供了MLDSR蛋白質(zhì)或上述生物材料在如下在如下M1)-M7)中任一種中的應(yīng)用：

M1)結(jié)合序列6所示的DNA分子；

M2)結(jié)合序列6第20-62位所示的DNA分子；

M3)結(jié)合序列6第43-62位所示的DNA分子；

M4)結(jié)合序列6第20-42位所示的DNA分子；

M5)結(jié)合序列7所示的DNA分子；

M6)與所述M1)-M5)中至少一種DNA分子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄水平；

M7)與所述M1)-M5)中至少一種DNA分子一起調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。

上述應(yīng)用中，所述調(diào)控是通過(guò)結(jié)合序列6第43-62位所示的DNA分子實(shí)現(xiàn)。所述調(diào)控為隨著所述MLDSR蛋白質(zhì)的量的逐漸降低、目的基因的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供如下N1)-N4)中任一種產(chǎn)品：

N1)上述M1)-M5)中任一所述的DNA分子；

N2)一種產(chǎn)品套裝，由MLDSR蛋白質(zhì)和上述M1)-M5)中任一所述的DNA分子組成；

N3)一種產(chǎn)品套裝，由脂滴或脂肪體、MLDSR蛋白質(zhì)和上述M1)-M5)中任一所述的DNA分子組成；

N4)一種產(chǎn)品套裝，由脂滴或脂肪體與MLDSR蛋白質(zhì)組成。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供脂滴或脂肪體與MLDSR蛋白質(zhì)的新用途。

本發(fā)明提供了脂滴或脂肪體與MLDSR蛋白質(zhì)在調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄水平中的應(yīng)用。

脂滴或脂肪體、MLDSR蛋白質(zhì)和上述M1)-M5)中任一所述的DNA分子一起在調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄水平中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述應(yīng)用中，所述調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄水平是通過(guò)調(diào)控胞質(zhì)或溶液中的MLDSR蛋白質(zhì)的濃度實(shí)現(xiàn)。

上述應(yīng)用中，所述目的基因?yàn)镸LDS基因。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的可以調(diào)節(jié)MLDS表達(dá)的脂滴蛋白?；谏镄畔W(xué)分析，該蛋白質(zhì)被預(yù)測(cè)是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，將它命名為MLDS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(MLDSR)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明：基因mlds和mldsr在同一操縱子中并且MLDSR可正向和負(fù)向調(diào)節(jié)MLDS的表達(dá)。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明MLDSR可以結(jié)合兩個(gè)相鄰的DNA基序且鑒定了其中的關(guān)鍵堿基，從而確定了MLDSR的結(jié)合盒。細(xì)菌組分分析和MLDSR截?cái)嗤蛔凅w實(shí)驗(yàn)表明MLDSR是一個(gè)脂滴相關(guān)蛋白。脂肪體(adiposomes)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明定位在脂肪體上的MLDSR不會(huì)與DNA結(jié)合。體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)證明定位在脂肪體上的MLDSR不能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄而只有溶液中的MLDSR能正向和負(fù)向的調(diào)節(jié)MLDS轉(zhuǎn)錄，暗示了在體內(nèi)脂滴會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)胞質(zhì)中的MLDSR來(lái)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了MLDSR蛋白可調(diào)控MLDS基因的轉(zhuǎn)錄水平，其高濃度抑制MLDS基因表達(dá)、低濃度誘導(dǎo)MLDS基因表達(dá)，同時(shí)脂滴參與其中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式可為調(diào)節(jié)性合成某產(chǎn)物提供可行的方案。

附圖說(shuō)明

圖1為野生型和MLDS敲除突變株中脂滴蛋白的條帶分析，并將下方箭頭所示條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，確定為RHA1_ro02105，即MLDSR。

圖2為MLDSR敲除突變株的PCR鑒定。左圖顯示同源重組模式圖及各個(gè)引物的位置和片段大小。右圖為PCR電泳圖。第1道為陽(yáng)性對(duì)照，以構(gòu)建的敲除質(zhì)粒P為模板，以a/d為引物；第2道為得到的敲除突變株條帶，以突變株為模板，以a/d為引物；第3道為陰性對(duì)照，以野生型RHA1基因組為模板，以a/d為引物；第4,5道分別是以野生型和突變株為模板，以a/b為引物得到的條帶；第6,7道分別是以野生型和突變株為模板，以c/d為引物；第8,9道分別是以野生型和突變株為模板，以f/r為引物得到的條帶，即目的基因mldsr,可以看到第9道中突變株的mldsr基因已經(jīng)被敲除。

圖3為MLDSR敲除突變株的Western blot及SDS-PAGE分析鑒定。用anti-MLDSR作為一抗。

圖4為MLSDR-GFP過(guò)表達(dá)菌株的Western blot分析，用以鑒定MLDSR-GFP過(guò)表達(dá)菌株的成功構(gòu)建。使用anti-GFP作為一抗。

圖5為mldsr缺失突變體與過(guò)表達(dá)菌株中MLDS的轉(zhuǎn)錄水平分析。

圖6為mldsr缺失突變體與過(guò)表達(dá)菌株中MLDS的表達(dá)水平分析。

圖7為基因mldsr的基因組定位以及所結(jié)合的DNA基序示意圖。

圖8為驗(yàn)證蛋白MLDSR與其DNA基序結(jié)合的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。

圖9為進(jìn)一步縮短DNA長(zhǎng)度，用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)最終確定的兩個(gè)MLDSR蛋白結(jié)合的DNA基序：Motif 1(20bp)和Motif 2(23bp)。

圖10為在Motif 1中的組成型突變分析。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(上)和量化(下)顯示了MLDSR結(jié)合的關(guān)鍵堿基(紅色)。其中，數(shù)字前為原堿基，數(shù)字后為突變后的堿基，數(shù)字為所在位置。紅框或紅色堿基表示突變后結(jié)合顯著改變，即為結(jié)合的關(guān)鍵堿基。誤差條表示平均值±SEM，n＝3。

圖11為Motif 2中的組成型突變分析。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(上)和量化(下)顯示了MLDSR結(jié)合的關(guān)鍵堿基(紅色)。其中，數(shù)字前為原堿基，數(shù)字后為突變后的堿基，數(shù)字為所在位置。紅框或紅色堿基表示突變后結(jié)合顯著改變，即為結(jié)合的關(guān)鍵堿基。誤差條表示平均值±SEM，n＝3。

圖12為根據(jù)上述結(jié)果所得到的最短的兩段MLDSR結(jié)合的DNA序列以及其結(jié)合盒。根據(jù)序列相似性，Motif 2為啟動(dòng)子，Motif 1為操縱基因。

圖13為MLDSR蛋白通過(guò)結(jié)合Motif 1調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。當(dāng)MLDSR與DNA摩爾比很高時(shí)，MLDSR會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄(左)；當(dāng)MLDSR與DNA摩爾比很低時(shí)，MLDSR會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄(右)。

圖14為細(xì)胞組分分析，將細(xì)胞破碎后(全細(xì)胞裂解)通過(guò)超速離心得到不同組分(脂滴，細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜)。之后將這組分用不同抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MLDSR是一個(gè)脂滴相關(guān)蛋白。其余抗體為對(duì)照。

圖15為MLDSR蛋白全長(zhǎng)和截?cái)嗟腗LDSR蛋白(1-126，25-126，51-126和25-92氨基酸)與綠色熒光蛋白GFP融合后在細(xì)菌RHA1中的定位。MLDSR蛋白全長(zhǎng)，MLDSR蛋白1-126和MLDSR蛋白的25-126氨基酸都能定位在脂滴上，表明MLDSR蛋白是一個(gè)脂滴相關(guān)蛋白。

圖16為體外脂肪體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。將體外表達(dá)的帶有GST標(biāo)簽的MLDSR蛋白與脂肪體以及DNA混合，孵育,之后離心，并用銀染和PCR分別檢測(cè)蛋白和DNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLDSR能結(jié)合在脂肪體上，但定位在脂肪體上失去了結(jié)合DNA的能力(第4,5,6泳道)，而只有溶液組分中的MLDSR才能結(jié)合DNA(第9,10,11泳道)。GST蛋白為對(duì)照。

圖17為脂肪體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。先將脂肪體，MLDSR和DNA混合孵育，并不斷增加脂肪體的量，之后將離心后的溶液組分用來(lái)做體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著脂肪體濃度增加，溶液組分中的MLDSR蛋白含量減少，而相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平不斷增加，甚至超過(guò)沒(méi)有MLDSR加入的對(duì)照組。表明細(xì)胞質(zhì)中的而不是脂肪體或脂滴定位的MLDSR正向和負(fù)向調(diào)控轉(zhuǎn)錄。在脂肪體樣品和溶液樣品中的蛋白通過(guò)銀染檢測(cè)(上)。RNA通過(guò)EB染色的瓊脂糖凝膠檢測(cè)(中)。使用Image J軟件定量(下)。誤差條表示平均值±SEM，n＝3*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001。

圖18為上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖13和圖16)的模型圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

表1、下述實(shí)施例中的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒

表1中“Ding et al.,2012”代表的文獻(xiàn)為“丁等人，2012.Identification of the major functional proteins of prokaryotic lipid droplets.”

表2、下述實(shí)施例中用到的寡核苷酸

注：斜體核苷酸表示限制性酶切位點(diǎn)，黑體核苷酸表示引入的突變位點(diǎn)

下述實(shí)施例中的pK18mobsacB質(zhì)粒在文獻(xiàn)“丁等人，2012.Identification of the major functional proteins of prokaryotic lipid droplets.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)科學(xué)院生物物理所獲得。

下述實(shí)施例中的pJAM2載體在文獻(xiàn)“丁等人，2012.Identification of the major functional proteins of prokaryotic lipid droplets.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)科學(xué)院生物物理所獲得。

下述實(shí)施例中的野生型細(xì)菌Rhodococcus jostii RHA1(RHA1)和MLDS缺失突變體(脂滴蛋白MLDS被敲除的細(xì)菌RHA1，MLDS KO)均在文獻(xiàn)“丁等人，2012.Identification of the major functional proteins of prokaryotic lipid droplets.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)科學(xué)院生物物理所獲得。

下述實(shí)施例中的MLDS抗體在文獻(xiàn)“丁等人，2012.Identification of the major functional proteins of prokaryotic lipid droplets.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)科學(xué)院生物物理所獲得。

實(shí)施例1、MLDSR的獲得

將野生型細(xì)菌RHA1細(xì)胞和脂滴蛋白MLDS被敲除的細(xì)菌RHA1細(xì)胞(MLDS缺失突變體，MLDS KO)中的脂滴純化出來(lái)，并將脂滴蛋白做成樣品，具體操作步驟詳見(jiàn)“丁等人，2013，Isolating lipid droplets from multiple species.”。將脂滴蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離，并用Colloidal Blue染色。

結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出：在MLDS缺失突變體中含有MLDS的條帶大大降低，而出現(xiàn)另一個(gè)條帶(圖1中的RHA1_ro02105)。將出現(xiàn)的另一條帶切下，并通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。質(zhì)譜分析表明，這一條帶包含了一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RHA1_ro02105，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列1所示的基因命名為mldsr基因，其編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示，將序列2所示的氨基酸序列命名為MLDSR蛋白。

實(shí)施例2、MLDSR蛋白在調(diào)控MLDS蛋白表達(dá)中的應(yīng)用

一、mldsr缺失突變體(MLDSR KO)和mldsr過(guò)表達(dá)菌株(WT+MLDSR-GFP)的獲得和鑒定

1、mldsr缺失突變體(MLDSR KO)的獲得及鑒定

(1)mldsr缺失突變體(MLDSR KO)的獲得

MLDSR的缺失突變體通過(guò)同源重組方法構(gòu)建，具體步驟如下：

A、敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

以細(xì)菌RHA1為模板，采用mldsr-a和mldsr-b引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為500bp的產(chǎn)物AB，其核苷酸序列為序列3；以細(xì)菌RHA1為模板，采用mldsr-c和mldsr-d引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為438bp的產(chǎn)物CD，其核苷酸序列為序列4。連接產(chǎn)物AB和CD，得到連接產(chǎn)物，并將連接產(chǎn)物插入到pK18mobsacB質(zhì)粒的EcoR1和Hind111酶切位點(diǎn)間，得到敲除質(zhì)粒。

B、通過(guò)電擊將敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)到野生型細(xì)菌RHA1細(xì)胞中，通過(guò)使用卡那霉素正向篩選及sacB負(fù)向篩選，獲得mldsr缺失突變體(MLDSR KO)。具體篩選步驟詳見(jiàn)文獻(xiàn)“丁等人，2012.Identification of the major functional proteins of prokaryotic lipid droplets.”中的篩選方法。

(2)mldsr缺失突變體(MLDSR KO)的鑒定

A、采用引物mldsr-a/d和mldsr-f/r對(duì)mldsr缺失突變體(MLDSR KO)進(jìn)行PCR鑒定，其中，用mldsr-f/r引物PCR不能得到條帶的mldsr缺失突變體(MLDSR KO)為陽(yáng)性mldsr缺失突變體(MLDSR KO)。

鑒定結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出：第9泳道未檢測(cè)到條帶，說(shuō)明在MLDSR KO基因組上已經(jīng)將mldsr基因敲除。

B、將步驟A中鑒定的陽(yáng)性克隆與野生型細(xì)菌RHA1細(xì)胞一起在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)，取出1mL菌液轉(zhuǎn)入MSM培養(yǎng)基培養(yǎng)16小時(shí)后，將它們的脂滴純化出來(lái)，并將脂滴蛋白做成樣品，細(xì)菌培養(yǎng)的方法具體詳見(jiàn)“丁等人，2012.Identification of the major functional proteins of prokaryotic lipid droplets.”，脂滴純化的具體操作步驟詳見(jiàn)“丁等人，2013，Isolating lipid droplets from multiple species.”。將脂滴蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離，并用anti-MLDSR(京天成公司制作的MLDSR抗體)作為一抗，進(jìn)行Western blot分析。

Western blot結(jié)果如圖3，結(jié)果表明MLDSR KO中確實(shí)沒(méi)有MLDSR表達(dá)。

mldsr缺失突變體(MLDSR KO)為將野生型細(xì)菌RHA1的mldsr基因的第1-499位缺失(如圖2左圖)，且保持野生型細(xì)菌RHA1基因組的其他序列不變得到的菌。

2、過(guò)表達(dá)mldsr的菌株(WT+MLDSR-GFP)的獲得及鑒定

(1)過(guò)表達(dá)mldsr的菌株(WT+MLDSR-GFP)的獲得

A、過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

將序列1所示的mldsr基因插入質(zhì)粒pJAM2-gfp的BamH1位點(diǎn)中，得到過(guò)表達(dá)載體。其中，pJAM2-gfp質(zhì)粒為將基因gfp插入pJAM2載體的Xba1酶切位點(diǎn)間，且保持其他序列不變得到的載體。

B、將過(guò)表達(dá)載體通過(guò)電擊轉(zhuǎn)到野生型細(xì)菌RHA1細(xì)胞中，通過(guò)GFP的綠色熒光信號(hào)篩選獲得過(guò)表達(dá)mldsr的菌株。同時(shí)將pJAM2-gfp質(zhì)粒通過(guò)電擊轉(zhuǎn)到野生型細(xì)菌RHA1細(xì)胞中，得到對(duì)照菌株。

(2)過(guò)表達(dá)mldsr的菌株(WT+MLDSR-GFP)的鑒定

挑取陽(yáng)性克隆在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)，取出1mL菌液離心后加入SDS上樣溶液，超聲破碎細(xì)菌，并在95度煮5分鐘制作成蛋白樣品。之后用SDS-PAGE進(jìn)行分離并用anti-GFP作為一抗，進(jìn)行Western blot分析。

結(jié)果如圖4所示，在過(guò)表達(dá)mldsr的菌株(WT+MLDSR-GFP)中，目的條帶在50kDa左右(MLDSR+GFP)，而左側(cè)對(duì)照菌株為單獨(dú)GFP表達(dá)，在50kDa左右沒(méi)有條帶。說(shuō)明成功獲得MLDSR過(guò)表達(dá)的克隆。

二、mldsr缺失突變體(MLDSR KO)和過(guò)表達(dá)mldsr的菌株(WT+MLDSR-GFP)中MLDS的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的檢測(cè)

1、用定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)

按照文獻(xiàn)“Chen等人，2014年，Integrated omics study delineates the dynamics of lipid droplets in Rhodococcus opacus PD630.”中的方法，檢測(cè)mldsr缺失突變體(MLDSR KO)和過(guò)表達(dá)mldsr的菌株中MLDS的轉(zhuǎn)錄水平。簡(jiǎn)述如下，分別將mldsr缺失突變體(MLDSR KO)和過(guò)表達(dá)mldsr的菌株(WT+MLDSR-GFP)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀為2.0，然后使用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA，并用TIANGEN RNAclean試劑盒(TIANGEN)純化。對(duì)于實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)分析，RNA使用M-MLV Resverse酶試劑盒(Promega)被反轉(zhuǎn)錄，并在含有SYBR綠熒光染料(ABI)qPCR反應(yīng)中進(jìn)一步使用。使用DD-Ct方法并用16S表達(dá)水平做對(duì)照，來(lái)比較MLDS表達(dá)水平。定量PCR是在ABI的StepOne PLUS PCR儀上進(jìn)行的。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)果如圖5所示，在mldsr缺失突變體(MLDSR KO)和過(guò)表達(dá)mldsr的菌株(WT+MLDSR-GFP)中MLDS的轉(zhuǎn)錄水平都顯著降低。

2、用western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表達(dá)水平的檢測(cè)

由于MLDS蛋白更多的富集在脂滴上，用western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脂滴組分的MLDS蛋白表達(dá)。簡(jiǎn)述如下，從mldsr缺失突變體(MLDSR KO)和過(guò)表達(dá)mldsr的菌株(WT+MLDSR-GFP)中分離脂滴蛋白樣品，具體操作步驟詳見(jiàn)“丁等人，2013，Isolating lipid droplets from multiple species.”，將脂滴蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離，并用MLDS抗體作為一抗進(jìn)行western blot檢測(cè)，并用Colloidal Blue染色。

結(jié)果如圖6所示，在mldsr缺失突變體(MLDSR KO)和過(guò)表達(dá)mldsr的菌株(WT+MLDSR-GFP)中MLDS的表達(dá)水平都明顯降低。

上述實(shí)驗(yàn)表明：MLDSR蛋白可以正向和負(fù)向控制MLDS蛋白的表達(dá)，是MLDS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(regulator)。

實(shí)施例3、蛋白MLDSR結(jié)合的DNA基序的確定

本實(shí)施例利用電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)來(lái)確定蛋白MLDSR與其特異的DNA基序的結(jié)合。具體步驟如下：

一、融合蛋白(GST-MLDSR)的制備

將序列1第4-504位所示的DNA片段插入pGEX-6P-2質(zhì)粒(GE Healthcare)的BamH1和EcoR1酶切位點(diǎn)間，得到重組載體，該重組載體表達(dá)N端帶有GST標(biāo)簽的MLDSR蛋白的融合蛋白，將其記作融合蛋白(GST-MLDSR)，融合蛋白(GST-MLDSR)的氨基酸序列為序列表中序列5。其中，第1-231位為GST標(biāo)簽的氨基酸序列，第232-398位為MLDSR蛋白的氨基酸序列(MLDSR蛋白的氨基酸序列第2-168)。

將上述重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)(TIANGEN CB105)中，得到重組菌。挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)在37℃，200rpm下，在LB中培養(yǎng)直到OD₆₀₀為0.6，然后加入終濃度為0.2mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)3小時(shí)，收獲細(xì)胞，并用裂解緩沖液(20mM的Tris-HCl，pH值8.0，0.5M氯化鈉，1mM EDTA中，4％(體積分?jǐn)?shù))甘油，1mM DTT)重懸。細(xì)菌被破碎，在18000rpm下離心45分鐘。收集上清液。將上清液加入到谷胱甘肽瓊脂糖4B(GE Healthcare)上。然后將樣品用裂解緩沖液洗滌并用含10mM的谷胱甘肽的裂解緩沖液洗脫。蛋白質(zhì)在透析緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，0.15M NaCl，1mM EDTA，4％(體積分?jǐn)?shù))甘油，1mM DTT)中進(jìn)行透析，得到融合蛋白(GST-MLDSR)，并通過(guò)NanoDrop(Eppendorf)進(jìn)行定量。

二、DNA探針的制備

1、103bp(序列6)的DNA探針

以細(xì)菌RHA1基因組DNA為模板，分別采用103bp DNA-f5505和103bp DNA-r5403引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到103bp(序列6)的DNA探針。

上述PCR反應(yīng)條件為66℃退火，72℃延伸30s,39個(gè)循環(huán)。上述反應(yīng)體系為模板1μL，引物各2μL，DNA聚合酶Easypfu(全式金)1μL，聚合酶溶液5μL，dNTP(全式金)5μL和水，共50μL體系)

2、其他DNA探針

用43bp DNA-f和43bp DNA-r序列、30bp DNA-f和30bp DNA-r序列、28bp DNA-f和28bp DNA-r序列、26bp DNA-f和26bp DNA-r序列、24bp DNA-f和24bp DNA-r序列、22bp DNA-f和22bp DNA-r序列、20bp DNA(motif1)-f和20bp DNA(motif1)-r序列、18bp DNA-f和18bp DNA-r序列、16bp DNA-f和16bp DNA-r序列、14bp DNA-f和14bp DNA-r序列、23bp DNA(mot if2)-f和23bp DNA(mot if2)-r序列、21bp DNA-f和21bp DNA-r序列、19bp DNA-f和19bp DNA-r序列、17bp DNA-f和17bp DNA-r序列、15bp DNA-f和15bp DNA-r序列、13bp DNA-f和13bp DNA-r序列進(jìn)行退火，分別得到43bp(序列6第20-62位)、30bp(序列6第38-67位)、28bp(序列6第39-66位)、26bp(序列6第40-65位)、24bp(序列6第41-64位)、22bp(序列6第42-63位)、20bp(序列6第43-62位)、18bp(序列6第44-61位)、16bp(序列6第45-60位)、14bp(序列6第46-59位)、23bp(序列6第20-42位)、21bp(序列6第21-41位)、19bp(序列6第22-40位)、17bp(序列6第23-39位)、15bp(序列6第24-38位)、13bp(序列6第25-37位)的DNA探針。

上述退火反應(yīng)體系為100μM 43bp DNA-f序列、100μM 43bp DNA-r序列、50mM HEPES、100mM氯化鈉和水，共20μL；上述退火反應(yīng)條件為從95℃到50℃梯度退火，每個(gè)間隔5℃，持續(xù)4分鐘。其余獲得DNA探針使用的退火反應(yīng)體系相同。

三、融合蛋白與DNA的結(jié)合

1、分別將步驟二制備的103bp或43bp的DNA探針、步驟一制備的融合蛋白(GST-MLDSR)與結(jié)合溶液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl，1mM EDTA，4％(體積/體積)甘油，1mM DTT，5mM MgCl₂)混勻，分別得到反應(yīng)體系(15微升)。其中，融合蛋白(GST-MLDSR)與103bp或43bp的DNA探針的摩爾比分別為0,1,2,3,4,5,6,8,10,12,16,18,20,24和32。

2、將各反應(yīng)體系在室溫孵育30-40分鐘后加入6×上樣溶液(30mM EDTA，36％甘油，0.05％溴酚藍(lán))。之后用3.5％PAGE凝膠在0.5×TBE溶液中，120V電泳40分鐘。凝膠通過(guò)用EB染色15分鐘觀察。

MLDSR蛋白與103bp或43bp的DNA探針結(jié)合的檢測(cè)結(jié)果如圖7和圖8所示。將基因mldsr上游的大小為103bp的非編碼DNA序列作為MLDSR可能結(jié)合的DNA區(qū)域。通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)MLDSR能夠結(jié)合這個(gè)103bp的DNA序列，并且具有兩個(gè)結(jié)合條帶，如圖8左所示。根據(jù)具有兩個(gè)結(jié)合條帶的特點(diǎn)，逐步縮短這個(gè)103bp DNA的長(zhǎng)度，最后縮短到43bp(序列6的第20-62位)，如圖7所示。EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)MLDSR能夠結(jié)合43bp的DNA探針，且具有兩個(gè)結(jié)合條帶，如圖8右所示。因此，將這43bp DNA確定為最短的完整的MLDSR結(jié)合的DNA區(qū)域。并根據(jù)具有的兩個(gè)結(jié)合條帶推測(cè)這段區(qū)域可能包含兩段結(jié)合基序。

四、蛋白MLDSR的兩個(gè)結(jié)合基序的鑒定

1、分別將步驟二制備的30bp、28bp、26bp、24bp、22bp、20bp、18bp、16bp、14bp、23bp、21bp、19bp、17bp、15bp和13bp的DNA探針、步驟一制備的融合蛋白(GST-MLDSR)與結(jié)合溶液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl，1mM EDTA，4％(體積/體積)甘油，1mM DTT，5mM MgCl₂)混勻，分別得到反應(yīng)體系(15μL)。其中，融合蛋白與30bp、28bp、26bp、24bp、22bp、20bp、18bp、16bp、14bp、23bp、21bp、19bp、17bp、15bp和13bp的DNA探針的摩爾比均為8。

2、將各反應(yīng)體系在室溫孵育30-40分鐘后加入6×上樣溶液(30mM EDTA，36％甘油，0.05％溴酚藍(lán))。之后用3.5％PAGE凝膠在0.5×TBE溶液中，120V電泳40分鐘。凝膠通過(guò)用EB染色15分鐘觀察。

MLDSR蛋白與其他逐步縮短的DNA探針結(jié)合的檢測(cè)結(jié)果如圖9所示。結(jié)果顯示：步驟三中的43bp的DNA序列確實(shí)包含兩個(gè)基序，一個(gè)是基序1，大小為20bp(圖9左)，其核苷酸序列為序列6的第43-62位；一個(gè)是基序2，大小為23bp(圖9右)，其核苷酸序列為序列6的第20-42位。

五、蛋白MLDSR結(jié)合盒的確定

1、定點(diǎn)突變的基序的制備

分別對(duì)步驟四鑒定的基序1和基序2的序列進(jìn)行單堿基對(duì)的突變，使用合成的序列進(jìn)行退火即可得到突變后的基序。使用的序列詳見(jiàn)表2中所列(表2中的加粗堿基代表即為突變后的堿基)。其中，20-m-1-f和20-m-1-r為突變基序1(20bp)第一個(gè)堿基對(duì)使用的序列；20-m-2-f和20-m-2-r為突變基序1(20bp)第二個(gè)堿基對(duì)使用的序列，以此類推。而23-m-1-f和23-m-1-r為突變基序2(23bp)第一個(gè)堿基對(duì)使用的序列；23-m-2-f和23-m-2-r為突變基序2(23bp)第二個(gè)堿基對(duì)使用的序列，以此類推。突變?cè)瓌t為A突變?yōu)镚，G突變?yōu)锳，T突變?yōu)镃，C突變?yōu)門(mén)。共得到20條突變后的基序1探針和23條突變后的基序2探針。

上述退火反應(yīng)體系與步驟二中的退火反應(yīng)體系相同。

2、EMSA實(shí)驗(yàn)確定MLDSR的結(jié)合盒

為了確定MLDSR的結(jié)合盒，將步驟一制備的MLDSR蛋白分別與定點(diǎn)突變的基序1(圖10)和基序2(圖11)進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)。若定點(diǎn)突變的基序中某一堿基的突變導(dǎo)致MLDSR與其結(jié)合的條帶減弱，將該堿基命名為結(jié)合的關(guān)鍵堿基。

結(jié)果如圖10和11所示，其中，基序1中的關(guān)鍵堿基包括:基序1的第3位(G3)，基序1的第5位(T5)，基序1的第6位(T6)，基序1的第8位(C8)，基序1的第13位(G13)，基序1的第15位(T15)，基序1的第16位(A16)，基序1的第18位(C18)(如圖10)；基序2中的關(guān)鍵堿基包括：基序2的第4位(G4)，基序2的第6位(T6)，基序2的第7位(A7)，基序2的第9位(C9)，基序2的第10位(T10)，基序2的第14位(T14)，基序2的第15位(G15)，基序2的第16位(C16)，基序2的第17位(T17)，基序2的第18位(A18)，基序2的第20位(C20)，基序2的第21位(A21)(如圖11)。將基序1和基序2進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們的相同部分，以及結(jié)合上面關(guān)鍵堿基的結(jié)果，最終確定MLDSR的結(jié)合盒：一個(gè)17bp的回文序列：5’-GNTWGCTNNTGCTANCA-3’(序列7)，其中，N為A或G或C或T，W為A或T)。另外，通過(guò)相似性分析發(fā)現(xiàn)，基序1可能是這個(gè)操縱子的操縱基因，而基序2可能是這個(gè)操縱子的啟動(dòng)子。

實(shí)施例4、在體外MLDSR通過(guò)結(jié)合基序1調(diào)控轉(zhuǎn)錄

一、DNA探針的獲得

以細(xì)菌RHA1為模板，采用T7-M1-f和T7-M1-r引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為1414bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列8，將其記為DNA I。DNA I為帶有基序1的DNA探針，其中，第27-46位為基序1，第88-1414位依次為mldsr基因和mlds基因(mldsr-mlds)。

二、體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)

1、將融合蛋白(GST-MLDSR)、步驟一得到的DNA I分子(0.3pmol)與結(jié)合溶液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl，1mM EDTA，4％(體積/體積)甘油，1mM DTT，5mM MgCl₂)混勻，得到反應(yīng)體系(10μL)，室溫孵育30-40分鐘，得到反應(yīng)產(chǎn)物。其中，融合蛋白(GST-MLDSR)與DNA I分子的摩爾比分別為10,50,100，150，200，300，400，600，900，1200以及50，10，8，6，4，2，1，0.5。

2、然后向步驟1得到的反應(yīng)產(chǎn)物中加入1×T7RNA聚合酶緩沖液(5mM rATP，5mM rUTP，5mM rGTP，5mM rCTP和1μL T7RNA聚合酶(RiboMAX大規(guī)模RNA生產(chǎn)系統(tǒng)-T7P1300))，得到反應(yīng)體系(20μL)，在室溫下孵育3小時(shí)，得到反應(yīng)產(chǎn)物。

3、然后向步驟2的反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.5μL RRI(Promega)和0.5μL DNA酶I(TAKARA)在37℃下反應(yīng)20分鐘。樣品經(jīng)1％瓊脂糖凝膠分離并通過(guò)EB染色觀察。產(chǎn)生的RNA的半定量通過(guò)Image J軟件進(jìn)行分析。這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上。

結(jié)果如圖13所示。通過(guò)將融合蛋白(GST-MLDSR)與帶有基序1的DNA探針進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MLDSR蛋白能通過(guò)結(jié)合基序1調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄(如圖13)。并且，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MLDSR蛋白與DNA的摩爾比很高時(shí)(大于50)，MLDSR會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄(圖13左)；當(dāng)MLDSR與DNA的摩爾比變低時(shí)，MLDSR會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄(圖13右)。即當(dāng)MLDSR與DNA的摩爾比由高變低時(shí)，MLDSR會(huì)從抑制轉(zhuǎn)錄變?yōu)榇龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄。

實(shí)施例5、蛋白MLDSR是一個(gè)脂滴相關(guān)蛋白的確定

一、細(xì)胞組分分析檢測(cè)蛋白MLDSR的定位

1、細(xì)菌各組分的分離

具體步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)“Ding等人，Isolating lipid droplets from multiple species，2013年”中的方法。簡(jiǎn)述如下：收集野生型細(xì)菌RHA1細(xì)胞，在溶液A(溶劑為水，溶質(zhì)及濃度為：25mM甘氨酸，250mM蔗糖，pH 7.8)中重懸；將重懸后的細(xì)胞破碎并在6000g下離心10分鐘，收集上清，為全細(xì)胞裂解液。取全細(xì)胞裂解液(10毫升)加入2mL溶液B(溶劑為水，溶質(zhì)及濃度為：20mM HEPES，100mM氯化鉀，2mM氯化鎂，pH7.4)中，在4℃、38000rpm下離心1小時(shí)(貝克曼SW40)，得到三個(gè)組分：上層為脂滴，中間為細(xì)胞質(zhì)，最下面沉淀為質(zhì)膜。

2、各組分的Western blot分析

將上述步驟1中的全細(xì)胞裂解液、脂滴、細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜四個(gè)組分分別加入SDS上樣溶液，在95℃煮5分鐘，并將得到的蛋白樣品用SDS-PAGE分離后再進(jìn)行western分析。使用anti-MLDSR，anti-Ro05469，anti-Ro05869和anti-GFP(后三個(gè)抗體請(qǐng)見(jiàn)文獻(xiàn)“丁等人，2012.Identification of the major functional proteins of prokaryotic lipid droplets.”)四種抗體作為一抗，Western blot檢測(cè)MLDSR蛋白定位情況。

結(jié)果如圖14顯示，MLDSR蛋白明顯的定位于脂滴組分，表明MLDSR蛋白是一個(gè)脂滴相關(guān)蛋白。

二、熒光顯微觀察檢測(cè)MLDSR的定位

1、過(guò)表達(dá)mldsr截短體的菌株的獲得

(1)過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

分別將序列1所示的mldsr基因的第1-378位，第73-378位，第151-378位和第73-276位插入質(zhì)粒pJAM2-gfp的BamH1位點(diǎn)中，分別得到過(guò)表達(dá)MLDSR截短體(MLDSR蛋白的1-126位)的載體、過(guò)表達(dá)MLDSR截短體(MLDSR蛋白的25-126位)的載體、過(guò)表達(dá)MLDSR截短體(MLDSR蛋白的51-126)的載體、過(guò)表達(dá)MLDSR截短體(MLDSR蛋白的1-126位)的載體。

(2)分別將步驟(1)獲得的過(guò)表達(dá)MLDSR截短體通過(guò)電擊分別轉(zhuǎn)到野生型細(xì)菌RHA1細(xì)胞中，并通過(guò)GFP的綠色熒光信號(hào)篩選出陽(yáng)性的各個(gè)過(guò)表達(dá)MLDSR截短體的細(xì)胞。同時(shí)將pJAM2-gfp質(zhì)粒通過(guò)電擊轉(zhuǎn)到野生型細(xì)菌RHA1細(xì)胞中，得到對(duì)照細(xì)胞(WT+GFP)。

2、用激光共聚焦顯微鏡confocal FV1000觀察MLDSR及其截短體的定位

將過(guò)表達(dá)MLDSR全長(zhǎng)及各個(gè)MLDSR截短體的菌株先在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)后，取600微升轉(zhuǎn)移至MSM培養(yǎng)基培養(yǎng)16小時(shí)。之后用染料LipidTOX red(Invitrogen公司)對(duì)各種細(xì)胞中的脂滴進(jìn)行染色。將染色后的細(xì)胞用激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。具體步驟見(jiàn)文獻(xiàn)“丁等人，2012.Identification of the major functional proteins of prokaryotic lipid droplets.”

結(jié)果如圖15所示，在對(duì)照細(xì)胞(WT+GFP)中，綠色信號(hào)彌散在整個(gè)細(xì)胞中，而過(guò)表達(dá)MLDSR全長(zhǎng)的細(xì)胞中，綠色熒光信號(hào)聚集在脂滴周圍。說(shuō)明MLDSR蛋白定位在脂滴上。同時(shí)，過(guò)表達(dá)MLDSR截短體(1-126)細(xì)胞和過(guò)表達(dá)MLDSR截短體(25-126)細(xì)胞中的綠色熒光信號(hào)也聚集在脂滴周圍，也能夠定位在脂滴上，相反，過(guò)表達(dá)MLDSR截短體(51-126)細(xì)胞和過(guò)表達(dá)MLDSR截短體(25-92)細(xì)胞幾乎不與脂滴有接觸。說(shuō)明MLDSR蛋白通過(guò)其第25-126位這一區(qū)域定位在脂滴上，進(jìn)一步說(shuō)明MLDSR是一個(gè)脂滴相關(guān)蛋白。

實(shí)施例6、脂滴或脂肪體通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白MLDSR的細(xì)胞質(zhì)或溶液中的濃度來(lái)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控

一、脂肪體的制備

脂肪體制備的具體操作方法參見(jiàn)文獻(xiàn)“汪等人，2016，Construction of Nano-Droplet/Adiposome and Artificial Lipid Droplets.”中的步驟。簡(jiǎn)述如下：將2mg吹干的DOPC(Avanti 258689)和5μL大鼠的甘油三酯以及100μL溶液B(20mM HEPES、100mM KCl、2mM MgCl₂，pH 7.4)混合渦旋24次，每次10秒。離心，去掉上層及下層部分，收集中間部分即為脂肪體。

二、脂肪體結(jié)合實(shí)驗(yàn)(adiposome binding assay)

上述實(shí)施例結(jié)果表明MLDSR會(huì)特異結(jié)合DNA，同時(shí)MLDSR是一個(gè)脂滴相關(guān)蛋白，為了研究脂滴、MLDSR和DNA這三者之間的關(guān)系，用脂肪體來(lái)模擬細(xì)胞中的脂滴，在體外進(jìn)行脂肪體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。具體步驟如下：

將步驟一制備的脂肪體(50μl)、實(shí)施例3制備得到的融合蛋白(GST-MLDSR)和實(shí)施例4制備得到的DNA I分子(融合蛋白與DNA I分子的摩爾比為50:1)混合，得到反應(yīng)體系(60μl)，室溫孵育30分鐘，然后將反應(yīng)體系在15,000rpm條件下離心5分鐘，收集上層部分，得到脂肪體組分；收集下層溶液，得到溶液組分。

將脂肪體組分用溶液B洗3次，然后將樣品用溶液B調(diào)成等體積(50μl)。脂肪體組分和溶液組分的一部分用作PCR的模板來(lái)檢測(cè)DNA；另一部分加入SDS上樣溶液，在95℃煮5分鐘，并將得到的蛋白樣品用SDS-PAGE分離后再進(jìn)行銀染檢測(cè)。

結(jié)果如圖16所示。結(jié)果表明DNA I分子主要在溶液組分中被檢測(cè)到，而脂肪體組分中幾乎檢測(cè)不到DNA信號(hào)，說(shuō)明定位在脂肪體上的MLDSR不會(huì)結(jié)合DNA，即脂滴或者脂肪體結(jié)合的MLDSR蛋白失去了結(jié)合DNA的能力。

三、脂肪體結(jié)合實(shí)驗(yàn)與體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)共同實(shí)驗(yàn)

盡管脂滴或脂肪體不會(huì)通過(guò)MLDSR結(jié)合DNA，為了研究脂滴是否會(huì)通過(guò)MLDSR間接調(diào)控轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行了如下脂肪體結(jié)合實(shí)驗(yàn)與體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)：

1、分別將0μl、2μl、4μl、6μl、8μl、12μl、16μl或20μl(不足20μl，用溶液B補(bǔ)充至20μl)步驟一制備的脂肪體、實(shí)施例3制備得到的融合蛋白(GST-MLDSR)和實(shí)施例4制備得到的DNA I分子(融合蛋白與DNA I分子的摩爾比為50:1)混合，得到反應(yīng)體系共25μl，室溫孵育30分鐘，然后將反應(yīng)體系在15,000rpm條件下離心5分鐘，收集上層部分，得到脂肪體組分；收集下層溶液，得到溶液組分。

2、取溶液組分10μl作為體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的DNA模板，加入1×T7RNA聚合酶緩沖液(5mM rATP，5mM rUTP，5mM rGTP，5mM rCTP和1μL T7RNA聚合酶(RiboMAX大規(guī)模RNA生產(chǎn)系統(tǒng)-T7P1300))，得到反應(yīng)體系(20μL)，在室溫下孵育3小時(shí)，得到反應(yīng)產(chǎn)物。

3、然后向步驟2得到的反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.5μL RRI(Promega)和0.5μL DNA酶I(TAKARA)在37℃下反應(yīng)20分鐘。樣品經(jīng)1％瓊脂糖凝膠分離并通過(guò)EB染色觀察。產(chǎn)生的RNA的半定量通過(guò)Image J軟件進(jìn)行分析。這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上。

將脂肪體組分用溶液B洗3次，然后將樣品用溶液B調(diào)成等體積(25μl)。剩余的溶液組分和脂肪體組分加入SDS上樣溶液，在95℃煮5分鐘，并將得到的蛋白樣品用SDS-PAGE分離后再進(jìn)行銀染檢測(cè)。

結(jié)果如圖17所示，隨著加入脂肪體的增多，脂肪體組分中的MLDSR蛋白明顯增加，而溶液組分中的MLDSR蛋白顯著減少。由于上述實(shí)驗(yàn)顯示DNA分子主要存在于溶液組分中，所以用溶液組分作為后續(xù)體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的DNA模板，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，隨著加入脂肪體的增多，得到的轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物持續(xù)增加，甚至最后高于未加MLDSR蛋白的對(duì)照。表明脂肪體的增多使更多的MLDSR蛋白被脂肪體招募過(guò)去，從而減少了溶液中的MLDSR濃度。

上述研究表明，當(dāng)MLDSR與DNA的摩爾比由高變低時(shí)，MLDSR會(huì)從抑制轉(zhuǎn)錄變?yōu)榇龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄(圖13)。所以當(dāng)脂肪體的加入減低了溶液中MLDSR濃度后，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物就會(huì)由低變高。這一結(jié)果表明脂滴或脂肪體會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)溶液中MLDSR蛋白濃度間接參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(圖18)。

序列表

<110>中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所

<120>脂滴或脂肪體通過(guò)MLDSR蛋白參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用

<160>8

<210>1

<211>507bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggcaagcg atgatcgcga cgcagccggt gcaggagatc tggcagctcg cgtagtcagc 60

aacgccgctc acgacatcgg aggtttcatt cgtgcccagc gcgaagcagc tcaggtgtcg 120

atgcggcagc tggcgcagct ggccggtgtc agtaatccgt atctgagtca gatcgagcgt 180

gggttgcgca agccctcggc cgaggtgctt gggcagatag ccaagggtct ccgggtgtct 240

tcggaggtcc tgtacgtcca ggcgggttac ctcgagcagc ggccacacgg tcccctccgt 300

gacgctctgc tcgcggatac ggccattacc gagcggcaga agcaagtgct gctcgagatc 360

tacgagtcgt tctgtcgtga gaacgaatcg gcggaagcgg ccgaatcccg gacgtccgag 420

cttcggacag aagaacacca gcgttctgat tcccagacgc cggaaccaga accccccacc 480

gttgaacagg agaaagccga tgactga 507

<210>2

<211>168

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Ala Ser Asp Asp Arg Asp Ala Ala Gly Ala Gly Asp Leu Ala Ala

1 5 10 15

Arg Val Val Ser Asn Ala Ala His Asp Ile Gly Gly Phe Ile Arg Ala

20 25 30

Gln Arg Glu Ala Ala Gln Val Ser Met Arg Gln Leu Ala Gln Leu Ala

35 40 45

Gly Val Ser Asn Pro Tyr Leu Ser Gln Ile Glu Arg Gly Leu Arg Lys

50 55 60

Pro Ser Ala Glu Val Leu Gly Gln Ile Ala Lys Gly Leu Arg Val Ser

65 70 75 80

Ser Glu Val Leu Tyr Val Gln Ala Gly Tyr Leu Glu Gln Arg Pro His

85 90 95

Gly Pro Leu Arg Asp Ala Leu Leu Ala Asp Thr Ala Ile Thr Glu Arg

100 105 110

Gln Lys Gln Val Leu Leu Glu Ile Tyr Glu Ser Phe Cys Arg Glu Asn

115 120 125

Glu Ser Ala Glu Ala Ala Glu Ser Arg Thr Ser Glu Leu Arg Thr Glu

130 135 140

Glu His Gln Arg Ser Asp Ser Gln Thr Pro Glu Pro Glu Pro Pro Thr

145 150 155 160

Val Glu Gln Glu Lys Ala Asp Asp

165

<210>3

<211>500bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

catggggcgc gaggaggtga ccggtctcgc cgcggcgacg tggaccgtcg ccaagcgcct 60

gatcatggaa tccgtcgacg acccgaacag cacgctgcgc acgaaggtcg cggagaacgt 120

cgtgcgcttc ggcgagcggc tgcgcgacga ccacgagctg agagtcaagg tcgacgggtg 180

ggtgctcgcc ggcacgcgct acgtcgtggt ccattacacc gacgagatca ccgcgatcat 240

ctccgacacc gtcgagcgct gggacgccga ggaggcgtcc aagaagatcg agctgcaggt 300

gggacgggac ctccagttca tccgcatcaa cggcaccgtc gtcgggtcga tcgcgggtct 360

gctgatctac acgttctcga cgttgctgtt cggctgacaa tcgcctcgac ggagggtccg 420

ctagctgggt gctaacagag tgcttgcaat tgctagcacc ctgctttagc cttggttctg 480

cccagcaaca cggaggactg 500

<210>4

<211>438bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

atgactgacc agaagaccat cgacagcgtc aagacctcgc tgtacgcggc cgtaggcgcc 60

ggagacgtcg tcgtgcaggc cgtggccgac gtcgtcgccc aggtccgctc gcgcgccgag 120

tccacccagg gtgacgtcga agagcgtgtc ggcggcgcca aggagcgcat cgccggactc 180

caggaagagg tcaccgaggg tgtcgagaac cttcgcgacc gcctcgccgg actgccgtcc 240

gagctgcccg aggagcttgc cgagctgcgt gagaagttca ccgccgacga gctgcgcaag 300

gttgccgagg cctacctgaa ggtcgcctcc gacctgtaca cgtcgctcgc cgagcgcggc 360

gaggacaccg tcgagcgcat ccgcaagcag ccggtcgtcg aggagggcat cggccgcgcc 420

gagaccgcct tcggtgac 438

<210>5

<211>398

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

210 215 220

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Ala Ser Asp Asp Arg Asp Ala Ala Gly

225 230 235 240

Ala Gly Asp Leu Ala Ala Arg Val Val Ser Asn Ala Ala His Asp Ile

245 250 255

Gly Gly Phe Ile Arg Ala Gln Arg Glu Ala Ala Gln Val Ser Met Arg

260 265 270

Gln Leu Ala Gln Leu Ala Gly Val Ser Asn Pro Tyr Leu Ser Gln Ile

275 280 285

Glu Arg Gly Leu Arg Lys Pro Ser Ala Glu Val Leu Gly Gln Ile Ala

290 295 300

Lys Gly Leu Arg Val Ser Ser Glu Val Leu Tyr Val Gln Ala Gly Tyr

305 310 315 320

Leu Glu Gln Arg Pro His Gly Pro Leu Arg Asp Ala Leu Leu Ala Asp

325 330 335

Thr Ala Ile Thr Glu Arg Gln Lys Gln Val Leu Leu Glu Ile Tyr Glu

340 345 350

Ser Phe Cys Arg Glu Asn Glu Ser Ala Glu Ala Ala Glu Ser Arg Thr

355 360 365

Ser Glu Leu Arg Thr Glu Glu His Gln Arg Ser Asp Ser Gln Thr Pro

370 375 380

Glu Pro Glu Pro Pro Thr Val Glu Gln Glu Lys Ala Asp Asp

385 390 395

<210>6

<211>103bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

caatcgcctc gacggagggt ccgctagctg ggtgctaaca gagtgcttgc aattgctagc 60

accctgcttt agccttggtt ctgcccagca acacggagga ctg 103

<210> 7

<211> 17bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> w為a或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n為a或g或c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n為a或g或c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n為a或g或c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n為a或g或c或t

<400> 7

gntwgctnnt gctanca 17

<210>8

<211>1414bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

cactagtaat acgactcact ataggggtgc ttgcaattgc tagcaccctg ctttagcctt 60

ggttctgccc agcaacacgg aggactgatg gcaagcgatg atcgcgacgc agccggtgca 120

ggagatctgg cagctcgcgt agtcagcaac gccgctcacg acatcggagg tttcattcgt 180

gcccagcgcg aagcagctca ggtgtcgatg cggcagctgg cgcagctggc cggtgtcagt 240

aatccgtatc tgagtcagat cgagcgtggg ttgcgcaagc cctcggccga ggtgcttggg 300

cagatagcca agggtctccg ggtgtcttcg gaggtcctgt acgtccaggc gggttacctc 360

gagcagcggc cacacggtcc cctccgtgac gctctgctcg cggatacggc cattaccgag 420

cggcagaagc aagtgctgct cgagatctac gagtcgttct gtcgtgagaa cgaatcggcg 480

gaagcggccg aatcccggac gtccgagctt cggacagaag aacaccagcg ttctgattcc 540

cagacgccgg aaccagaacc ccccaccgtt gaacaggaga aagccgatga ctgaccagaa 600

gaccatcgac agcgtcaaga cctcgctgta cgcggccgta ggcgccggag acgtcgtcgt 660

gcaggccgtg gccgacgtcg tcgcccaggt ccgctcgcgc gccgagtcca cccagggtga 720

cgtcgaagag cgtgtcggcg gcgccaagga gcgcatcgcc ggactccagg aagaggtcac 780

cgagggtgtc gagaaccttc gcgaccgcct cgccggactg ccgtccgagc tgcccgagga 840

gcttgccgag ctgcgtgaga agttcaccgc cgacgagctg cgcaaggttg ccgaggccta 900

cctgaaggtc gcctccgacc tgtacacgtc gctcgccgag cgcggcgagg acaccgtcga 960

gcgcatccgc aagcagccgg tcgtcgagga gggcatcggc cgcgccgaga ccgccttcgg 1020

tgacgccgtc gagctgaccg aggaagctct cggcaccgtt gcacgccaga cgcgcgccgt 1080

cggcgagcag gccgcaaagc tcgcgggccg cgcttcgggt cgcatctccg acaccgccga 1140

gggactcggc gaggccatcg ccgacgccgg cgacgaggct gccctgaagg ttctcgacct 1200

gggcgaccag gccgaggaag cgtcgaagga cgctgccgat cgcgtcaccg ccaccgcggc 1260

cgacgtccag gctcgcgccg acaaggctgc cccggccaag cacgccgctc ccgcgaagaa 1320

ggctgctccg gccaaggctg cggcaacccc ggccccggcc ccggccaaga aggccgccgc 1380

tccggccaag aaggctgctc cggccaagaa ggct 1414