本發(fā)明屬于生物技術(shù)和食品發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一株產(chǎn)胞外多糖的植物乳桿菌。

背景技術(shù)：

乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌產(chǎn)生的高分子多糖聚合物，可分為莢膜多糖和胞外多糖。莢膜多糖一般分布在菌體的細(xì)胞壁上，而胞外多糖通常被釋放到培養(yǎng)液中。乳酸菌胞外多糖在提高發(fā)酵乳制品的流變學(xué)特性、質(zhì)構(gòu)以及適口性方面有著極好的應(yīng)用(femsmicrobiologyreviews,1999,23(2):153-177)。乳酸菌胞外多糖可以在腸道內(nèi)長時(shí)間存在進(jìn)而增加益生菌在腸道內(nèi)的定植(internationaldairyjournal,2002,12(2):163-171)。此外，人們發(fā)現(xiàn)乳酸菌胞外多糖對(duì)重金屬離子和染料分子也有一定的吸附效果(bioresourcetechnology,2014,160:15-23；plosone,2016,11(2):e0148430)。乳酸菌胞外多糖根據(jù)其組成和結(jié)構(gòu)可以分為同多糖和異多糖。同多糖主要有葡聚糖和果聚糖。相比之下，異多糖則由多個(gè)重復(fù)的低聚糖組成，每個(gè)重復(fù)單元通常含有兩個(gè)或兩個(gè)以上單糖并具有不同的連接方式(biotechnologyadvances,2001,19(8):597-625)。乳酸菌胞外多糖帶有一些帶電基團(tuán)，如羧基，磷酸根以及羥基。這些基團(tuán)有助于胞外多糖吸附重金屬。

自然環(huán)境中存在著許多金屬離子或金屬顆粒，包括有毒的重金屬離子如pb、cd、cr等，一些稀有金屬元素如au、ag、pd、pt等，和一些輻射性元素如u、th、ra、am等。環(huán)境以及食品的重金屬污染導(dǎo)致的生物體內(nèi)重金屬富集的現(xiàn)象對(duì)人類健康具有極大的威脅。同時(shí)，重金屬污染毒性較大且廣泛存在。除了人類的自然活動(dòng)之外，其他的人類生產(chǎn)活動(dòng)也會(huì)產(chǎn)生重金屬離子如采礦業(yè)、精煉行業(yè)、工業(yè)加工過程、食品加工過程、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、工業(yè)排放、藥業(yè)以及化妝品廢棄物。除了重金屬污染外，染料污染也不容忽視。染料的排放帶來的顏色不僅令人不愉悅，而且還會(huì)阻礙光線滲透，危害水生物的生長。同時(shí)，大部分染料都是有毒的甚至是致癌的，對(duì)生物體具有較大的毒害作用。傳統(tǒng)的重金屬，染料去除方法包括凝聚和絮凝作用、氧化和臭氧化、膜分離技術(shù)以及生物吸附技術(shù)。被染料污染的廢水很難處理，因?yàn)槿玖戏肿訉儆陬B固分子，對(duì)有氧消化有一定的抵抗性；另外，染料分子在廢水中含量比較低，不容易進(jìn)行大規(guī)模、低成本的處理。近年來發(fā)現(xiàn)生物吸附法可以解決這些問題，并且成本較低，已經(jīng)被證實(shí)有效可行(biotechnologyadvances,2008,26(3):266-291)。也有人用生物吸附法回收貴金屬資源(hydrometallurgy103,180–189)。因此，選擇綠色環(huán)保，可持續(xù)發(fā)展的吸附材料對(duì)重金屬以及染料污染進(jìn)行處理是非常必要的。

胞外多糖用來吸附重金屬已有報(bào)道，像來源于bacillussubtilis和pseudomonasputida的eps能顯著增加cu²⁺的吸附(bioresourcetechnology,2011,102(2):1137-1141；internationalbiodeterioration&biodegradation,2010,64(8):734-741)。bacilluslicheniformis(environmentalpollution,2011,159(5):1369-1374)的eps對(duì)重金屬吸附的選擇性也有報(bào)道。arthrobacterps-5胞外多糖可以吸附cu²⁺、pb²⁺和cd²⁺(carbohydratepolymers,2014,101:50-56)?？傊琫ps對(duì)重金屬的吸附能力與eps的種類，重金屬離子的種類以及環(huán)境條件有很大關(guān)系。然而現(xiàn)有的大多數(shù)吸附材料或者不具有較好的吸附效果，或者是需要較長時(shí)間才能吸附。因此，需要開發(fā)一種吸附時(shí)間較短且吸附效果較好的具有可持續(xù)發(fā)展性的生物吸附劑，用于重金屬和染料的治理。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)胞外多糖的植物乳桿菌，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的吸附效果不佳和吸附時(shí)間較長等問題。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一株產(chǎn)胞外多糖的植物乳桿菌，其分類命名為lactobacillusplantarum，菌株號(hào)為lcc-605，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，，地址為中國武漢市武漢大學(xué)，郵編為430072，保藏編號(hào)為cctccm2016491，保藏日期為2016年9月18號(hào)。

上述產(chǎn)胞外多糖的植物乳桿菌lcc-605是2015年1月15日從云南省富源縣富源酸菜中篩選得到的。

上述產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌lcc-605為革蘭氏陽性菌，觸酶反應(yīng)陰性；經(jīng)api鑒定為植物乳桿菌；經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，其與植物乳桿菌親緣關(guān)系最近；在ncbi上申請(qǐng)基因登錄號(hào)為kx443590(未公開)。

一種胞外多糖，它是由權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌lcc-605產(chǎn)生的，命名為

eps-605。

其中，它能自組裝成直徑50～300nm的球形納米顆粒。

上述胞外多糖eps-605在吸附重金屬和染料中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

其中，所述的重金屬為pb²⁺、cd²⁺和cu²⁺。

其中，所述的染料為亞甲基藍(lán)。

其中，所述的重金屬為污水中的重金屬。

其中，所述的染料為污水中的染料。

其中，吸附溫度為15～40℃；

其中，

在pb²⁺的起始濃度為0～1000mg/l時(shí)，胞外多糖eps-605的飽和吸附量為1513mg/g，飽和吸附時(shí)間為6～8h；

在cd²⁺的起始濃度為0～1000mg/l時(shí)，胞外多糖eps-605的飽和吸附量為2097mg/g，飽和吸附時(shí)間為18～24h；

在cu²⁺的起始濃度為0～1000mg/l時(shí)，胞外多糖eps-605的飽和吸附量為2987mg/g，飽和吸附時(shí)間為8～12h；

在亞甲基藍(lán)的起始濃度為0～1000mg/l時(shí)，胞外多糖eps-605的飽和吸附量為3029mg/g，飽和吸附時(shí)間為18～24h。

上述應(yīng)用方法包括如下步驟：

(1)通過植物乳桿菌lcc-605制備并提純胞外多糖eps-605；

(2)利用步驟(1)中制備得到的胞外多糖eps-605吸附染料。

其中，可采用如下方法通過植物乳桿菌制備并提純胞外多糖：

取植物乳桿菌lcc-605的菌體樣本，用mrs培養(yǎng)基活化三次。4℃，14000g離心30min，以去除菌體。離心后將上層清液倒入燒杯，剩下的菌體再次離心一次，上層清液再次倒入燒杯。然后在燒杯里倒入80％的三氯乙酸，直至三氯乙酸終濃度為4％，放入4℃冰箱過夜，沉淀蛋白。隔天，將燒杯里的溶液再次離心，以分離沉淀的蛋白質(zhì)。去除沉淀，倒出上層清液，再加入三倍體積的無水乙醇，放入4℃冰箱過夜，以沉淀胞外多糖。隔天，將燒杯里的溶液離心，沉淀即為多糖。將多糖取出并加少量超純水溶解，裝入透析袋中，放入大燒杯使其透析三天，每4h換一次水，以去除其中的單糖。三天后，置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，即得植物乳桿菌lcc-605的胞外多糖eps-605。

有益效果：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：

1、該新分離鑒定到的植物乳桿菌lcc-605具有生物安全性，不產(chǎn)生毒素。

2、該胞外多糖eps-605吸附重金屬與亞甲基藍(lán)能力強(qiáng)，為國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中最高。其對(duì)亞甲基藍(lán)、pb²⁺、cd²⁺和cu²⁺的吸附量分別為3029mg/g、1513mg/g、2097mg/g、和2987mg/g。

3、胞外多糖來源于植物乳桿菌發(fā)酵，因此具有環(huán)境友好性和可持續(xù)發(fā)展性。

4、首次發(fā)現(xiàn)非葡聚糖胞外多糖eps-605能自組裝形成80～300nm的納米球形結(jié)構(gòu)。

附圖說明

圖1a為實(shí)施例1中乳酸菌平板篩選示意圖；

圖1b為實(shí)施例1中產(chǎn)多糖乳酸菌的發(fā)酵液粘度示意圖；

圖1c為實(shí)施例1中拉絲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；

圖1d為實(shí)施例2中革蘭氏染色結(jié)果示意圖；

圖2為實(shí)施例2中植物乳桿菌lcc-605的掃描電鏡圖；

圖3為實(shí)施例3中不同碳源條件下產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)pb²⁺、cd²⁺、cu²⁺的吸附對(duì)比圖；

圖4為實(shí)施例3中產(chǎn)生的胞外多糖不同吸附時(shí)間對(duì)pb²⁺、cd²⁺、cu²⁺的吸附對(duì)比圖；

圖5為實(shí)施例3中不同碳源條件下產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)pb²⁺吸附后的掃描電鏡對(duì)比圖；

圖6為實(shí)施例4中胞外多糖吸附亞甲基藍(lán)前以及吸附甲基藍(lán)后胞外多糖的結(jié)果示意圖；

圖7為實(shí)施例4中胞外多糖吸附甲基藍(lán)隨時(shí)間變化的示意圖。

圖8為實(shí)施例4中溶液中的mb殘留量變化示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

植物乳桿菌lcc-605的分離篩選，包括以下步驟：

(1)發(fā)酵樣品液樣品取自曲靖當(dāng)?shù)丶彝プ灾扑岵税l(fā)酵液。

(2)樣品液的稀釋：用無菌的1ml移液管吸取1ml樣品液于無菌的的小試管中用無菌生理鹽水稀釋成稀釋度為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12。選擇稀釋度為10^-4至10^-12備用。

(3)平板分離：首先在超凈臺(tái)上在無菌操作的條件下，將已經(jīng)滅菌的含有碳酸鈣的mrs固體培養(yǎng)基倒平板，待溫度為室溫后吸取以上稀釋度為10^-4至10^-12的發(fā)酵液0.1ml。分別用傾注法和涂布法傾注和涂布到含有碳酸鈣的mrs固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)重復(fù)，并用保鮮膜裝好至于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)48h。如圖1所示，篩選出有透明圈的菌落，并進(jìn)行液體培養(yǎng)，得到產(chǎn)胞外多糖的植物乳桿菌lcc-605的菌體樣本(圖1a)。

(4)對(duì)獲得的植物乳桿菌進(jìn)行拉絲實(shí)驗(yàn)確定產(chǎn)多糖，如圖1b和圖1c所示，該菌株產(chǎn)生粘性多糖。

實(shí)施例2菌株的鑒定和胞外多糖的制備

(1)菌體形態(tài)觀察及革蘭氏染色

在超凈臺(tái)中用接種環(huán)挑去少量實(shí)施例1中制備的搭配的菌體樣本均勻涂抹在載玻片上，再用酒精燈加熱殺死細(xì)菌，滴加草酸銨結(jié)晶紫，染色1min。用水沖掉洗載玻片上多余的染色液，再用吸水紙吸干。滴加少量碘-碘化鉀溶液，靜置1min后水洗，用吸水紙吸干，連續(xù)滴加乙醇進(jìn)行脫色，直至流出的液體無色，然后水洗。最后用蕃紅染液復(fù)染30s。染色結(jié)束后，用顯微鏡進(jìn)行觀察，革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。鑒定結(jié)果表明分離的乳酸菌為革蘭氏陽性菌(圖1d)。

(2)api實(shí)驗(yàn)

取實(shí)施例1中得到的產(chǎn)胞外多糖的植物乳桿菌lcc-605的菌體樣本，在mrs培養(yǎng)皿中劃線，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h。從培養(yǎng)皿中挑選單菌落，置入api50chl培養(yǎng)基中，接入鑒定試劑條，在37℃培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24～48h，記錄樣品菌株在24h和48h時(shí)對(duì)于碳水化合物發(fā)酵的結(jié)果，將所得數(shù)據(jù)輸入apilabplus軟件進(jìn)行鑒定。api檢測結(jié)果見表1。lcc-605能夠利用多種碳源，如葡萄糖、半乳糖、木糖、赤蘚糖醇、蔗糖、鼠李糖等。

表1api實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(2)胞外多糖制備

取實(shí)施例1中得到的產(chǎn)胞外多糖的植物乳桿菌lcc-605的菌體樣本，用mrs養(yǎng)液活化三次，4℃，14000g離心30min，以去除菌體。離心后將上層清液倒入燒杯，剩下的菌體再次離心一次，上層清液再次倒入燒杯。然后在燒杯里倒入80％的三氯乙酸，直至三氯乙酸終濃度為4％，放入4℃冰箱過夜，沉淀蛋白。隔天，將燒杯里的溶液再次離心，以分離沉淀的蛋白質(zhì)。去除沉淀，倒出上層清液，再加入三倍體積的無水乙醇，放入4℃冰箱過夜，以沉淀胞外多糖。隔天，將溶液離心，多糖沉淀。將多糖取出并加少量超純水溶解，裝入透析袋中，放入大燒杯使其透析三天，每4h換一次水，以去除其中的單糖。三天后，置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，即得產(chǎn)胞外多糖的植物乳桿菌lcc-605的胞外多糖。

(3)lcc-605掃描電鏡結(jié)果可以看出乳酸菌為短桿狀且分泌出呈球形的胞外多糖顆粒(圖2)。

實(shí)施例3重金屬吸附能力的檢測：

(1)不同碳源對(duì)生物吸附效果的影響

為了探究使得乳酸菌胞外多糖產(chǎn)生最好的生物吸附效果的碳源，使用含有不同碳源mrs培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。用不含碳源和分別含葡萄糖、甘露糖、蔗糖、乳糖的mrs培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌，發(fā)酵、提取胞外多糖后，將這六種多糖分別配置成0.8mg/ml的溶液，分成18份，裝入透析袋中。配置10mg/l的硝酸鉛、硝酸鎘和硝酸銅溶液各6份，將6個(gè)不同碳源培養(yǎng)的胞外多糖透析袋分別裝入3種離子溶液中，靜置24h后對(duì)離子溶液取樣進(jìn)行金屬離子濃度檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，以葡萄糖為碳源產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)pb²⁺的吸附能力最強(qiáng)。

(2)吸附時(shí)間對(duì)生物吸附作用的影響

配制10mg/l的硝酸鉛、硝酸鎘、硝酸銅溶液，倒入9個(gè)燒杯中。將乳酸菌包外多糖樣品用去離子水配成0.8mg/ml的溶液，裝入9個(gè)透析袋中，分別放入9個(gè)燒杯使其開始生物吸附作用。每隔0、4、8、12、24、28、48h各取一次重金屬離子溶液的樣品進(jìn)行濃度檢測，結(jié)果如圖4所示，對(duì)cd²⁺和cu²⁺的吸附到12h幾乎達(dá)到穩(wěn)定，對(duì)pb²⁺的吸附24h幾乎達(dá)到穩(wěn)定。

(3)ph對(duì)生物吸附作用的影響

配制10mg/l的硝酸鉛、硝酸鎘、硝酸銅溶液，倒入10個(gè)燒杯中，將ph調(diào)成3、5、7、9和11。每組兩個(gè)平行。將乳酸菌胞外多糖樣品用去離子水配成0.8mg/ml的溶液，裝入10個(gè)透析袋中，分別放入10個(gè)燒杯使其開始生物吸附作用。吸附24h后取重金屬離子溶液的樣品進(jìn)行濃度檢測。結(jié)果如圖5，pb²⁺在ph5-11范圍內(nèi)吸附量最高。

(4)溫度對(duì)生物吸附作用的影響

配制10mg/l的硝酸鉛、硝酸鎘、硝酸銅溶液。將乳酸菌包外多糖樣品用去離子水配成0.8mg/ml的溶液，裝入透析袋中，分別放入燒杯分別在25、28、31、34和37℃進(jìn)行生物吸附作用。24h后取重金屬離子溶液的樣品進(jìn)行濃度檢測。結(jié)果如圖6所示，溫度對(duì)重金屬離子的吸附影響不大。

實(shí)施例4亞甲基藍(lán)吸附能力檢測。

將亞甲基藍(lán)配成20mg/l的溶液，取50ml置于小燒杯中；將實(shí)施例2中制備得到的胞外多糖配成0.8mg/ml，取5ml放于7kda的透析袋中，將其放入到含有甲基藍(lán)溶液的小燒杯中于25℃靜止24h，每隔2h取一次樣，測定溶液中剩余的甲基藍(lán)含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7和8，eps吸附后溶液中亞甲基藍(lán)的顏色明顯減弱，吸附在12h時(shí)幾乎達(dá)到穩(wěn)定。