本發(fā)明涉及熒光傳感材料制備及化學分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及具有識別和檢測苯硫酚功能的一種長波型的苯硫酚熒光探針及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

PhSH(苯硫酚)是一種高毒性的環(huán)境污染物，廣泛存在于制藥、農(nóng)藥和化工環(huán)境中，例如在局部麻醉劑、有機磷農(nóng)藥和高分子樹脂硫化劑等的合成中。低濃度的PhSH對皮膚、眼睛、粘膜有較強的刺激作用，可引起喉和支氣管痙攣、肌無力及化學性肺炎，高濃度時，能麻痹中樞神經(jīng)或?qū)е路嗡[而死亡。因此，對環(huán)境或生物體內(nèi)PhSH的檢測具有重要的意義。PhSH的檢測有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、紫外分光光度法和熒光探針分析法等，其中熒光探針分析法由于具有高靈敏度、高選擇性和操作的簡單、快速及破壞性小等優(yōu)點而受到關(guān)注。

一個性能優(yōu)良的PhSH熒光探針，首先應(yīng)該具有較長的熒光發(fā)射波長，這樣可以有效的避免環(huán)境或生物樣品中短波長的熒光物質(zhì)背景熒光的干擾，提高組織穿透力和減少對樣品的光損傷。另外，目前對PhSH的檢測主要是利用其親核性，而環(huán)境或生物樣品中的小分子巰基物質(zhì)如硫化氫(H₂S)、半胱氨酸(Cys)，谷胱甘肽(GSH)等都具有與苯硫酚類似的性質(zhì)，是可能的干擾物種，因此，苯硫酚熒光探針的設(shè)計應(yīng)該考慮到選擇性和抗干擾性問題，再者，PhSH是一種易揮發(fā)性的物質(zhì)，其濃度的變化受環(huán)境因素或測試條件影響較大，這就要求探針對苯硫酚有快速的熒光響應(yīng)信號，保證檢測具有高時效性。

綜合分析當前檢測PhSH的熒光探針，不足之處是絕大多數(shù)都是在短波長區(qū)(λ_em＜600nm)進行識別和檢測，即使有極少數(shù)長波型PhSH熒光探針，又存在選擇性差或響應(yīng)慢等某方面的不足，即很難兼具長波發(fā)射、高選擇性和快速響應(yīng)等綜合性能。因此設(shè)計和開發(fā)具有長波型、高選擇性和快速響應(yīng)等綜合性能的PhSH熒光探針具有極其重要的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對目前小分子熒光探針在檢測PhSH過程中所面臨的主要問題，通過合理的分子設(shè)計，制備出具有長波發(fā)射(λ_em﹥650nm)、高選擇性和快速響應(yīng)等性能的苯硫酚熒光探針，并提供其制備方法及應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過如下方式實現(xiàn)的：

一種長波型的苯硫酚熒光探針，分子式為：C₅₀H₃₃N₇O₆S，簡稱TPP-DNBS，結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示：

上述的長波型的苯硫酚熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)冰浴冷卻下，往無水吡啶中依次加入氨基卟啉和2,4-二硝基苯磺酰氯，攪拌溶解后，氮氣保護下室溫攪拌反應(yīng)6～8h，TLC跟蹤至反應(yīng)完成；

(2)將步驟(1)所得反應(yīng)液倒入蒸餾水中，過濾，濾餅用蒸餾水洗滌，得紫色固體；將紫色固體溶于二氯甲烷，再用蒸餾水洗滌2～5次，分液得有機層，有機層再經(jīng)無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑，硅膠柱色譜純化，真空干燥，得到TPP-DNBS，即目標探針化合物。

進一步地，氨基卟啉與2,4-二硝基苯磺酰氯的物質(zhì)的量之比優(yōu)選2～3：3～5。

本發(fā)明苯硫酚探針的用途：該熒光探針可用于水環(huán)境和生物樣品中苯硫酚含量的熒光傳感檢測，所述的熒光傳感檢測包括熒光檢測，目視定性檢測和細胞成像檢測。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明制備的熒光探針，具有長的熒光發(fā)射波長(λ_em﹥650nm)，有利于避免短波長背景熒光的干擾，提高組織穿透力和減少樣品的光損傷；

(2)本發(fā)明制備的熒光探針，具有極高的選擇性和抗干擾能力；

(3)本發(fā)明制備的熒光探針，可實現(xiàn)對苯硫酚的快速識別和檢測。

附圖說明

圖1為熒光探針對PhSH的識別機理示意圖。

圖2為PhSH熒光探針的質(zhì)譜圖。

圖3為時間對探針與PhSH反應(yīng)體系熒光影響的關(guān)系圖。

溶劑體系為THF(四氫呋喃):H₂O＝1:1(體積比v/v)，pH為7.4(20m mol·L^-1的HEPES緩沖溶液)，探針濃度為5μmol·L^-1，PhSH濃度為50μmol·L^-1，λ_ex＝431nm，λ_em＝658nm，F(xiàn)/F₀為探針與PhSH反應(yīng)后體系在λ_em＝658nm處不同時刻的熒光強度(F)與同一條件下不加PhSH的空白熒光強度(F₀)的比值。

圖4為探針與不同濃度的PhSH反應(yīng)后的熒光發(fā)射光譜圖：

溶劑體系為THF:H₂O＝1:1(v/v)，pH為7.4(20m mol·L^-1的HEPES緩沖溶液)，探針濃度為5μmol·L^-1，PhSH濃度(μmol·L^-1)依次為：0，0.5，1.0，1.5，2.0，5.0，10，20，30，40，50，60，80，100，150，200，300，400，500。λ_ex＝431nm，λ_em＝658nm，反應(yīng)時間為90s。

圖5為探針與PhSH反應(yīng)體系在λ_em＝658nm處的熒光強度與PhSH濃度的關(guān)系圖：

溶劑體系為THF:H₂O＝1:1(v/v)，pH為7.4(20m mol·L^-1的HEPES緩沖溶液)，探針濃度為5μmol·L^-1，反應(yīng)時間為90s，F(xiàn)/F₀為探針與不同濃度的PhSH(PhSH濃度/μmol·L^-1分別為：0，0.5，1.0，1.5，2.0，5.0，10，20，30，40，50，60，80，100，150，200，300，400，500μmol·L^-1)反應(yīng)后體系在λ_em＝658nm處的熒光強度(F)與同一條件下不加PhSH的空白的熒光強度(F₀)的比值。插入圖：探針與PhSH反應(yīng)后體系的熒光強度與PhSH濃度的線性擬合圖。

圖6為探針與PhSH、H₂S，巰基或陰離子等物種反應(yīng)后體系的熒光光譜圖：

溶劑體系為THF:H₂O＝1:1(v/v)，pH為7.4(20m mol·L^-1的HEPES緩沖溶液)，探針濃度為5μmol·L^-1，PhSH濃度為50μmol·L^-1，H₂S、巰基或陰離子等濃度為500μmol·L^-1，反應(yīng)時間為90s。

圖7為探針和PhSH分別在不同巰基物種或陰離子共存條件下反應(yīng)后在λ_em＝658處的熒光強度的柱狀圖：

溶劑體系為THF:H₂O＝1:1(v/v)，pH為7.4(20m mol·L^-1的HEPES緩沖溶液)，探針濃度為5μmol·L^-1，PhSH濃度為50μmol·L^-1，硫化氫、巰基或陰離子等濃度為500μmol·L^-1，反應(yīng)時間為90s，1～23依次為：PhSH、PhSH+GSH、PhSH+Cys、PhSH+Hcy、PhSH+HS^-、PhSH+HPO₄^2-、PhSH+Ala、PhSH+Gly、PhSH+F^-、PhSH+Cl^-、PhSH+Br^-、PhSH+I^-、PhSH+CO₃^2-、PhSH+NO₂^-、PhSH+NO₃^-、PhSH+Ac^-、PhSH+SCN^-、PhSH+SO₃^2-、PhSH+SO₄^2-、PhSH+S₂O₃^2-、PhSH+O₂^2-、PhSH+PhNH₂、PhSH+PhOH。F/F₀為探針與PhSH、硫化氫，巰基或陰離子等物種反應(yīng)后體系在λ_em＝658nm處的熒光強度(F)與同一條件下空白的熒光強度(F₀)的比值。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

實施例1

一種長波型的苯硫酚熒光探針的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)冰浴冷卻下，往15mL無水吡啶中依次加入172mg(0.2mmol)氨基卟啉，80mg(0.3mmol)2,4-二硝基苯磺酰氯，攪拌溶解后，氮氣保護，室溫攪拌反應(yīng)6～8h，TLC跟蹤至反應(yīng)完成。

(2)將上述反應(yīng)液倒入150mL蒸餾水中，過濾，濾餅用蒸餾水洗滌，得紫色固體；將紫色固體溶于20mL二氯甲烷，再用蒸餾水洗滌3次(20mL蒸餾水/次)，分液得有機層，有機層再經(jīng)無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑，硅膠柱色譜純化，真空干燥即得目標探針化合物(TPP-DNBS)。

實施例2

一種長波型的苯硫酚熒光探針的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)冰浴冷卻下，往20mL無水吡啶中依次加入0.3mmol氨基卟啉，0.4mmol 2,4-二硝基苯磺酰氯，攪拌溶解后，氮氣保護，室溫攪拌反應(yīng)6～8h，TLC跟蹤至反應(yīng)完成。

(2)將上述反應(yīng)液倒入200mL蒸餾水中，過濾，濾餅用蒸餾水洗滌，得紫色固體；將紫色固體溶于25mL二氯甲烷，再用蒸餾水洗滌2次(20mL蒸餾水/次)，分液得有機層，有機層再經(jīng)無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑，硅膠柱色譜純化，真空干燥即得目標探針化合物(TPP-DNBS)。

實施例3

一種長波型的苯硫酚熒光探針的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)冰浴冷卻下，往30mL無水吡啶中依次加入0.3mmol氨基卟啉，0.5mmol 2,4-二硝基苯磺酰氯，攪拌溶解后，氮氣保護，室溫攪拌反應(yīng)6～8h，TLC跟蹤至反應(yīng)完成。

(2)將上述反應(yīng)液倒入300mL蒸餾水中，過濾，濾餅用蒸餾水洗滌，得紫色固體；將紫色固體溶于30mL二氯甲烷，再用蒸餾水洗滌5次(20mL蒸餾水/次)，分液得有機層，有機層再經(jīng)無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑，硅膠柱色譜純化，真空干燥即得目標探針化合物(TPP-DNBS)。

值得說明的是，以下實施例4至7采用的探針均指實施例1所得或者按照與實施例1完全相同的方法所得產(chǎn)品。

實施例4

反應(yīng)時間對熒光強度的影響。

(1)往10ml容量瓶中依次加入5.0mL的四氫呋喃(THF)，1.0mmol·L^-1的探針溶液50μL，0.2mol·L^-1的pH值為7.4的HEPES緩沖溶液1.0mL，用二次蒸餾水稀釋至10mL，得到標準測試液，此時探針濃度為5μmol·L^-1。

(2)取3.0mL標準測試液加入4mL比色皿中，再加入50μmol·L^-1的PhSH，迅速搖勻，在λ_ex＝431nm激發(fā)下測得反應(yīng)體系在不同時刻的熒光光譜，再根據(jù)熒光光譜計算出最大發(fā)射波長λ_em＝658nm處不同時刻的F/F₀，以F/F₀對反應(yīng)時間(s)作圖，得到反應(yīng)時間對熒光強度影響的關(guān)系圖，結(jié)果如圖3。由圖3可知，在最大發(fā)射波長λ_em＝658nm處，PhSH與探針反應(yīng)體系的熒光強度在短短的30s內(nèi)顯著增強，在90s時就幾乎反應(yīng)完全，達到熒光最大值，可見，探針能對PhSH產(chǎn)生極其快速的熒光增強響應(yīng)，即具有高時效性。

實施例5

探針對苯硫酚的檢測。

(1)取3.0mL標準測試液加入4mL比色皿中，逐漸加入PhSH，使其濃度依次為0，0.5，1.0，1.5，2.0，5.0，10，20，30，40，50，60，80，100，150，200，300，400，500μmol·L^-1。常溫下攪拌反應(yīng)90s后，在激發(fā)波長為λ_ex＝431nm分別測得探針與PhSH反應(yīng)體系的熒光光譜，同時準備不加PhSH的空白作為對照，在相同條件下測得其熒光光譜(圖4)。由圖4可知，探針反應(yīng)體系具有很長的發(fā)射波長為(λ_em＝658nm)，且探針本身的熒光強度很低，加入PhSH后，體系的熒光強度明顯增強，且隨著PhSH濃度的增大，熒光強度不斷增強，說明探針對PhSH有很強的熒光增強響應(yīng)性。

(2)為了進一步考察探針對苯硫酚檢測的定量性能，以F/F₀為縱坐標，PhSH濃度(μmol·L^-1)為橫坐標得到熒光強度(F/F₀)與PhSH濃度的關(guān)系圖(圖5)。圖5說明了探針與PhSH反應(yīng)體系在λ_em＝658的熒光強度隨PhSH濃度的增大而明顯增強，當探針反應(yīng)完全后，再加入PhSH后熒光強度不再增強，其插入圖表明探針反應(yīng)體系的熒光強度與PhSH的濃度(0～20μmol·L^-1)有很好的線性相關(guān)性，線性方程為F/F₀＝0.2064c(μmol·L^-1)+1.1530(R²＝0.9946，n＝8),通過對檢測限的計算，得到檢測限為12nM(3σ/k)。以上結(jié)果表明探針可以實現(xiàn)對微量PhSH高靈敏度的定量檢測。

實施例6

探針對苯硫酚的選擇性實驗。

往盛有3.0ml標準測試液的4ml比色皿中，分別加入PhSH(50μmol·L^-1)硫化氫、巰基物種或陰離子等相關(guān)物種(500μmol·L^-1)：HS^-、GSH、Cys、Hcy、HPO₄^2-、Ala、Gly、F^-、Cl^-、Br^-、I^-、CO₃^2-、NO₂^-、NO₃^-、Ac^-、SCN^-、SO₃^2-、SO₄^2-、S₂O₃^2-、O₂^2-、PhNH₂、PhOH，常溫下反應(yīng)90s后測得λ_ex＝431nm激發(fā)下的熒光光譜(圖6)。不難看出，探針只對PhSH有顯著的熒光增強響應(yīng)，而對即使高于PhSH濃度10倍量的硫化氫、巰基物種或陰離子等物種幾乎沒有熒光增強響應(yīng)，可見，探針對苯硫酚的檢測具有很高的選擇性。

實施例7

探針對苯硫酚檢測的抗干擾性實驗。

往盛有3ml標準測試液的4ml比色皿中，加入50μmol·L^-1的PhSH和一種500μmol·L^-1的相關(guān)共存物種，苯硫酚+共存物種序號從1到23分別為：PhSH、PhSH+GSH、PhSH+Cys、PhSH+Hcy、PhSH+HS^-、PhSH+HPO₄^2-、PhSH+Ala、PhSH+Gly、PhSH+F^-、PhSH+Cl^-、PhSH+Br^-、PhSH+I^-、PhSH+CO₃^2-、PhSH+NO₂^-、PhSH+NO₃^-、PhSH+Ac^-、PhSH+SCN^-、PhSH+SO₃^2-、PhSH+SO₄^2-、PhSH+S₂O₃^2-、PhSH+O₂^2-、PhSH+PhNH₂、PhSH+PhOH。常溫反應(yīng)90s后，測其熒光光譜(λ_ex＝431nm，λ_em＝658nm)，記錄最大發(fā)射波長λ_ex＝658nm處的熒光強度F，同時以一個不加苯硫酚和共存物種的探針溶液做為空白對照，相同條件下測其熒光強度F₀，以F/F₀為縱坐標，苯硫酚+共存物種序號為橫坐標，得到不同的物種與苯硫酚共存時對反應(yīng)體系熒光強度的影響的柱狀圖。結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，當硫化氫、巰基物種或陰離子等物種與苯硫酚共存時對探針與苯硫酚反應(yīng)體系的熒光強度幾乎沒有影響，說明探針對苯硫酚的檢測具有很高的抗干擾性。

上述實施例僅用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明所作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。