本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
干細胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞，在一定條件下，可以分化成多種功能細胞。頭發(fā)毛囊中含有大量干細胞，是最容易獲得的干細胞來源之一。毛囊干細胞是一類存在于毛囊外根鞘隆突部的干細胞，具有未分化性、自我更新和體外增殖能力強等特點。體外培養(yǎng)研究中的毛囊干細胞表現(xiàn)出高克隆形成能力，具有很高的再生潛能。由于毛囊干細胞來源于毛發(fā)，可以直接從人體自身取得，數(shù)量極其豐富，且沒有任何并發(fā)癥，對人完全無創(chuàng)，現(xiàn)已成為皮膚組織工程學(xué)研究的焦點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基及其制備方法，采用該無血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)時，毛囊干細胞大量快速增長，且生長穩(wěn)定，純度高，且該無血清培養(yǎng)基的制備方法簡單，保留了培養(yǎng)基中各組分的有效活性。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基，由低糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份組成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物5-10％ (v/v)
胎球蛋白 0.1-5mg/ml
維生素C 35-80ng/ml
L-谷氨酰胺1.5-5mmol/ml
表皮生長因子1-20ng/ml
葡萄糖 5-15μM
2-巰基乙醇25-120μM
青鏈霉素雙抗溶液2-15μM。
胎球蛋白，發(fā)現(xiàn)于胎牛血清，兩條肽鏈自同一前體切割產(chǎn)生并以一對二硫鍵相連，含量占總蛋白質(zhì)的45%，等電點較低，含糖量達35%，有3條寡糖鏈，由分子質(zhì)量不等的糖蛋白組成，具有細胞所需的生長因子，促進細胞胞吞等功能。
維生素C是大部分生物的必需營養(yǎng)，是一種抗氧化劑，保護細胞組織免于自由基的威脅。
L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時起到很重要的作用。脫掉氨基后，L- 谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝；在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。
表皮生長因子是一種小肽，由53 個氨基酸殘基組成，是一種多功能的生長因子，在體內(nèi)體外都對多種組織細胞有強烈的促分裂作用。
葡萄糖是活細胞的能量來源和新陳代謝中間產(chǎn)物，即生物的主要供能物質(zhì)。
2- 巰基乙醇是一種有機化合物，其化學(xué)式為HOCH2CH2SH，它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能團，通常用于二硫鍵的還原，保護二硫鍵，從而使蛋白質(zhì)不被氧化掉而失活。
青鏈霉素雙抗溶液用于抑制細菌增長，為干細胞提供無菌的生長環(huán)境。
本發(fā)明的毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基的有益效果在于：青鏈霉素雙抗溶液抑制了培養(yǎng)基內(nèi)的細菌增長，為毛囊干細胞提供無菌的生長環(huán)境；維生素C和2-巰基乙醇構(gòu)建了一個良好的毛囊干細胞分裂環(huán)境，防止毛囊干細胞在生長的過程中干細胞的組分被氧化而失掉活性；表皮生長因子促進了的毛囊干細胞分裂生長，胎球蛋白、維生素C、L-谷氨酰胺及葡萄糖為毛囊干細胞的生長提供足夠的能量，使新生的細胞具有活性；采用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)毛囊干細胞，毛囊干細胞可快速增長，且生長穩(wěn)定，純度高。
優(yōu)選的，添加成份及其含量如下：
血清替代物6-10％ (v/v)
胎球蛋白 0.5-5mg/ml
維生素C 40-80ng/ml
L-谷氨酰胺1.5-5mmol/ml
表皮生長因子5-20ng/ml
葡萄糖 8-15μM
2-巰基乙醇50-120μM
青鏈霉素雙抗溶液5-15μM。
優(yōu)選的，添加成份及其含量如下：
血清替代物6％ (v/v)
胎球蛋白 0.5mg/ml
維生素C 40ng/ml
L-谷氨酰胺2mmol/ml
表皮生長因子5ng/ml
葡萄糖 8μM
2-巰基乙醇50μM
青鏈霉素雙抗溶液5μM。
優(yōu)選的，添加成份及其含量如下：
血清替代物8％ (v/v)
胎球蛋白 3mg/ml
維生素C 70ng/ml
L-谷氨酰胺4mmol/ml
表皮生長因子15ng/ml
葡萄糖 12μM
2-巰基乙醇100μM
青鏈霉素雙抗溶液10μM。
一種毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：在無菌超凈工作臺中，取適量低糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按上述成份含量加入血清替代物、胎球蛋白、維生素C、L-谷氨酰胺、表皮生長因子、葡萄糖、2-巰基乙醇及青鏈霉素雙抗溶液，吹打混勻，過濾除菌即獲得毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基。
優(yōu)選的，過濾除菌為采用0.1～0.22μm孔徑的微孔濾膜正壓過濾除菌，采取正壓過濾，正壓過濾較之負壓過濾具有流速高、過濾快、不易污染的特點，避免胎球蛋白產(chǎn)生大量氣泡及避免L-谷氨酰胺失去有效性。
具體實施方式
為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進行更全面的描述。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。
除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。
實施例1
本實施例的一種毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基，由低糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份組成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物5％ (v/v)
胎球蛋白 0.1mg/ml
維生素C 35ng/ml
L-谷氨酰胺1.5mmol/ml
表皮生長因子1ng/ml
葡萄糖 5μM
2-巰基乙醇25μM
青鏈霉素雙抗溶液2μM。
實施例2
本實施例的一種毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基，由低糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份組成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物6％ (v/v)
胎球蛋白 0.5mg/ml
維生素C 40ng/ml
L-谷氨酰胺2mmol/ml
表皮生長因子5ng/ml
葡萄糖 8μM
2-巰基乙醇50μM
青鏈霉素雙抗溶液5μM。
實施例3
本實施例的一種毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基，由低糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份組成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物7％ (v/v)
胎球蛋白1mg/ml
維生素C50ng/ml
L-谷氨酰胺3mmol/ml
表皮生長因子10ng/ml
葡萄糖10μM
2-巰基乙醇80μM
青鏈霉素雙抗溶液8μM。
實施例4
本實施例的一種毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基，由低糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份組成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物8％ (v/v)
胎球蛋白 3mg/ml
維生素C 70ng/ml
L-谷氨酰胺4mmol/ml
表皮生長因子15ng/ml
葡萄糖 12μM
2-巰基乙醇100μM
青鏈霉素雙抗溶液10μM。
實施例5
本實施例的一種毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基，由低糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份組成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物10％ (v/v)
胎球蛋白 5mg/ml
維生素C 80ng/ml
L-谷氨酰胺5mmol/ml
表皮生長因子20ng/ml
葡萄糖15μM
2-巰基乙醇120μM
青鏈霉素雙抗溶液15μM。
制備方法
實施例1至5的毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：在無菌超凈工作臺中，取適量低糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別按實施例1至5所述的成份含量加入血清替代物、胎球蛋白、維生素C、L-谷氨酰胺、表皮生長因子、葡萄糖、2-巰基乙醇及青鏈霉素雙抗溶液，吹打混勻，采用0.22μm孔徑的微孔濾膜正壓過濾除菌即獲得毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基。
對照試驗
取適量人體毛發(fā)，在室溫下，用消化液消化，待成纖維細胞脫落后，洗掉成纖維細胞，獲得毛囊干細胞群，將毛囊干細胞群置于37°培養(yǎng)瓶，加入實施例1至5的一種毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基，以后每24小時更換培養(yǎng)液一次，使毛囊干細胞群獲得足夠養(yǎng)分充分生長，傳代五代，在培養(yǎng)瓶中加0.25％胰酶-EDTA進行消化獲得培養(yǎng)后的毛囊干細胞。
以普通一種毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基采用上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)毛囊干細胞，并與采用實施例1至5毛囊干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛囊干細胞進行對照，結(jié)果如表1。
表1普通毛囊干細胞無血清培養(yǎng)基與實施例1至5毛囊干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛囊干細胞進行對照
細胞形態(tài)鑒定
用溴化丙錠染細胞核，方法如下：細胞貼壁1小時后，用質(zhì)量百分比為4％的多聚甲醛固定15分鐘；然后用磷酸緩沖液洗兩遍；10微克/毫升的溴化丙錠在室溫22℃左右染核15分鐘；用磷酸緩沖液洗三遍。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛囊干細胞核質(zhì)比很大，則細胞核在細胞中所占的比例很大，生長良好。
由上述對照試驗及細胞形態(tài)鑒定可知，實施例1至5毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基得到的毛囊干細胞比普通無血清培養(yǎng)基得到的毛囊干細胞生長速度快，增殖能力強，且純度高，采用本發(fā)明的毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基制備方法獲得的培養(yǎng)基保留了各成份的活性，使培養(yǎng)基的作用發(fā)揮到最佳。
最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細地說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。