本發(fā)明涉及毒性檢測(cè)，具體是一種a-氰基丙烯酸酯細(xì)胞毒性檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

無(wú)張力疝修補(bǔ)成為目前臨床上疝修補(bǔ)的主要術(shù)式，故對(duì)疝補(bǔ)片的固定方式成為臨床探討的熱點(diǎn)。有多種將疝補(bǔ)片固定于腹壁的方式：如疝釘、縫線和醫(yī)用粘合劑等。多篇文獻(xiàn)報(bào)道：以疝釘或縫線等傷及組織的固定方式會(huì)引起術(shù)中、術(shù)后出血且疝修補(bǔ)術(shù)后慢性疼痛亦與此種固定方式有關(guān)。其中文獻(xiàn)的研究顯示：使用疝釘?shù)臄?shù)目（大于 6 枚）與術(shù)后痛的發(fā)生率有關(guān)。而以使用纖維蛋白膠為代表的醫(yī)用膠固定疝補(bǔ)片的方式正逐漸為外科醫(yī)生所接受。以醫(yī)用膠固定補(bǔ)片是一種無(wú)創(chuàng)的、有效的固定方式。使用醫(yī)用膠固定疝補(bǔ)片不必?fù)?dān)心固定時(shí)會(huì)損傷血管、神經(jīng)。且醫(yī)用膠會(huì)逐漸被機(jī)體分解、吸收，不必?fù)?dān)心殘留。理想的醫(yī)用膠粘劑應(yīng)該滿足以下要求：①安全、可靠、無(wú)毒性、無(wú)三致(致癌、致畸、致突變)；②具有良好的生物相容性，不妨礙人體組織的自身愈合；③無(wú)菌且可在一定時(shí)期內(nèi)保持無(wú)菌；④在有血液和組織液的條件下可以使用；⑤在常溫、常壓下可以實(shí)現(xiàn)快速粘合；⑥具有良好的粘合強(qiáng)度及持久性，粘合部分具有一定的彈性和韌性；⑦在使用過(guò)程中對(duì)人體組織無(wú)刺激性；⑧達(dá)到使用效果后能夠逐漸降解、吸收、代謝；⑨具有良好的使用狀態(tài)并易于保存。a-氰基丙烯酸酯膠粘劑是目前應(yīng)用較廣的醫(yī)用膠，單體呈液體狀。在人體內(nèi)當(dāng)遇到微量陰離子物質(zhì)（如人體內(nèi)的血液、水、創(chuàng)面滲出的組織液）或有機(jī)胺類，室溫下其即可與生物體組織迅速發(fā)生聚合反應(yīng)，固化成膜并與創(chuàng)面緊密鑲嵌。電鏡下掃描示其固化膜成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)能有效阻止紅細(xì)胞和血小板通過(guò)，在凝血酶和纖維蛋白原的共同作用下達(dá)到有效止血、封閉創(chuàng)面、硬組織粘合和堵塞血管的作用。同時(shí)，該結(jié)構(gòu)還能將組織和細(xì)菌隔離，具有保護(hù)創(chuàng)面作用。在小梁切除術(shù)中，用a-氰基丙烯酸正辛酷代替手術(shù)縫線后，短期內(nèi)粘合力比縫線的點(diǎn)縫合更牢固匯，而且與縫合比較，不僅操作簡(jiǎn)單，縮短了手術(shù)時(shí)間，還消除了由于鞏膜縫線張力引起的術(shù)后循規(guī)性散光。眼燒傷治療中粘合羊膜手術(shù)時(shí)，因燒傷眼皮表面高度充血水腫甚至出現(xiàn)缺血壞死，導(dǎo)致縫線操作困難，而用膠粘劑就可以解決這一困難，達(dá)到防止羊膜早期脫落，迅速恢復(fù)眼表完整性的效果，對(duì)防止多種并發(fā)癥的發(fā)生有很大的作用。腹腔鏡手術(shù)尾期用a-氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠來(lái)修補(bǔ)手術(shù)戳孔比手術(shù)縫線更迅速有效，降低了術(shù)后并發(fā)癥機(jī)率。另外，由于a-氰基丙烯酸酯膠粘劑本身有抑菌功能，且固化速度快，因此在粘接固定時(shí)還有抑制感染，及時(shí)封閉感染入口，加速傷口愈合的優(yōu)點(diǎn)有人在幾丁質(zhì)室修復(fù)兔顆骨內(nèi)面神經(jīng)缺損中應(yīng)用a一氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠固定顳骨內(nèi)面神經(jīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此方法不易引起幾丁質(zhì)管豁裂，局部無(wú)感染，神經(jīng)斷端不易從幾丁質(zhì)室脫出，簡(jiǎn)便、省時(shí)、神經(jīng)再生質(zhì)量高。愕裂修復(fù)術(shù)中用a-氰基丙烯酸酯膠粘貼代替?zhèn)鹘y(tǒng)的碘仿紗條填塞，不需要抽出松弛切口內(nèi)填塞的碘仿紗條，從而避免引起繼發(fā)性出血，達(dá)到減少?gòu)埩碗癜旰笸耍乐故澄锴度?，減少感染的發(fā)生的目的。

但是，研究認(rèn)為此膠粘劑存在抗沖擊性能差、粘度低、體內(nèi)降解時(shí)間快等缺陷，因此其應(yīng)用范圍受到限制。但是a-氰基丙烯酸酯固化時(shí)產(chǎn)生的聚合熱僅為2.1J，因而對(duì)局部組織的刺激很小。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，a-氰基丙烯酸酯膠粘劑屬無(wú)毒級(jí)，致癌、致畸及致突變實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌培養(yǎng)均為陰性。成人急性毒性試驗(yàn)結(jié)果為:LD50>13 g/kg，屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)；無(wú)致癌、致畸性；另外，它還能在體內(nèi)分解、排泄，無(wú)毒性累積。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)a-氰基丙烯酸正辛酯在粘接聽(tīng)骨鏈時(shí)，雖無(wú)組織毒性的表現(xiàn)，但會(huì)引起輕度的異物反應(yīng)。還有研究發(fā)現(xiàn)，a-氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠用于神經(jīng)組織時(shí)，可致神經(jīng)元壞死，神經(jīng)纖維斷裂和脫髓鞘。據(jù)推測(cè)是因?yàn)閍-氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠涂抹于坐骨神經(jīng)后，使部分神經(jīng)纖維損傷，激活Schwann細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞，并且a-氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠作為外源性物質(zhì)可使T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞等聚集。

在疝修補(bǔ)應(yīng)用上，國(guó)內(nèi)外的許多學(xué)者都相繼報(bào)道了在開(kāi)放式疝修補(bǔ)術(shù)或腹腔鏡疝修補(bǔ)術(shù)中使用纖維蛋白膠（Fibrin sealant）的情況。在這些報(bào)道中纖維蛋白膠獲得了大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可。亦有多篇文獻(xiàn)報(bào)道使用合成醫(yī)用膠固定疝補(bǔ)片。Jain 等人的研究認(rèn)為：明膠—間二苯—甲醛膠固定組與縫線固定組相比，在術(shù)后痛方面膠固定組明顯優(yōu)于縫線組。膠固定不僅可降低術(shù)后痛發(fā)生率還可以使手術(shù)醫(yī)生在固定疝補(bǔ)片時(shí)不必如使用疝釘固定時(shí)那樣需仔細(xì)辨認(rèn)結(jié)構(gòu)，避免損傷腹壁下血管、髂血管、神經(jīng)。手術(shù)醫(yī)生可以從容固定補(bǔ)片。Jourdan 等介紹了將 n-丁基-2 氰基丙烯酸合成膠應(yīng)用于腹腔鏡疝修補(bǔ)術(shù)的成功經(jīng)驗(yàn)。與其他修補(bǔ)不同的是，疝補(bǔ)片為異物，故粘合劑生物相容性十分重要。雖然 Fortelny 等人報(bào)道：在大鼠腹壁疝模型上使用一種名為氰基丙烯酸鹽（Glubran-Ⅱ）醫(yī)用膠會(huì)損害補(bǔ)片與腹壁的融合。但其研究結(jié)果表明，此種醫(yī)用膠術(shù)后 3 個(gè)月仍未降解且其殘留物影響組織侵潤(rùn)而這就是（Glubran-Ⅱ）醫(yī)用膠固定失敗的原因。由于疝補(bǔ)片植入機(jī)體后會(huì)皺縮，從而導(dǎo)致疝修補(bǔ)術(shù)的失敗同時(shí)。而引起補(bǔ)片皺縮與炎癥反應(yīng)有關(guān)，也與粘合劑的相容性息息相關(guān)。而a-氰基丙烯酸酯作為疝修補(bǔ)粘合劑組織生物相容性和細(xì)胞毒性鮮有研究，本發(fā)明通過(guò)體外以及動(dòng)物研究，探討a-氰基丙烯酸酯作為疝修補(bǔ)粘合劑組織生物相容性和細(xì)胞毒性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種a-氰基丙烯酸酯細(xì)胞毒性檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種a-氰基丙烯酸酯細(xì)胞毒性檢測(cè)方法，主要包括a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性體外實(shí)驗(yàn)、a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及聚丙烯補(bǔ)片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進(jìn)行固定效果實(shí)驗(yàn)，其中a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性體外實(shí)驗(yàn)主要包括以下步驟：

1、取真皮層成纖維細(xì)胞和間皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)；

2、在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)（每月2日、4日、7日、10日、14日、21日、28日的0時(shí)、6時(shí)和24時(shí)）取步驟1中的樣本進(jìn)行依次進(jìn)行洗滌、分散、再洗滌、離心；

3、取步驟2中的懸濁液并加入10ml的a-氰基丙烯酸酯膠和6ml 的PBS混合液后繼續(xù)播種到培養(yǎng)基上并在37°C環(huán)境的密封內(nèi)孵化5 h后進(jìn)行進(jìn)行染色處理，同時(shí)在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞數(shù)，同時(shí)在a-氰基丙烯酸酯膠與PBS混合液混合時(shí)進(jìn)行甲醛測(cè)定。

所述的細(xì)胞毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要包括以下步驟：

1、取新西蘭兔人為造成腹部缺陷，包括腹前壁(右和左側(cè)面)內(nèi)部和外部斜肌和橫向肌肉，腹橫筋以及腹膜壁層，并均分為觀察組以及對(duì)照組；

2、將觀察組采用a-氰基丙烯酸酯膠粘劑處理固定，將對(duì)照組采用縫合處理；

3、將觀察組以及對(duì)照組的在培養(yǎng)14天后制作標(biāo)本顯微鏡下觀察模型部分細(xì)胞特征并對(duì)比。

所述聚丙烯補(bǔ)片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進(jìn)行固定效果實(shí)驗(yàn)主要包括以下步驟：

1、將需要縫合的患者均為為兩組，一組為對(duì)照組，另一組為觀察組；

2、將觀察組患者應(yīng)用聚丙烯補(bǔ)片和a-氰基丙烯酸酯膠進(jìn)行固定，將對(duì)照組患者應(yīng)用聚丙烯補(bǔ)片和縫合的方式進(jìn)行固定；

對(duì)對(duì)照組與觀察組的患者進(jìn)行術(shù)后血液指標(biāo)（白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）、生化指標(biāo)（AST、ALT、BUN、Cr）以及術(shù)后隨訪并發(fā)癥監(jiān)測(cè)。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性體外實(shí)驗(yàn)中的甲醛測(cè)定主要在室溫條件下并放在封閉的環(huán)境中，在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)將50ul樣本置于96孔板中，加入甲醛試劑進(jìn)行孵育30分鐘，同時(shí)在在535nm光照處測(cè)定甲醛的量。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性體外實(shí)驗(yàn)中的培養(yǎng)基包括低糖杜爾貝科培養(yǎng)基、10%的胎牛血清營(yíng)養(yǎng)液、抗生素（10000U/ml的青霉素，10000ug/ml的鏈霉素和25ug/ml的兩性霉素），且每3天更換新的培養(yǎng)液。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性體外實(shí)驗(yàn)中樣本分離和計(jì)算主要是孵育完的待測(cè)溶液首先進(jìn)行洗滌去培養(yǎng)液后，加入胰蛋白酶進(jìn)行吹打分散，然后上離心機(jī)以1000r/min離心7分鐘，加入2ml染色液后再進(jìn)行離心，取懸濁液上流式機(jī)，細(xì)胞計(jì)算采用流式細(xì)胞術(shù)，最終計(jì)算出細(xì)胞水平，判定a-氰基丙烯酸酯是否具有細(xì)胞毒性。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：聚丙烯補(bǔ)片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進(jìn)行固定效果實(shí)驗(yàn)所選取患者不包括患有血液學(xué)、肝臟、腎臟疾病。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明整體檢測(cè)準(zhǔn)確，可以有效的實(shí)現(xiàn)a-氰基丙烯酸酯膠的有效檢測(cè)，同時(shí)采用多重檢測(cè)手段，不會(huì)產(chǎn)生樣品較大誤差，同時(shí)也非常的高效。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

請(qǐng)參閱本發(fā)明實(shí)施例中，一種a-氰基丙烯酸酯細(xì)胞毒性檢測(cè)方法，主要包括a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性體外實(shí)驗(yàn)、a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及聚丙烯補(bǔ)片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進(jìn)行固定效果實(shí)驗(yàn)，其中a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性體外實(shí)驗(yàn)主要包括以下步驟：

4、取真皮層成纖維細(xì)胞和間皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)；

5、在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)（每月2日、4日、7日、10日、14日、21日、28日的0時(shí)、6時(shí)和24時(shí)）取步驟1中的樣本進(jìn)行依次進(jìn)行洗滌、分散、再洗滌、離心；

6、取步驟2中的懸濁液并加入10ml的a-氰基丙烯酸酯膠和6ml 的PBS混合液后繼續(xù)播種到培養(yǎng)基上并在37°C環(huán)境的密封內(nèi)孵化5 h后進(jìn)行進(jìn)行染色處理，同時(shí)在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞數(shù)，同時(shí)在a-氰基丙烯酸酯膠與PBS混合液混合時(shí)進(jìn)行甲醛測(cè)定。

所述的細(xì)胞毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要包括以下步驟：

4、取新西蘭兔人為造成腹部缺陷，包括腹前壁(右和左側(cè)面)內(nèi)部和外部斜肌和橫向肌肉，腹橫筋以及腹膜壁層，并均分為觀察組以及對(duì)照組；

5、將觀察組采用a-氰基丙烯酸酯膠粘劑處理固定，將對(duì)照組采用縫合處理；

6、將觀察組以及對(duì)照組的在培養(yǎng)14天后制作標(biāo)本顯微鏡下觀察模型部分細(xì)胞特征并對(duì)比。

所述聚丙烯補(bǔ)片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進(jìn)行固定效果實(shí)驗(yàn)主要包括以下步驟：

3、將需要縫合的患者均為為兩組，一組為對(duì)照組，另一組為觀察組；

4、將觀察組患者應(yīng)用聚丙烯補(bǔ)片和a-氰基丙烯酸酯膠進(jìn)行固定，將對(duì)照組患者應(yīng)用聚丙烯補(bǔ)片和縫合的方式進(jìn)行固定；

5、對(duì)對(duì)照組與觀察組的患者進(jìn)行術(shù)后血液指標(biāo)（白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）、生化指標(biāo)（AST、ALT、BUN、Cr）以及術(shù)后隨訪并發(fā)癥監(jiān)測(cè)。

a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性體外實(shí)驗(yàn)中的甲醛測(cè)定主要在室溫條件下并放在封閉的環(huán)境中，在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)將50ul樣本置于96孔板中，加入甲醛試劑進(jìn)行孵育30分鐘，同時(shí)在在535nm光照處測(cè)定甲醛的量。

a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性體外實(shí)驗(yàn)中的培養(yǎng)基包括低糖杜爾貝科培養(yǎng)基、10%的胎牛血清營(yíng)養(yǎng)液、抗生素（10000U/ml的青霉素，10000ug/ml的鏈霉素和25ug/ml的兩性霉素），且每3天更換新的培養(yǎng)液。

a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細(xì)胞毒性體外實(shí)驗(yàn)中樣本分離和計(jì)算主要是孵育完的待測(cè)溶液首先進(jìn)行洗滌去培養(yǎng)液后，加入胰蛋白酶進(jìn)行吹打分散，然后上離心機(jī)以1000r/min離心7分鐘，加入2ml染色液后再進(jìn)行離心，取懸濁液上流式機(jī)，細(xì)胞計(jì)算采用流式細(xì)胞術(shù)，最終計(jì)算出細(xì)胞水平，判定a-氰基丙烯酸酯是否具有細(xì)胞毒性。

聚丙烯補(bǔ)片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進(jìn)行固定效果實(shí)驗(yàn)所選取患者不包括患有血液學(xué)、肝臟、腎臟疾病。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書(shū)按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書(shū)的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。