本發(fā)明涉及一種采用發(fā)酵從劍麻中提取劍麻皂素的方法。

背景技術(shù)：

劍麻又名鳳尾蘭，是生產(chǎn)硬質(zhì)纖維的主要經(jīng)濟(jì)作物，由于劍麻葉片中纖維的含量僅占其本身的3％～5％，因此在劍麻纖維的加工過程中將產(chǎn)生大量的廢棄物，如抽取纖維后產(chǎn)生的麻渣、麻汁等。這些廢棄物中含有豐富的皂苷。若將其直接排放或堆放，不僅導(dǎo)致大量資源的浪費，而且會對環(huán)境造成嚴(yán)重污染。劍麻皂苷元，素有“醫(yī)藥黃金”和“激素之母”之稱，是合成甾體激素類藥物的醫(yī)藥中間體，可用于合成哺乳動物信息素、皮質(zhì)激素藥物、促進(jìn)蛋白同化與心血管疾病的甾體藥物以及抗心律失常藥等藥物。劍麻皂苷元在劍麻中以皂苷的形式存在，甾體皂苷的C3位和C26位通過皂苷鍵與糖鏈相連，因此，要制備劍麻皂苷元，必須水解皂苷鍵，將劍麻皂苷降解為不溶于水的皂苷元，然后再提取、分離及純化。

傳統(tǒng)工藝是以濃硫酸或濃鹽酸作催化劑進(jìn)行水解反應(yīng)，使劍麻麻膏中皂苷降解成皂苷元后，過濾，用水洗至pH＝5-7，濾餅干燥后即為水解物產(chǎn)品。傳統(tǒng)方法提取劍麻皂苷元過程使用大量的酸，不僅破壞了皂苷元的結(jié)構(gòu)，造成皂苷元提取率低，還產(chǎn)生大量廢水、廢渣，對環(huán)境污染極其嚴(yán)重，同時，強(qiáng)酸的使用對設(shè)備和管道有腐蝕，且反應(yīng)過程需要加熱甚至加壓，反應(yīng)條件比較苛刻。近年來，很多研究者提出采用微生物轉(zhuǎn)化法等對其直接酸解法進(jìn)行改進(jìn)。采用不同的微生物進(jìn)行發(fā)酵，其機(jī)理不盡相同，導(dǎo)致提取率也不同。現(xiàn)有的微生物發(fā)酵提取劍麻皂素提取率并不是很理想。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有的提取劍麻皂素和?？录獙幍姆椒ㄋ嬖诘漠a(chǎn)品收率低，需要用到強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或者有機(jī)溶劑不僅污染環(huán)境而且毒性大，工藝復(fù)雜，成本高等問題，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵法提取劍麻皂素的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種發(fā)酵提取劍麻皂素的方法，包括：

將嗜乙醇假絲酵母接種到包括劍麻抽取纖維后產(chǎn)生的麻渣和/或麻汁的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵得到發(fā)酵液，然后從中提取劍麻皂素；

所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基包括：KNO₃ 1.5～3g/L、K₂HPO₄ 0.8～1.5g/L、KCl 0.4～0.8g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4～0.8g/L、FeSO₄·7H₂O 0.008～0.015g/L。

在一個具體實施方式中，先將嗜乙醇假絲酵母菌種接種到液體復(fù)壯培養(yǎng)基中培養(yǎng)后再用于發(fā)酵。

在一個具體實施方式中，嗜乙醇假絲酵母接種量為8～15％。

在一個具體實施方式中，35～38℃下發(fā)酵。

在一個具體實施方式中，攪拌發(fā)酵，攪拌速率150～200rpm.

在一個具體實施方式中，發(fā)酵時間2～3天。

在一個具體實施方式中，將發(fā)酵液離心，棄上清得到沉淀物，提取沉淀中的劍麻皂素。

在一個具體實施方式中，沉淀物烘干后，加入甲醇超聲波浸提。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1.現(xiàn)有的提取劍麻皂素和?？录獙幍姆椒óa(chǎn)品收率和純度低，需要用到強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或者有機(jī)溶劑不僅污染環(huán)境而且毒性大，工藝復(fù)雜，成本高，本發(fā)明所用的為生物菌種發(fā)酵法，節(jié)能環(huán)保，產(chǎn)量高。

2.相比于其他菌種，例如黑曲霉，劍麻皂素含量顯著提高。

3.傳統(tǒng)發(fā)酵，菌種雜亂，發(fā)酵周期長，本發(fā)明所用單一菌種嗜乙醇假絲酵母發(fā)酵，將發(fā)酵周期大大縮短，極大地提高了發(fā)酵效率。

4.直接通過菌發(fā)酵，一步到位，省時省力。

附圖說明

附圖1為劍麻皂苷測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，按照比色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，劍麻皂苷質(zhì)量為0.1mg-0.7mg，曲線方程為y＝1.7686x+0.1133,R²＝0.9938,相關(guān)性較好，可以用來測定發(fā)酵液中皂苷質(zhì)量。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。

為選擇更適合用于本發(fā)明提取劍麻皂素的菌種，本發(fā)明人從自然發(fā)酵劍麻渣水中分離純化得到一株純菌種，通過鑒定，確定該菌種為嗜乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，采用嗜乙醇假絲酵母進(jìn)行發(fā)酵提取劍麻皂素可以使得劍麻皂素含量顯著提高。

本發(fā)明所用嗜乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)可市購。也可以從自然發(fā)酵劍麻渣水中分離純化得到，先進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)。

制作劍麻皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方法如下：精密稱量劍麻皂苷標(biāo)準(zhǔn)品4mg，用甲醇定容至5ml，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0..6、0.7ml劍麻皂苷溶液于25ml具塞試管中，以空白管做對照，在70℃下烘干后冷卻至室溫，依次在各管中加入0.2ml5％香草醛冰醋酸溶液，0.8ml高氯酸，搖勻后置于70℃烘箱加熱15分鐘，取出后迅速用冷水冷卻至室溫，再分別加入5ml冰醋酸，搖勻，于450nm處測定吸光值，以質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝1.768x+0.113，R²＝0.993，相關(guān)性良好，如圖1。

實施例1

在本實施例中，從劍麻中提取劍麻皂素的方法包括：

(1)將劍麻渣水制成液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

將劍麻抽取纖維后產(chǎn)生的麻渣加水，攪拌充分后得劍麻渣水，高溫滅菌后備用；

液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：KNO₃ 2g；K₂HPO₄ 1g；KCl 0.5g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；FeSO₄·7H₂O0.01g；劍麻渣水(滅菌)1000ml；pH自然。

(2)將嗜乙醇假絲酵母菌種接種到液體復(fù)壯培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件具體為：180rpm，28℃恒溫培養(yǎng)；

液體復(fù)壯培養(yǎng)基組分為：馬鈴薯200g(切碎、煮沸煮爛、過濾留下濾液，蒸餾水補(bǔ)足至1000ml)；葡萄糖20g；KH₂PO₄ 3.0g；MgSO₄·7H₂O 1.5g；Vitamin B₁ 0.1g；

(3)用復(fù)壯后的嗜乙醇假絲酵母液體菌種接種發(fā)酵液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。

接種量為10％(嗜乙醇假絲酵母液體菌種和液體發(fā)酵培養(yǎng)基以1:10的體積比)，在180rpm，37℃下進(jìn)行攪拌發(fā)酵3天得到發(fā)酵液。

(4)從發(fā)酵液中提取沉淀。

取發(fā)酵液，離心，棄上清，得到沉淀物；

具體的，從接種開始，每隔24小時取一次發(fā)酵液，共取3次；每次45mL；離心條件為4500r/min、4℃；

(5)提取沉淀中的劍麻皂素。

沉淀物烘干，稱取質(zhì)量，加入甲醇超聲波浸提，測定提取物中皂苷含量；

具體的，烘干條件為：75℃，2h；甲醇加入量為：20ml/g(即1g沉淀干重加入20ml甲醇)；超聲浸提時間為：60min。

測定提取物中皂苷含量方法具體為：取上清液0.5ml置于25ml具塞試管中，以空白管對照，在70℃下烘干后冷卻至室溫，依次加入5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，搖勻后置于70℃烘箱中加熱15min，取出后迅速流水冷卻至室溫，再分別加入5ml冰醋酸，在450nm處測定吸光度。

實施例2

具體步驟和參數(shù)與實施例1相同，所不同的是：

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：KNO₃ 1.5g/L、K₂HPO₄ 0.8g/L、KCl 0.4g/L、MgSO₄·7H₂O 0.8g/L、FeSO₄·7H₂O 0.015g/L；

接種量為8％；35℃下發(fā)酵；發(fā)酵時間1-3天；

烘干條件為：65℃℃，3h，超聲浸提時間為：90min。

實施例3

具體步驟和參數(shù)與實施例1相同，所不同的是：

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：KNO₃ 3g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、KCl 0.8g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4g/L、FeSO₄·7H₂O 0.008g/L；

接種量為15％；38℃下發(fā)酵；發(fā)酵時間1-3天。

本發(fā)明實驗結(jié)果對比如下表：

經(jīng)結(jié)果分析對比，在自然條件下不做任何處理發(fā)酵劍麻渣水與搖勻振蕩發(fā)酵劍麻渣水所產(chǎn)生劍麻皂素含量均偏低，且發(fā)酵周期偏長。而本發(fā)明用純化的嗜乙醇假絲酵母發(fā)酵法發(fā)酵劍麻渣水同比，發(fā)酵周期短(24-72h)且產(chǎn)量高。并且，嗜乙醇假絲酵母菌發(fā)酵效果明顯優(yōu)于黑曲霉。