本發(fā)明涉及NtRRS2基因及其在煙草抗青枯病中的應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物。煙草青枯病是煙草的重要病害之一，該病害屬土傳性細(xì)菌性病害，從根部或傷口侵入，導(dǎo)致植株枯萎死亡，在中國俗稱“煙瘟”。該病分布較為廣泛，主要分布于高溫高濕的熱帶及亞熱帶地區(qū)。近年來表現(xiàn)出逐漸向高緯度、高海拔寒帶地區(qū)擴(kuò)展的趨勢。該病害嚴(yán)重危害我國長江流域及南方的煙葉產(chǎn)區(qū)，給煙農(nóng)造成巨大的損失，造成嚴(yán)重產(chǎn)量損失的有福建、廣東、廣西等多個省份的煙區(qū)。目前尚未有經(jīng)濟(jì)有效的防治煙草青枯病手段，而從根本上解決的有效途徑是培育抗病品種，與傳統(tǒng)育種方法相比，利用基因工程育種手段培育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的抗青枯病品種可更有效的解決煙草青枯病問題。

目前我國已開展了煙草基因組的測序工作，并完成了兩個野生原始種的基因組測序，但栽培種的基因組序列尚在組裝過程中。這將有利于煙草抗青枯病基因的克隆和鑒定，促進(jìn)煙草抗青枯病分子育種。細(xì)菌性青枯病為害寄主范圍很廣，但除了擬南芥，尚未從正向遺傳學(xué)手段獲得抗青枯病基因。目前在擬南芥上獲得的TIR-NB-LRR類抗青枯基因RRS1-R和LRR-RLK類抗青枯基因ERECTA。而NBS-LRR類抗性基因常包含核苷酸結(jié)合位點（NBS）和富亮氨酸重復(fù)（LRR）結(jié)構(gòu)域。NBS的保守結(jié)構(gòu)域包含了多個在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用的保守功能區(qū)，如P-Loop，Kinase-2，Kinase-3a和GLPL等。LRR結(jié)構(gòu)域則介導(dǎo)病原相關(guān)分子模式引發(fā)的免疫反應(yīng)（PTI）中。植物遭到病原菌入侵后，通常會在侵染部位通過產(chǎn)生過敏反應(yīng)，來抵御病原菌的擴(kuò)散和繁殖，進(jìn)而激活下游一系列的相關(guān)防衛(wèi)反應(yīng)。植物的防御反應(yīng)過程是復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用的結(jié)果，該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由抗性通道或SA，ET，JA等植物激素參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路交叉形成。目前煙草中NBS-LRR類抗青枯基因的報道甚少，煙草抗青枯的分子機(jī)理及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究甚少，這嚴(yán)重制約了煙草抗青枯病的分子育種進(jìn)程。

本發(fā)明針對以上背景技術(shù)，研究基于實驗室前期的煙草基因芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了一個經(jīng)青枯菌誘導(dǎo)后在抗感品種上均上調(diào)表達(dá)的CC-NBS-LRR類抗性基因，命名為NtRRS2，作為抗青枯病關(guān)鍵候選基因。利用Race技術(shù)從煙草抗病品種巖煙97中克隆了該基因的全長序列，包含完整的開放閱讀框，包含CC基序、NB-ARC和多個富亮氨酸基序（LRR-RI）保守結(jié)構(gòu)域，符合CC-NBS-LRR類的抗病基因家族的特點。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了超表達(dá)載體，酶切連接法構(gòu)建了RNAi載體，分別轉(zhuǎn)入感病品種紅花大金元和抗病品種巖煙97中，進(jìn)行遺傳互補功能驗證。對轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行青枯菌接種鑒定，結(jié)果表明超量表達(dá)NtRRS2基因可顯著增強煙草青枯病抗性，而RNAi沉默并未使植株完全感病，這說明該基因可能參與了抗病防御反應(yīng)，但與巖煙97抗青枯病信號通道相關(guān)，可能是通過識別受體蛋白而激活下游抗性信號通道。本發(fā)明為利用基因工程手段培育抗青枯病煙草新品種提供了基因資源，具有重要的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了煙草CC-NBS-LRR類抗病基因NtRRS2基因在煙草抗青枯病中的應(yīng)用。目的在于提供煙草CC-NBS-LRR類抗病基因NtRRS2基因的編碼序列及其所編碼的蛋白，提供含有上述NtRRS2基因的過表達(dá)載體以及RNAi干擾載體，并應(yīng)用于提高煙草對青枯菌的抗性，進(jìn)而培育抗青枯病煙草新品種（系）。為利用基因工程手段培育抗青枯病煙草新品種提供了基因資源，具有重要的應(yīng)用前景。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明通過設(shè)計引物，從抗青枯病煙草品種巖煙97中克隆獲得NtRRS2基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明提供了含有所述煙草CC-NBS-LRR類抗病基因NtRRS2基因的過表達(dá)載體以及RNAi載體。采用Gateway技術(shù)，將NtRRS2基因引入到過表達(dá)載體pEarleyGate 205中，由增強型啟動子35S驅(qū)動，載體命名為p35S :: NtRRS2-TAP；采用酶切連接法，將NtRRS2基因的正反向插入片段插入到RNAi表達(dá)載體pGSA2285中，命名為NtRRS2-RNAi。分別將上述載體轉(zhuǎn)化EHA105 農(nóng)桿菌，通過葉盤法分別將其導(dǎo)入感青枯病品種紅花大金元與抗青枯病品種巖煙97中。對轉(zhuǎn)基因后代植株進(jìn)行青枯菌接種鑒定，結(jié)果表明NtRRS2基因的過量表達(dá)可顯著增強煙草植株對青枯菌的抗性，該基因沉默可降低煙草植株對青枯菌的抗性。

初步預(yù)測該基因可能是內(nèi)源抗病基因的互作基因，抑制了煙草抗青枯病基因的表達(dá)。這將為煙草抗青枯病的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明為研究NtRRS2基因是否與煙草抗青枯病中發(fā)揮作用，以野生型為對照，

有益效果

本發(fā)明克隆的煙草CC-NBS-LRR類抗病基因NtRRS2可提高煙草對青枯菌的抗性，對于煙草抗青枯病的遺傳改良以及培育抗青枯病煙草新品種（系）具有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1 RACE獲得NtRRS2基因的3’未知序列和5’未知序列以及ORF框電泳圖。A：5’RACE目的片段；B：3’RACE目的片段；C：ORF框目的片段。

圖2-1 NtRRS2蛋白結(jié)構(gòu)域的多序列比對。

圖2-2 NtRRS2蛋白結(jié)構(gòu)域的多序列比對。

圖2-3 NtRRS2蛋白結(jié)構(gòu)域的多序列比對。

圖3 NtRRS2超表達(dá)載體(A)和RNAi載體（B）的構(gòu)建示意圖。

圖4 NtRRS2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草T0代鑒定。A.DNA 水平上的鑒定；B. RNA水平上的鑒定；M1：DL15,000 DNA Marker；M2：DL2,000 DNA Marker。1：陰性對照；2：陽性對照；其余泳道為以T0代植株個體的DNA或sscDNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖5 NtRRS2-RNAi轉(zhuǎn)基因煙草T0代鑒定。A. DNA 水平上的鑒定；B. RNA水平上的鑒定；M：DL2,000 DNA Marker；1：陽性對照；2：陰性對照；其余泳道為以T0代植株個體的DNA或sscDNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖6 NtRRS2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草接種青枯菌的表型及其病情指數(shù)。

圖7 RNAi干擾沉默NtRRS2轉(zhuǎn)基因煙草接種青枯菌的表型及其病情指數(shù)。

具體實施方式

【實施例1】RACE獲得NtRRS2基因3’未知序列和5’未知序列

本研究基于實驗室前期的煙草基因芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了一個經(jīng)青枯菌誘導(dǎo)后在抗感品種上均上調(diào)表達(dá)的CC-NBS-LRR類抗性基因的片段，命名為NtRRS-2。根據(jù)該基因片段，設(shè)計引物NtRRS2-5’race-F（5’-TTGCTAATCGAGATGTCCGACTTAG-3’）和NtRRS2-3’race-R（5’-TCTCAACTTTGAGTCAACAATATCTTC-3’），根據(jù)模板接頭序列設(shè)計一對引物NtLib45-F（5’-GATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTACGCGTGTAAAACGAC-3’）和NtLib39-R（5,-ACCAGGATCTCCTAGGGAAACAGCTATGACCATGTTCAC-3’），用NtRRS2-3’race-R引物和NtLib45-F引物以及NtRRS2-5’race-F引物和NtLib39-R引物配對分別進(jìn)行5′和3′- RACE反應(yīng)，5′-RACE反應(yīng)條件是95 ℃，5 min →（95 ℃，30 s →72 ℃，2 min）5 cycles →（95 ℃，30 s →57 ℃，30 s →72 ℃，30 s）30 cycles→72 ℃，10 min；3’-RACE反應(yīng)條件是95 ℃，5 min →（95 ℃，30 s →72 ℃，2 min）5 cycles →（95 ℃，30 s →57 ℃，30 s →72 ℃，30 s）30 cycles →72 ℃，10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為2 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的目的條帶大小對產(chǎn)物有目的的回收并連接到載體pMD18-T，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ɑ，挑取單克隆，進(jìn)行PCR檢測，選擇陽性克隆送華大基因有限公司測序。將獲得的5′和3′未知序列經(jīng)拼接后獲得其全長cDNA序列，根據(jù)全長cDNA序列設(shè)計擴(kuò)增ORF框的特異引物NtRRS2-ORF-F（5’-ATGGCTTATGCTGCTCTGACTTCTGCTG-3’）和NtRR-2-ORF-R（5’-TCATTTCTCTACTTGCCTGGTGGAATAAG-3’），以巖煙97葉片cDNA為模板克隆獲得目的基因的ORF框序列。反應(yīng)條件是95 ℃，5 min →（95 ℃，30 s → 68 ℃，2 min）5 cycles →（95 ℃，30 s → 57 ℃，30 s → 72 ℃，30 s）30 cycles → 72 ℃，10 min；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為1.5 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的目的條帶大小對產(chǎn)物有目的的回收并連接到載體pDONR207，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ɑ，挑取單克隆，進(jìn)行PCR檢測，選擇陽性克隆送華大基因有限公司測序。NtRRS2基因的3’未知序列和5’未知序列以及ORF框序列的電泳圖如圖1所示；其完整ORF序列如SEQ ID No.1所示。該基因的cDNA序列全長3259bp，含有編碼938個氨基酸殘基的ORF框、長度為304 bp的5’端非翻譯區(qū)、長度為112 bp的3’端非翻譯區(qū)、以及26 bp的Poly（A）尾巴。利用NCBI上的CDD（Conserved Domain Database）軟件對NtRRS2蛋白進(jìn)行保守域預(yù)測，該序列包含CC基序、NB-ARC和多個富亮氨酸基序（LRR-RI）保守結(jié)構(gòu)域，符合CC-NBS-LRR類的抗病基因家族的特點。

通過BlastP比對煙草NtRRS2編碼的蛋白與其他作物的抗性蛋白之間的同源性，結(jié)果顯示其與芝麻、番茄、馬鈴薯的同源性分別為42%、40%、37%。運用ClustalW軟件，對NtRRS2與擬南芥、辣椒、番茄及芝麻等四種植物的CC-NBS-LRR類抗性蛋白氨基酸序列比對的結(jié)果如圖2-1~圖2-3所示，NtRRS2的CC-NBS-LRR結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比較保守，含有P-Loop、Kinase-2a、Kinase-3a和GLPL區(qū)域，而保守區(qū)域之外的氨基酸序列卻差異比較大，由此可推斷煙草NtRRS2基因?qū)儆贑C-NBS-LRR類基因家族。

【實施例2】NtRRS2超表達(dá)載體與RNAi載體構(gòu)建與驗證

采用Gateway技術(shù)，通過引物對NtRRS2-OE-F（5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGCTTATGCTGCTC-3’）和NtRRS2-OE-R（5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTTCTCTACTTGCCTG-3’）擴(kuò)增獲得不包括終止密碼的NtRRS2基因的cDNA編碼區(qū)片段，經(jīng)BP反應(yīng)將該目的片段連接到入門載體pDONR207中，再通過LR反應(yīng)將該片段從入門載體pDONR207中轉(zhuǎn)移到過表達(dá)載體pEarleyGate 205中，構(gòu)建p35S::NtRRS2-TAP過量表達(dá)載體（圖3A），用于遺傳轉(zhuǎn)化煙草紅花大金元。

采用酶切連接法，通過正向插入的引物對NtRRS2-RNAi-XhoI-F（5’-ATTACTCGAGCTTCATTTGGACAGCATC-3’）、NtRRS2-RNAi-NcoI-R（5’-ATTACCATGGGTCAAACAAGCAAATAAGT-3’）和反向插入的引物對NtRRS2-RNAi-PacI-F（5’-ACCTTAATTAACTTCATTTGGACAGCATC-3’）和NtRRS2-RNAi-BamHI-R（5’-ATTAGGATCCGTCAAACAAGCAAATAAGT-3’）分別從巖煙97葉片cDNA模板中擴(kuò)增得到NtRRS2基因的正反向插入片段，將其插入到酶切后的RNAi表達(dá)載體pGSA2285中，構(gòu)建NtRRS2-RNAi表達(dá)載體（圖3B），用于遺傳轉(zhuǎn)化煙草巖煙97。構(gòu)建好的載體通過液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105以備煙草轉(zhuǎn)基因用。

【實施例3】煙草的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定

將分別帶有質(zhì)粒p35S::NtRRS2-TAP過量表達(dá)載體和NtRRS-2-RNAi干擾載體的農(nóng)桿菌通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草品種紅花大金元和巖煙97中，T0代轉(zhuǎn)基因煙草分別經(jīng)過Basta和卡那霉素的篩選。分別用100mg/L與75mg/mL的卡那霉素篩選葉芽及根系生長，在培養(yǎng)過程中用500 mg/L（Cef）來抑制農(nóng)桿菌的生長，培養(yǎng)條件溫度25℃±2℃，光照每天14h白天/10h黑夜。預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：1/2 MS培養(yǎng)基+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA，共培養(yǎng)培養(yǎng)基：1/2 MS培養(yǎng)基+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+1 mg/L AS，誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+500 mg/L cef+2.5 mg/L PPt，MS培養(yǎng)基+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA +500 mg/L cef+25 mg/L Km，篩選培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+500 mg/L cef+4 mg/L PPt，MS培養(yǎng)基+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA +500 mg/L cef+50 mg/L Km，生根培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L IAA+500 mg/L cef+4 mg/L PPt，MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L IAA+500 mg/L cef+75 mg/L Km。

超表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測：根據(jù)35S啟動子和NtRRS2基因序列設(shè)計一對引物引物35S-F（5’-TGATGTGATATCTCCACTGACGTAAG-3’）和NtRRS2-R（5’- CAAGATGACGAGCTAATTTTGGTTCTTG-3’），CTAB法提取轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因煙草DNA，以轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板，未轉(zhuǎn)化煙草DNA為對照，以35S-F和NtRRS2-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.0μl，dNTP 1.5μl，35S-F 0.5μl，NtRRS2-R 0.5μl，Taq酶0.1μl，ddH₂O 14.4μl，模板DNA 1.0μl，總體積為20μl。反應(yīng)程序為：94 ℃ 5 min→（94 ℃ 30 s→58℃ 30 s→72 ℃ 60 s）40 cycles→72 ℃ 10min→ hold at 4℃。結(jié)果顯示，陽性植株P(guān)CR擴(kuò)增獲得了一條2453bp的條帶（圖4A），從96個轉(zhuǎn)基因植株中獲得了78株陽性植株。為了解陽性植株轉(zhuǎn)基因是否表達(dá)，CTAB法提取了陽性植株的總RNA，經(jīng)PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA，根據(jù)NtRRS2基因序列設(shè)計引物NtRRS2-F（5’-TGAAACCACCTGTACAAGAACC-3’）和NtRRS2-R（5’-TCTCTACTTGCCTGGTGG-3’），進(jìn)行RT-PCR分析，所分析的78株陽性植株全部顯示表達(dá)條帶，陽性率為81%（圖4B）。

RNAi干擾載體轉(zhuǎn)基因植株檢測：設(shè)計引物NptII-F（5’-AGATGGATTGCACGCAGGTTCTC-3’）和NptII-R（5’-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3’），CTAB法提取轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因煙草DNA，以轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板，未轉(zhuǎn)化煙草DNA為對照，以NptII-F和NptII-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.0μl，dNTP 1.5μl，NptII-F 0.5μl，NptII-R 0.5μl，Taq酶0.1μl，ddH2O 14.4μl，模板DNA 1.0μl，總體積為20μl。反應(yīng)程序為：94 ℃ 5 min→（94 ℃ 30 s→55℃ 30 s→72 ℃ 30 s）40 cycles→72 ℃ 10min→ hold at 4℃。結(jié)果顯示，陽性植株P(guān)CR擴(kuò)增獲得了一條500bp的條帶（圖5A），從86個轉(zhuǎn)基因植株中獲得了67個陽性植株；為了解陽性植株轉(zhuǎn)基因是否抑制表達(dá)，提取了陽性植物的總RNA，用引物對NtRRS-2-RNAi-Xho I-F（5’-ATTACTCGAGCTTCATTTGGACAGCATC-3’）和NtRRS-2-RNAi-Nco I-R（5’-ATTACCATGGGTCAAACAAGCAAATAAGT-3’）進(jìn)行RT-PCR分析，所分析的67個陽性植株全部顯示表達(dá)條帶（圖5B）。通過鑒定獲得67株T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株，陽性率約78%。

【實施例4】轉(zhuǎn)基因植株抗青枯病鑒定

對6葉期的野生型煙草植株、過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草植株和RNAi轉(zhuǎn)基因煙草植株的倒2、倒3功能葉進(jìn)行接種處理，用一次性1 mL注射器沿葉脈注射煙草青枯菌菌液，進(jìn)行抗性鑒定。每種處理組合設(shè)三個生物學(xué)重復(fù)。通過病情指數(shù)具體評價接種植株整體的抗病性。

接種20d后轉(zhuǎn)基因植株NtRRS2-OE長勢仍然正常，葉片接種部位出現(xiàn)明顯的壞死斑，但莖部沒有出現(xiàn)傳染或僅少數(shù)出現(xiàn)輕度感染的現(xiàn)象，而對照組HD出現(xiàn)死亡的癥狀，轉(zhuǎn)基因植株NtRRS2的抗性表現(xiàn)明顯比野生型紅花大金元強（圖6A）。72株NtRRS2-OE轉(zhuǎn)基因植株鑒定中，有21株完全沒有發(fā)病，其他的顯示不同程度的發(fā)病，其病情指數(shù)為21.53（圖6B）。

在接種20d后轉(zhuǎn)基因NtRRS2-RNAi植株葉片接種部位出現(xiàn)明顯的壞死斑并傳染葉柄，出現(xiàn)葉片枯死，部分植株死亡的現(xiàn)象，而對照組YY97僅葉片出現(xiàn)壞死斑而未向下傳染，長勢正常未出現(xiàn)死亡的癥狀，轉(zhuǎn)基因NtRRS2-RNAi植株表現(xiàn)感病，但與對照組YY97的表型差異并不十分明顯（圖7A）。通過病情指數(shù)具體評價接種植株的整體抗病性，對67株NtRRS2-RNAi轉(zhuǎn)基因植株鑒定中，有14株完全沒有發(fā)病，其他的都有不同程度的發(fā)病，據(jù)煙草抗性鑒定病情分級標(biāo)準(zhǔn)對每株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行病情分級，計算其病情指數(shù)為55.03（圖7B）。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建農(nóng)林大學(xué)

<120> NtRRS2基因及其在煙草抗青枯病中的應(yīng)用

<130> 22

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3259

<212> DNA

<213> NtRRS2全長cDNA序列

<400> 1

actataaaag acaagttttt ctcggaaccg atttttatat tatgttataa tatataatag 60

cacttcacta tagcagccaa aaaatatcgg aacaaacgag gctgttatag agatgtttga 120

ttgtattagg tttatgtata aatatttaat tgcgaaccag taactaagac atgtttaggt 180

tatttggcaa atttaaaact cataaacttc aaatctcggc tccgtctctt ctgagatcta 240

attgtttttg taaagcagtg gtagactgat agtttgttta atgtaatttt cagaggacga 300

agaaatggct tatgctgctc tgacttctgc tgtatgctca ctcgagctgt tcctgcaatg 360

caatcatcca ttactgaata atcttcagag gaaagaacag atcttatcac tatgcaaaag 420

aattttatct tttcaagagt tcttggcgga ttttgaaaag ctaatgcata agcatgaagg 480

gctaaaatta ttggaaggaa agatcaaaga gaaaacatat caagttgaag atattgttga 540

ctcaaagttg agaaaatatt ttttggccaa aaatgcaaag gaccgaaaaa aggcctactc 600

agttctatgt aggaggttac aggtagcaat tgaagaaatg gaattggtca aaaaagaagc 660

aatgacaatt aagggtgaca agattaggac aaggcttttt catacacgag tttcaccagc 720

taggagggat gtatcaacta gtagtccaaa tttgcaacaa caaacaccgg ttggtttcca 780

ggacgacttg gacaaaataa ttgataggct cagaggtgat tcttctgaac tagatattat 840

cactatagtc gggatggctg gtattggtaa aacaactctt gcaaaaagag catataacga 900

tccttctgtt gtttaccggt ttgatgttcg tgcttggacc actatttctc aagagtatag 960

agaaagagac acattacttg acctctttta ttcagttgtt cctccagcca gtggatccaa 1020

tcaagagagc gacaaagaag ctgctgatcg actgtatggt aggctaatga ctcaaccttc 1080

aaaagaaatg tacgaaggta gaaaccaaga aatggctgac cgattgtaca aaagtttaaa 1140

gggtaagaga tttctcattg tcgtcgatga catgtggagc actgatgctt gggacaatgt 1200

gagcatgttt cttcctaatg ataacaataa aagtcgtgtc atactaacaa gtaggctcat 1260

tgatgtcgca acttatgcta atcctaatcc aggtaggcaa cctcaccgac tgaattttct 1320

aaacaaagat gaaggttggg aactactccg tgagaaactt ttcgggaaaa gaggatgccc 1380

ttttgagttg gaagtgattg ggaaaagtat tgcagaaaaa tgccaaggac tacctctagc 1440

gattgttgtg gttgcagggc atctttccaa aatgagcaag actccggata gctggaacac 1500

tgttgctgaa agtgtgggct ccgtcgtaaa tcgtgagcca gggcagtgtt tagacatact 1560

tgctctaagt tacaactact tgcctcaaca tttaaaagcc tgcttcttgt acatgggagc 1620

atttcctgaa gattttgaga ttcccgtgtg gaagctaatt aggttgtggg ttgctgaggg 1680

cttccttaat gcaacaggac atacgaccat ggaagagata gtagaggatt gtttggagga 1740

tcttattgat agatgtttgg ttttagctgg aaagcggtct aatggaaaac tcaaaacatg 1800

taaagtccat gacatcatgc gagagttttg cttagaagaa gctagaagaa aaaactttct 1860

acatgtcttg aagagttccc ttgatgttct atcagaaagc ataacagctt tacgtcgggt 1920

tagtatcaat tgtagcacca tcttctcaag ttactctatt caaccgacgg attctactgt 1980

ttctgtttct cgttccatct tgggattcaa tatttcggaa agttcaattt tttcatacat 2040

agacttcaaa ttgctcaggg ttctagatat cactttccaa catttccctc agtttcccag 2100

tgagataatg caacttgtta atttgcgtta ccttgcagtt gccactggta gcgaattccc 2160

tccactagta tcacagtttt ggagtttgca gactttaata cttcatctgt attctagaag 2220

ctcaactttt ccttgggaga tttggacgat gccaaacctc agacatctcc atgttaaacc 2280

aagcatctgt ttgccgagtc caaccaaagt agaatgtaat agatacagtt cctgggttct 2340

aaataaccta caaacacttg tcaatattac ccttgcagat tgtacaaagg atgtcttctc 2400

aagcactcct aagttgaaga aattggggat atgtgaatcg atcgattgta cttacccagt 2460

ccaaattctc tggagtgatt ttctttacac atctgaaaaa ctgtggcctt attctagtga 2520

tacaatgtca gacttgtggt cagattgctt tagaaatctt gctctcctgc ctcaactcga 2580

ggcattaaag atttttgggt tgaaaccacc tgtacaagaa ccaaaattag ctcgtcatct 2640

tgatgcactt ccggagaatc ttaagaaatt gactttgagc ttcacttact tgccgtggga 2700

gagtatgatg tctctttgta gattgccaaa tcttgaggta ctcaaactaa aaaattatgc 2760

ctccacagga ccaaaatggg aacaagttga agaggggttc tgttctttaa aactgttgct 2820

aatcgagatg tccgacttag agcaatggag cgcctcaaat gatcattttc catgcctgga 2880

acatctagtt ctaaagggtt gccttcattt ggacagcatc cctcgcgatt tgggctttat 2940

tccaacatta cagataattg agttggataa ttcaagccaa tccgctgtgc tttcagctaa 3000

agagattcaa gaggagcagc agagttgtgg ttatgatgct ctacaagtgg gaatagagag 3060

aaattttggg agaatagttg ctgttgcaac tccttattcc accaggcaag tagagaaatg 3120

aatttactac acaagttttg attattgaac gttggaagta acaaaattag taattcctac 3180

tactagctat tttcatttgt taacaccaat aataacttat ttgcttgttt gacaaaaaaa 3240

aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3259

<210> 2

<211> 938

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Tyr Ala Ala Leu Thr Ser Ala Val Cys Ser Leu Glu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Gln Cys Asn His Pro Leu Leu Asn Asn Leu Gln Arg Lys Glu Gln

20 25 30

Ile Leu Ser Leu Cys Lys Arg Ile Leu Ser Phe Gln Glu Phe Leu Ala

35 40 45

Asp Phe Glu Lys Leu Met His Lys His Glu Gly Leu Lys Leu Leu Glu

50 55 60

Gly Lys Ile Lys Glu Lys Thr Tyr Gln Val Glu Asp Ile Val Asp Ser

65 70 75 80

Lys Leu Arg Lys Tyr Phe Leu Ala Lys Asn Ala Lys Asp Arg Lys Lys

85 90 95

Ala Tyr Ser Val Leu Cys Arg Arg Leu Gln Val Ala Ile Glu Glu Met

100 105 110

Glu Leu Val Lys Lys Glu Ala Met Thr Ile Lys Gly Asp Lys Ile Arg

115 120 125

Thr Arg Leu Phe His Thr Arg Val Ser Pro Ala Arg Arg Asp Val Ser

130 135 140

Thr Ser Ser Pro Asn Leu Gln Gln Gln Thr Pro Val Gly Phe Gln Asp

145 150 155 160

Asp Leu Asp Lys Ile Ile Asp Arg Leu Arg Gly Asp Ser Ser Glu Leu

165 170 175

Asp Ile Ile Thr Ile Val Gly Met Ala Gly Ile Gly Lys Thr Thr Leu

180 185 190

Ala Lys Arg Ala Tyr Asn Asp Pro Ser Val Val Tyr Arg Phe Asp Val

195 200 205

Arg Ala Trp Thr Thr Ile Ser Gln Glu Tyr Arg Glu Arg Asp Thr Leu

210 215 220

Leu Asp Leu Phe Tyr Ser Val Val Pro Pro Ala Ser Gly Ser Asn Gln

225 230 235 240

Glu Ser Asp Lys Glu Ala Ala Asp Arg Leu Tyr Gly Arg Leu Met Thr

245 250 255

Gln Pro Ser Lys Glu Met Tyr Glu Gly Arg Asn Gln Glu Met Ala Asp

260 265 270

Arg Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Lys Arg Phe Leu Ile Val Val Asp

275 280 285

Asp Met Trp Ser Thr Asp Ala Trp Asp Asn Val Ser Met Phe Leu Pro

290 295 300

Asn Asp Asn Asn Lys Ser Arg Val Ile Leu Thr Ser Arg Leu Ile Asp

305 310 315 320

Val Ala Thr Tyr Ala Asn Pro Asn Pro Gly Arg Gln Pro His Arg Leu

325 330 335

Asn Phe Leu Asn Lys Asp Glu Gly Trp Glu Leu Leu Arg Glu Lys Leu

340 345 350

Phe Gly Lys Arg Gly Cys Pro Phe Glu Leu Glu Val Ile Gly Lys Ser

355 360 365

Ile Ala Glu Lys Cys Gln Gly Leu Pro Leu Ala Ile Val Val Val Ala

370 375 380

Gly His Leu Ser Lys Met Ser Lys Thr Pro Asp Ser Trp Asn Thr Val

385 390 395 400

Ala Glu Ser Val Gly Ser Val Val Asn Arg Glu Pro Gly Gln Cys Leu

405 410 415

Asp Ile Leu Ala Leu Ser Tyr Asn Tyr Leu Pro Gln His Leu Lys Ala

420 425 430

Cys Phe Leu Tyr Met Gly Ala Phe Pro Glu Asp Phe Glu Ile Pro Val

435 440 445

Trp Lys Leu Ile Arg Leu Trp Val Ala Glu Gly Phe Leu Asn Ala Thr

450 455 460

Gly His Thr Thr Met Glu Glu Ile Val Glu Asp Cys Leu Glu Asp Leu

465 470 475 480

Ile Asp Arg Cys Leu Val Leu Ala Gly Lys Arg Ser Asn Gly Lys Leu

485 490 495

Lys Thr Cys Lys Val His Asp Ile Met Arg Glu Phe Cys Leu Glu Glu

500 505 510

Ala Arg Arg Lys Asn Phe Leu His Val Leu Lys Ser Ser Leu Asp Val

515 520 525

Leu Ser Glu Ser Ile Thr Ala Leu Arg Arg Val Ser Ile Asn Cys Ser

530 535 540

Thr Ile Phe Ser Ser Tyr Ser Ile Gln Pro Thr Asp Ser Thr Val Ser

545 550 555 560

Val Ser Arg Ser Ile Leu Gly Phe Asn Ile Ser Glu Ser Ser Ile Phe

565 570 575

Ser Tyr Ile Asp Phe Lys Leu Leu Arg Val Leu Asp Ile Thr Phe Gln

580 585 590

His Phe Pro Gln Phe Pro Ser Glu Ile Met Gln Leu Val Asn Leu Arg

595 600 605

Tyr Leu Ala Val Ala Thr Gly Ser Glu Phe Pro Pro Leu Val Ser Gln

610 615 620

Phe Trp Ser Leu Gln Thr Leu Ile Leu His Leu Tyr Ser Arg Ser Ser

625 630 635 640

Thr Phe Pro Trp Glu Ile Trp Thr Met Pro Asn Leu Arg His Leu His

645 650 655

Val Lys Pro Ser Ile Cys Leu Pro Ser Pro Thr Lys Val Glu Cys Asn

660 665 670

Arg Tyr Ser Ser Trp Val Leu Asn Asn Leu Gln Thr Leu Val Asn Ile

675 680 685

Thr Leu Ala Asp Cys Thr Lys Asp Val Phe Ser Ser Thr Pro Lys Leu

690 695 700

Lys Lys Leu Gly Ile Cys Glu Ser Ile Asp Cys Thr Tyr Pro Val Gln

705 710 715 720

Ile Leu Trp Ser Asp Phe Leu Tyr Thr Ser Glu Lys Leu Trp Pro Tyr

725 730 735

Ser Ser Asp Thr Met Ser Asp Leu Trp Ser Asp Cys Phe Arg Asn Leu

740 745 750

Ala Leu Leu Pro Gln Leu Glu Ala Leu Lys Ile Phe Gly Leu Lys Pro

755 760 765

Pro Val Gln Glu Pro Lys Leu Ala Arg His Leu Asp Ala Leu Pro Glu

770 775 780

Asn Leu Lys Lys Leu Thr Leu Ser Phe Thr Tyr Leu Pro Trp Glu Ser

785 790 795 800

Met Met Ser Leu Cys Arg Leu Pro Asn Leu Glu Val Leu Lys Leu Lys

805 810 815

Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Pro Lys Trp Glu Gln Val Glu Glu Gly Phe

820 825 830

Cys Ser Leu Lys Leu Leu Leu Ile Glu Met Ser Asp Leu Glu Gln Trp

835 840 845

Ser Ala Ser Asn Asp His Phe Pro Cys Leu Glu His Leu Val Leu Lys

850 855 860

Gly Cys Leu His Leu Asp Ser Ile Pro Arg Asp Leu Gly Phe Ile Pro

865 870 875 880

Thr Leu Gln Ile Ile Glu Leu Asp Asn Ser Ser Gln Ser Ala Val Leu

885 890 895

Ser Ala Lys Glu Ile Gln Glu Glu Gln Gln Ser Cys Gly Tyr Asp Ala

900 905 910

Leu Gln Val Gly Ile Glu Arg Asn Phe Gly Arg Ile Val Ala Val Ala

915 920 925

Thr Pro Tyr Ser Thr Arg Gln Val Glu Lys

930 935

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgctaatcg agatgtccga cttag 25

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctcaacttt gagtcaacaa tatcttc 27

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gattctgtgg ataaccgtat taccgcctta cgcgtgtaaa acgac 45

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accaggatct cctagggaaa cagctatgac catgttcac 39

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggcttatg ctgctctgac ttctgctg 28

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcatttctct acttgcctgg tggaataag 29

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccatggct tatgctgctc 50

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcatttctct acttgcctg 49

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

attactcgag cttcatttgg acagcatc 28

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

attaccatgg gtcaaacaag caaataagt 29

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

accttaatta acttcatttg gacagcatc 29

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

attaggatcc gtcaaacaag caaataagt 29

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgatgtgata tctccactga cgtaag 26

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caagatgacg agctaatttt ggttcttg 28

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgaaaccacc tgtacaagaa cc 22

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tctctacttg cctggtgg 18

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agatggattg cacgcaggtt ctc 23

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atcgggagcg gcgataccgt a 21

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

attactcgag cttcatttgg acagcatc 28

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

attaccatgg gtcaaacaag caaataagt 29