本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及從雷公藤中分離鑒定的新的抗炎松香烷型二萜糖苷tripterycosidec。

背景技術(shù)：

雷公藤(tripteryginumwilfordiihook.f)為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，又名黃檀根和斷腸草，其藥用部位為根。據(jù)《全國中草藥匯編》記載，雷公藤味苦、性辛、涼，有大毒。具有祛風(fēng)，解毒，殺蟲作用。外用治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，皮膚發(fā)癢，殺蛆蟲、孑孓，滅釘螺，毒鼠。雷公藤主要分布于福建、湖南和江西等地區(qū)。臨床常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、紅斑狼瘡等難治性免疫功能亢進疾病。目前有雷公藤片、雷公藤多苷片、雷公藤內(nèi)酯、雷公藤內(nèi)酯軟膏、雷公藤總萜片等國產(chǎn)藥品廣泛應(yīng)用于臨床，療效顯著。

雷公藤的抗炎有效成分主要有松香烷型二萜，目前報道的雷公藤中具有抗炎活性的松香烷型二萜基本為苷元化合物，如雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤內(nèi)酯酮和雷公藤氯內(nèi)酯醇等松香烷型二萜苷元。雷公藤中關(guān)于松香烷型二萜糖苷類化合物報道極少，而具有抗炎活性的松香烷型二萜糖苷還未見報道。為了進一步從雷公藤中發(fā)現(xiàn)新的抗炎活性成分，為新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)，發(fā)明人對雷公藤進行了化學(xué)成分的深入研究。結(jié)合抗炎藥效活性篩選，從雷公藤中分離鑒定了一種新的抗炎松香烷型二萜糖苷tripterycosidec。本發(fā)明首次公開了tripterycosidec的結(jié)構(gòu)、分離和鑒定以及在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所涉及的從雷公藤中提取分離鑒定的一種新的抗炎松香烷型二萜糖苷，命名為tripterycosidec，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式ⅰ。

式?。簍ripterycosidec結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明公開了tripterycosidec的結(jié)構(gòu)、分離和鑒定以及在制備抗炎藥物中的應(yīng)用，可為臨床炎癥治療提供新的藥物。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

一、提取分離

1．將雷公藤根切片，加入95%乙醇水溶液，加熱回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇得到總浸膏。將總浸膏用乙酸乙酯溶解數(shù)次至不再溶解，合并乙酸乙酯溶液，減壓濃縮回收乙酸乙酯得乙酸乙酯部位。

2．將乙酸乙酯部位經(jīng)中性氧化鋁色譜柱層析，用石油醚-乙酸乙酯（1:0，4:1，3:2，2:3，v/v）及乙酸乙酯-甲醇（1:0，3:1，1:1，0:1，v/v）依次梯度洗脫，依次得到8個洗脫流份，將乙酸乙酯-甲醇（1:1，v/v）洗脫流份減壓濃縮得中性氧化鋁色譜柱洗脫部位。

3．將中性氧化鋁色譜柱洗脫部位經(jīng)mcigel色譜柱層析，用甲醇-水（0:1，1:9，3:7，1:1，7:3，9:1，1:0，v/v）依次梯度洗脫，依次得到7個洗脫流份，將甲醇-水（7:3，v/v）洗脫流份減壓濃縮得mcigel色譜柱洗脫部位。

4．將mcigel色譜柱洗脫部位經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱分離，甲醇洗脫，tlc檢測合并，減壓濃縮依次得到9個流份，將第6個流份減壓濃縮得sephadexlh-20凝膠柱洗脫部位。

5．將sephadexlh-20凝膠柱洗脫部位經(jīng)制備hplc分離(ymc-actusods-ac18色譜柱，流動相：乙腈-水33:67，檢測波長210nm)，得化合物tripterycosidec。

二、結(jié)構(gòu)鑒定

tripterycosidec：黃色固體(溶劑甲醇)，根據(jù)hr-tof-ms（見附圖1）確定分子式為c26h32o10([m+h]⁺，實測值：m/z505.2064，理論計算值：m/z505.2068；[m-h]^-，實測值：m/z503.1902，理論計算值：m/z503.1923)。紫外光譜圖（220nm，274nm，373nm）和nmr顯示結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)。氫核磁共振譜（¹h-nmr）（見附圖2）和碳核磁共振譜（¹³c-nmr）（見附圖3）中顯示3個特征甲基(δh1.25，d，6.9hz，h-16；δh1.21，d，6.9hz，h-17；δh1.31，s，h-20)(δc22.7，c-16；δc22.6，c-17；δc17.4，c-20)和1個特征亞甲基(δh4.87，h-19)(δc72.2，c-19)（見表1），結(jié)合苯環(huán)結(jié)構(gòu)說明tripterycosidec為類似雷酚內(nèi)酯的松香烷型二萜類結(jié)構(gòu)。¹³c-nmr譜中6個碳信號（δc103.9，c-1’；δc75.3，c-2’；δc78.5，c-3’；δc71.6，c-4’；δc78.8，c-5’；δc62.7，c-6’)結(jié)合¹h-nmr譜中糖端基氫信號耦合常數(shù)（δh4.94，1h，d，j=7.6hz，h-1’）說明結(jié)構(gòu)中含有β-葡萄糖。除葡萄糖信號外，根據(jù)¹h-nmr和¹³c-nmr結(jié)合hsqc譜（見附圖4），確定化合物含有3個甲基，4個亞甲基，3個次甲基，10個季碳，其中1個苯環(huán)、另外1個雙鍵、1個酮羰基和1個酯羰基。根據(jù)分子式c26h32o10求得不飽和度為11，扣除6個雙鍵數(shù)，求得分子中含有5個環(huán)。分子式c26h32o10中含有10個氧原子，除1個葡萄糖和1個酯羰基的氧原子外，剩余2個氧原子分別屬于1個羥基和1個羰基。以上信息說明tripterycosidec含有雷酚內(nèi)酯、葡萄糖、羥基和羰基結(jié)構(gòu)。葡萄糖、羥基和羰基的取代位置可由hmbc相關(guān)圖譜（見式ⅱ和附圖5）確定，hmbc譜顯示葡萄糖端基質(zhì)子h-1’(δh4.94，d，7.6hz)與c-11(δc148.8)相關(guān)，說明葡萄糖與c-11相連。苯環(huán)上h-14(δh7.44，s)與c-15(δc27.8)，h-14(δh7.44，s)與c-8(δc116.7)，h-14(δh7.44，s)與c-9(δc137.4)，h-14(δh7.44，s)與c-12(δc158.6)，h-15(δh3.33，hept，6.9hz)與c-14(δc125.9)存在hmbc相關(guān)，說明苯環(huán)上c-14未被取代。結(jié)合h-15(δh3.33，hept，6.9hz)與c-12(δc158.6)等其它hmbc相關(guān)信號、¹h-nmr和¹³c-nmr化學(xué)位移數(shù)據(jù)，確定oh位于c-12位。根據(jù)h-5(δh3.31)與c-7(δc205.6)，h-6(δh3.33，t，6.9hz)與c-7(δc205.6)存在hmbc相關(guān)，確定羰基位于c-7位。紫外光譜圖（373nm）進一步支持羰基與苯環(huán)共軛，即羰基位于c-7位。綜上所述，tripterycosidec結(jié)構(gòu)確定如式ⅰ，經(jīng)查文獻確定tripterycosidec為新化合物。

式ⅱ：tripterycosidec的關(guān)鍵hmbc相關(guān)。

綜合¹h-nmr、¹³c-nmr、hsqc和hmbc譜，tripterycosidec的碳和氫核磁信號歸屬見表1。

表1.tripterycosidec的¹h-nmr和¹³c-nmr數(shù)據(jù)(600mhz，溶劑cd3od)

。

三、抗炎藥效學(xué)評價

本發(fā)明對tripterycosidec進行了抗炎藥效學(xué)評價。

1.tripterycosidec對脂多糖（lps）誘導(dǎo)的大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜原代成纖維細(xì)胞炎癥因子白介素1β（il-1β）過量表達的影響實驗。

1.1大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

雄性sd大鼠（180-220g）乙醚麻醉后處死，75%酒精浸泡15-20分鐘后，取出膝關(guān)節(jié)滑膜組織，剪碎，利用ii型膠原酶（4mg/ml）消化2h，加入含10%胎牛血清的rpmimedium1640培養(yǎng)，3天左右細(xì)胞慢慢爬出，待細(xì)胞長至融合狀態(tài)后，用0.25%胰酶（含0.1%的edta）消化2分鐘，細(xì)胞傳代繼續(xù)培養(yǎng)，原代細(xì)胞3-6代用于下面的實驗。

1.2測定tripterycosidec對lps誘導(dǎo)的膝關(guān)節(jié)滑膜原代成纖維細(xì)胞il-1β表達的影響

tripterycosidec用dmso溶解，溶解后母液濃度為10mm，臨用前用磷酸鹽緩沖液（pbs）稀釋到1mm，實驗終濃度為10μm。將細(xì)胞以2×10⁶個/ml的濃度接種于48孔板，37℃，5%co2條件下培養(yǎng)至80%的融合狀態(tài)，pbs洗滌兩次。換成無血清培養(yǎng)基，加入tripterycosidec溶液，使最終濃度為10μm，0.5h后，加入刺激劑lps（10ng/ml）。實驗分為空白組，模型組，tripterycosidec給藥組，陽性對照藥潑尼松龍給藥組(實驗終濃度為10μm)。模型組用刺激劑lps（10ng/ml）造模，給藥組加入對應(yīng)化合物，每組6個復(fù)孔，37℃，5%co2條件下孵育24小時后，按大鼠il-1βelisa試劑盒說明要求進行測定od值，檢測波長450nm。

1.3實驗結(jié)果

結(jié)果（見表2）表明，模型組il-1β表達與空白組比較有極顯著性升高（p<0.001），說明造模成功。tripterycosidec、潑尼松龍給藥組與模型組比較均有極顯著性差異（p<0.001），說明tripterycosidec能顯著抑制lps誘導(dǎo)的膝關(guān)節(jié)滑膜原代成纖維細(xì)胞炎癥因子il-1β的過量表達，抑制效果與陽性藥潑尼松龍相當(dāng)，說明tripterycosidec具有明顯的抗炎活性。

表2.tripterycosidec對lps誘導(dǎo)的滑膜原代成纖維細(xì)胞il-1β表達的影響(±s，n=6)

***與模型組比較p<0.001。

2.tripterycosidec對二甲苯引起的小鼠耳腫脹模型影響實驗

tripterycosidec用2%丙二醇水溶液溶解。取昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22g，隨機均分成模型組，tripterycosidec給藥組，陽性對照藥吲哚美辛給藥組，每組10只。各給藥組按10mg/kg劑量灌胃給藥，模型組給等體積2%丙二醇水溶液。連續(xù)給藥3天，末次給藥后1小時，將20μl二甲苯涂于小鼠右耳廓兩面致炎,左耳不涂為對照。1小時后將小鼠處死，剪下雙耳,用直徑6mm的打孔器分別在同一部位打下圓耳片,稱重。以左右耳片重量差作為腫脹度,計算抑制率。實驗結(jié)果見表3，各給藥組的平均耳腫脹度與模型組相比均有顯著性(p<0.01)差異，tripterycosidec抑制率為57.7%，其抑制率高于陽性藥吲哚美辛。實驗結(jié)果表明tripterycosidec具有顯著的抗炎活性，優(yōu)于陽性藥吲哚美辛。

表3.tripterycosidec對二甲苯引起的小鼠耳腫脹模型影響實驗結(jié)果(±s，n=10)

*與模型組比較p<0.01。

四、抗炎藥物制劑制備

tripterycosidec或以其為基本活性的藥物組合物可以與藥學(xué)上合適的輔料或載體結(jié)合，采用公知方法制成注射劑、片劑、膠囊劑、滴丸劑、控釋制劑、緩釋制劑、納米制劑等制劑抗炎藥物。

附圖說明

附圖1為tripterycosidec的hr-tof-ms（負(fù)離子模式）譜圖。

附圖2為tripterycosidec的¹h-nmr譜圖。

附圖3為tripterycosidec的¹³c-nmr譜圖。

附圖4為tripterycosidec的hsqc譜圖。

附圖5為tripterycosidec的hmbc譜圖。

具體實施方式

下面通過實施例作進一步描述，但本發(fā)明并不限于實施例所述范圍。

實施例1：

將雷公藤干燥根119千克切片，加入95%乙醇400升，于70℃加熱回流提取3次（1.5×1.5×1小時）。合并提取液，減壓濃縮回收溶劑得浸膏12kg。浸膏用乙酸乙酯溶解多次，合并乙酸乙酯溶液，減壓濃縮回收溶劑得乙酸乙酯部位1.87kg。

將乙酸乙酯部位浸膏1.87kg，經(jīng)中性氧化鋁柱色譜層析（200-300目，22.5kg），石油醚-乙酸乙酯（1:0，4:1，3:2，2:3，v/v）及乙酸乙酯-甲醇（1:0，3:1，1:1，0:1，v/v）梯度洗脫，每個流份收集50l，依次得到8個洗脫流份(fr.1~fr.8)。

將fr.7流份（即：上述乙酸乙酯-甲醇1:1洗脫流份）（15.6g）經(jīng)mcigel-chp20p色譜柱分離，甲醇-水（0:1，1:9，3:7，1:1，7:3，9:1，1:0，v/v）梯度洗脫，依次得7個洗脫流份（fr.7.1~fr.7.7）。

將fr.7.5（即：上述甲醇-水7:3洗脫流份）經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱分離，甲醇洗脫，tlc檢測合并依次得到9個流份（fr.7.5.1~fr.7.5.9）。

取fr.7.5.6（300mg）經(jīng)制備hplc分離(ymc-actusods-ac18色譜柱，流動相：乙腈-水33:67，檢測波長210nm)，得化合物tripterycosidec（保留時間13.52min）（6mg）。

實施例2：

tripterycosidec的片劑制備：取50mg化合物與淀粉25mg，糊精25mg混合，用適量30%乙醇濕潤，常規(guī)制粒，加入適量硬脂酸鎂混合，壓片，即得。

實施例3：

tripterycosidec的膠囊劑制備：取50mg化合物與淀粉60mg，糊精10mg，糖粉10mg混合，用適量30%乙醇濕潤，常規(guī)制粒，裝入硬膠囊中，即得。