本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及活性提高的α-淀粉酶AmyL突變體及其編碼基因和應用。

背景技術：

α-淀粉酶，系統(tǒng)名稱為1,4-α-D-葡聚糖水解酶，別名為液化型淀粉酶、液化酶、α-1，4-糊精酶。α-淀粉酶是一種內切水解酶，其主要作用是催化淀粉的1,4-α-D-葡聚糖生成還原性糊精和糖類，在淀粉、清潔劑、飲料和紡織等領域具有重要作用。

由于從自然界篩選得到的野生菌產的α-淀粉酶的活力一般都比較低，不能直接運用于工業(yè)化的發(fā)酵生產?，F有技術一般是通過對野生菌株進行誘變、雜交育種等技術手段來提高菌株的產酶能力。隨著分子生物學的迅速發(fā)展，基因工程育種技術越來越受到國內外研究者的青睞。

好鹽芽孢桿菌Bacillus salsusα-淀粉酶AmyL是一種中溫淀粉酶，本課題組通過一系列應用評價實驗發(fā)現AmyL在許多工業(yè)領域具有應用潛力。在造紙工業(yè)中，α-淀粉酶AmyL可以很好的改良紙張涂層淀粉的黏度和濃度，提高紙張的質量。飼料工業(yè)中，α-淀粉酶AmyL可以幫助幼齡動物消化利用淀粉，對其生長性能與飼料轉化率十分有益。雖然α-淀粉酶AmyL具有很大的應用潛力，但目前α-淀粉酶AmyL的生產活力低，發(fā)酵成本高。為了使好鹽芽孢桿菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL廣泛應用到眾多工業(yè)領域中，提高其比活力及表達水平，降低生產成本是急需解決的問題。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是通過對來源于好鹽芽孢桿菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL進行分子改造，改造后的α-淀粉酶具有更高的比活，降低生產成本，符合工業(yè)化大生產的要求。

本發(fā)明的目的是提供活性提高的α-淀粉酶AmyL突變體。

本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述α-淀粉酶AmyL突變體的基因。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述的活性提高的α-淀粉酶AmyL突變體基因的重組載體。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述的活性提高的α-淀粉酶AmyL突變體基因的重組菌株。

好鹽芽孢桿菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本發(fā)明采用易錯PCR及定點飽和突變的方法對SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶AmyL進行分子改造，經過高通量篩選得到高比活α-淀粉酶BsaAmy6，本發(fā)明的高比活α-淀粉酶BsaAmy6和原有的Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL相比，有7個氨基酸的差異，突變位點由+18N,+39S,+159Y,+220T,+281N,+363S,+474Y突變成+18D,+39N,+159D,+220K,+281D,+363C,+474K。突變后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

本發(fā)明還提供了上述突變α-淀粉酶BsaAmy6的基因序列，其堿基序列如SEQ ID NO.3所示：

本發(fā)明還提供了包含上述活性提高α-淀粉酶的重組載體，將本發(fā)明的活性提高α-淀粉酶基因BsaAmy6連接到酵母表達載體pPICzαA上的EcoR I和Not I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOX1啟動子的下游并受其調控，得到重組酵母表達質粒pPICzαA-BsaAmy6。

本發(fā)明還提供了包含上述活性提高α-淀粉酶基因BsaAmy6的重組菌株，優(yōu)選重組菌株是畢赤酵母菌株X33。

本發(fā)明還提供了表達上述活性提高的α-淀粉酶基因BsaAmy6的方法，包括以下步驟：

1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；

2)重組菌株進行發(fā)酵，誘導重組α-淀粉酶的表達；

3)發(fā)酵結束后，回收并純化所表達的α-淀粉酶BsaAmy6。

具體地，將重組表達質粒pPICzαA-BsaAmy6線性化后，轉化到畢赤酵母X33中，用高濃度的抗生素平板篩選轉化子，將篩選到的轉化子，首先在搖瓶培養(yǎng)條件下進行比較分析。將搖瓶培養(yǎng)篩選出來的的高酶活轉化子，再在50L的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，發(fā)酵過程中，每隔24h取發(fā)酵液測定OD₆₀₀以及菌體濕重，取上清液進行α-淀粉酶活性檢測。發(fā)酵結束最終平均發(fā)酵酶活達到36900U/mL，比出發(fā)菌的酶活提高41.5％，實現了重組α-淀粉酶BsaAmy6的高效表達。

本發(fā)明通過結合易錯PCR技術和高通量篩選技術對好鹽芽孢桿菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL進行分子改造。含有突變基因BsaAmy6的重組工程菌在50L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下的平均發(fā)酵酶活為36900U/mL，突變后的α-淀粉酶BsaAmy6的發(fā)酵酶活比AmyL提高41.5％。因此，本發(fā)明的突變α-淀粉酶BsaAmy6及重組工程菌，大大降低了發(fā)酵生產成本，使其在眾多工業(yè)領域中顯示出巨大的應用潛力。

附圖說明

圖1為α-淀粉酶AmyL和其突變體BsaAmy6的酵母菌株在50升發(fā)酵罐中酶活比較圖。

圖2突變體BsaAmy6和原始AmyL的最適反應pH

圖3突變體BsaAmy6和原始AmyL的pH穩(wěn)定性

圖4突變體BsaAmy6和原始AmyL的最適反應溫度

圖5突變體BsaAmy6和原始AmyL的熱穩(wěn)定性

具體實施方式

以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實驗材料和試劑：

1、菌株與載體

大腸桿菌菌株Topl0、畢赤酵母X33、載體pPICzαA，pGAPzαA,Zeocin購自Invitrogen公司。

2、酶與試劑盒

PCR酶，質粒提取，膠純化，限制性內切酶、試劑盒購自上海生工公司。

3、培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基為LB，配方為：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0。LBZ為LB培養(yǎng)基加25ug/mL Zeocin。

酵母培養(yǎng)基為YPD，配方為1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。酵母篩選培養(yǎng)基為YPDZ，配方為：YPD+100mg/L zeocin。

酵母誘導培養(yǎng)基BMGY，配方為1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))，BMMY，除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同。

重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基本鹽培養(yǎng)基：磷酸氫二銨5％、磷酸二氫鉀0.5％、七水硫酸鎂1.5％、硫酸鉀1.95％、硫酸鈣0.1％、氫氧化鉀0.1％、消泡劑0.03％。高壓后每升加4.35毫升PTM1。

PTM1(微量鹽溶液)：硫酸銅0.6％、碘化鉀0.018％、一水硫酸錳0.3％、二水鉬酸鈉0.02％、硼酸0.002％、六水氯化鈷0.05％、氯化鋅2％、七水硫酸鐵6.5％、濃硫酸0.5％、生物素0.02％。

實施例1、好鹽芽孢桿菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL基因合成及克隆

將已公布的好鹽芽孢桿菌Bacillus salsusα-淀粉酶AmyL氨基酸序列(Genebank：SDP85898)，根據畢赤酵母密碼子優(yōu)化后進行合成。

根據合成的基因分別在5’端和3’端設計PCR引物含EcoRI和NotI酶切酶位點，起引物序列如下：

5’端引物amyl-F1：5'-GTAGAATTC ATGAGACAGGTTAGAATTGCTTTTG-3'

3’端引物amyl-R1：5'-ACTGCGGCCGCTTATTTTTGTACATAAACTGAAACT-3'

以合成基因為模板，用上述引物進行PCR擴增，將擴增得到的片段克隆到載體pGAPzαA上，得到重組載體pGAPzαA-AMYL。

實施例2、基因易錯PCR隨機突變

以上述pGAPzαA-AMYL為模板，進行易錯PCR隨機突變擴增，具體地擴增方法是：

第一輪擴增：以載體啟動子引物amyl-F1和amyl-R1為引物進行PCR擴增，反應體系如下：

反應程序如下：

回收第一輪PCR產物，去1uL稀釋50-100倍用作第二輪PCR的模板。第二輪易錯PCR同樣以特異性引物amyl-F1及amyl-R1進行PCR反應。

取第二輪的產物用EcoRI和NotI進行雙酶切，連接至pGAPzαA載體上的。連接產物轉化畢赤酵母X33，在YPDZ瓊脂糖平板培養(yǎng)篩選突變菌株。

實施例3、高通量篩選高酶活突變菌株

從實施例2易錯PCR平板上挑取突變單菌落，將重組轉化子用牙簽逐個挑至24孔板，每個孔中加入1mL含有YPD培養(yǎng)基，30℃，220rpm培養(yǎng)48左右，離心取上清。將上述上清液分別取出200μL至96孔板，進行α-淀粉酶酶活測定。α-淀粉酶酶活檢測參照中華人民共和國國家標準《GB/T 24401-2009》進行測定。將酶活提高的8個陽性突變克隆，逐一提取基因組DNA，進行目的基因PCR擴增，確定突變位點。

測序結果確定氨基酸突變位點，克隆1的突變位點為+18N替換為+18D；克隆2的突變位點為+39S替換為+39N；克隆3的突變點為+141G替換為+141K；克隆4的突變點為+159Y替換為+159D；克隆5的突變點為+220T替換為+220K；克隆6的突變點為+363S替換為+363C；克隆7的突變點為+474Y替換為+474K。通過定點突變將這些突變位點一一進行結合，通過篩選最終得到一條高比活的α-淀粉酶突變基因BsaAmy6。本發(fā)明的高比活α-淀粉酶BsaAmy6和原有的Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL相比，有7個氨基酸的差異，突變位點由+18N,+39S,+159Y,+220T,+281N,+363S,+474Y突變成+18D,+39N,+159D,+220K,+281D,+363C,+474K。

實施例4、α-淀粉酶BsaAmy6表達載體的構建及工程菌株的篩選

用限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切純化含有BsaAmy6基因的DNA片段，連接到pPICzaA載體得到表達載體pPICzaA-BsaAmy6。將表達載體pPICzaA-BsaAmy6線性化，電擊轉入酵母X33，將轉化產物分別涂布固體培養(yǎng)平板，30℃培養(yǎng)2-3d。

實施例6、搖瓶及50L發(fā)酵罐培養(yǎng)

將平板上的酵母轉化子，接種于含有50mL BMGY培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃，250r/min振蕩過夜培養(yǎng)至OD600達到2～6。離心收集菌體，再將其重懸浮于BMMY培養(yǎng)基中，稀釋至OD600為1.0，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔24h向BMMY培養(yǎng)基中補加甲醇至終濃度為0.75％進行誘導表達，同時測定酶活。

將搖瓶培養(yǎng)篩選出來的重組工程菌，接種于100mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃、240rpm培養(yǎng)20h。以1：50的比例接種到300mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃、240rpm培養(yǎng)至OD600＝5，用以接種發(fā)酵罐。國產50L發(fā)酵罐，加入20L發(fā)酵基礎培養(yǎng)基，121℃滅菌20min，調節(jié)溫度至30℃，用氨水調節(jié)pH至5.0，加入PTMl(4.35mL/L)，接入種子菌(1：10)。發(fā)酵過程中，溫度控制在30℃，通氣量維持在2vvm，轉速控制在500-800rpm之間以維持溶氧20％以上。

發(fā)酵分為三個階段：生長期，從加入種子菌，培養(yǎng)約16-24h，直到將發(fā)酵罐中甘油耗盡，表現為溶氧突然上升；之后進入甘油促生長期，補加50％甘油(含有PTMl，1 2mL/L)，補料速度為18mL/L·h，持續(xù)4-6h；最后進入誘導期，用氨水或磷酸調節(jié)pH至所需值，流加100％甲醇(含有PTMl，12mL/L)，流速從1mL/L·h經15h線性升至4mL/L·h，持續(xù)120h。

發(fā)酵過程中，每隔24h取發(fā)酵液測定OD₆₀₀以及菌體濕重，取上清液進行α-淀粉酶活性檢測。含有突變基因BsaAmy6的重組工程菌在50L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下的平均發(fā)酵酶活為36900U/mL，突變后的α-淀粉酶BsaAmy6的發(fā)酵酶活比AmyL提高41.5％，發(fā)酵過程曲線如圖1所示。

實施例7、突變體BsaAmy6和原始AmyL的最適反應pH和pH穩(wěn)定性

參照國標方法測定原始AmyL及α-淀粉酶突變體BsaAmy6的最適反應pH。原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突變體BsaAmy6的最適pH如圖2所示。由圖2可知，突變體BsaAmy6的最適pH并沒有發(fā)生太大變化，幾乎和原始α-淀粉酶一樣。

將原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突變體BsaAmy6分別在pH4-8條件下室溫處理3小時，然后參照國標的方法測定酶活。原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突變體BsaAmy6的pH穩(wěn)定性如圖3所示。由圖3可知，相對于原始α-淀粉酶AmyL，突變體BsaAmy6在酸性條件下的穩(wěn)定性更好。在pH4和5條件下突變體BsaAmy6的剩余酶活分別為95％和98％，原始α-淀粉酶AmyL則分別為81％和87％。

實施例8、突變體BsaAmy6和原始AmyL的最適反應溫度和熱穩(wěn)定性

參照國標方法測定原始AmyL及α-淀粉酶突變體BsaAmy6的最適反應溫度。原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突變體BsaAmy6的最適反應溫度如圖4所示。由圖4可知，突變體BsaAmy6的最適反應溫度為65℃，原始AmyL的最適反應溫度為60℃。

將原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突變體BsaAmy6分別在50℃-90℃條件下水浴處理30分鐘，然后參照國標的方法測定酶活。原始α-淀粉酶AmyL及α-淀粉酶突變體BsaAmy6的熱穩(wěn)定性如圖5所示。由圖5可知，突變體BsaAmy6的熱穩(wěn)定性要好于原始α-淀粉酶AmyL。在80℃和90℃條件下水浴處理30分鐘后，突變體BsaAmy6的剩余酶活為80％和70％，而α-淀粉酶AmyL的剩余酶活為50％和40％。

<110> 廣東溢多利生物科技股份有限公司

<120> 活性提高的α-淀粉酶AmyL突變體及其編碼基因和應用

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<212> PRT

<213> 鹽地咸海鮮芽胞桿菌

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<213> 人工序列

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<212> DNA

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