本發(fā)明涉及利用多重PCR對四倍體紫花苜蓿進(jìn)行SSR分析的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

苜蓿(Medicago sativa)是全球溫帶地區(qū)最重要的飼草作物，兩個(gè)主栽的亞種(M.sativa subssp.sativa和M.sativa subssp.×varia)均為同源四倍體，自然異交，近交衰退嚴(yán)重。遺傳多樣性是植物育種和遺傳改良的基礎(chǔ)。由于大多數(shù)的紫花苜蓿品種是合成品種，由挑選的優(yōu)良單株及其子代連續(xù)隨機(jī)交配幾代而育成。因此，在進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)，一個(gè)苜蓿品種內(nèi)一般需取20～40個(gè)單株。當(dāng)研究品種較多時(shí)，常導(dǎo)致分析單位(基因型)的數(shù)量非常大。由于實(shí)際的工作量、經(jīng)費(fèi)、時(shí)間等因素的限制，這樣的研究計(jì)劃往往難以貫徹。現(xiàn)有相關(guān)研究中的分析單位(基因型)的數(shù)目一般不超過1000。

截至目前，已有多種分子標(biāo)記技術(shù)被用于苜蓿遺傳多樣性的研究中，如等位酶、種子貯藏蛋白、RFLP、RAPD、SSR、ISSR、EST-SSR等。其中，SSR(Simple sequence repeat，簡單序列重復(fù)；又稱Microsatellite DNA，微衛(wèi)星DNA)的應(yīng)用最為廣泛，主要原因是其具有較多的優(yōu)點(diǎn)：共顯性遺傳，可用于鑒別雜合子和純合子；標(biāo)記染色體定位明確，數(shù)量豐富；使用特異性引物，操作簡單，重復(fù)性好，可靠性高；對DNA的用量和純度要求不高。對于已開發(fā)出足夠SSR標(biāo)記的物種來說，其主要缺點(diǎn)是每次試驗(yàn)一般僅能分析一個(gè)SSR標(biāo)記，獲得一個(gè)位點(diǎn)的基因型信息。這在很大程度上限制了試驗(yàn)的規(guī)模，對于異交植物——苜蓿來說尤是如此。已有的遺傳多樣性研究大都使用較少的SSR標(biāo)記(＜50)或(和)分析較少的基因型(＜1000)。此外，一些已開發(fā)的SSR標(biāo)記還存在無效基因型(無帶或等位基因劑量難以確定)比率高與圖譜不易判讀等問題，這也在一定程度上限制了SSR在苜蓿遺傳多樣性研究中的應(yīng)用。因此，篩選優(yōu)良的SSR標(biāo)記，建立高通量的分析方法是獲得準(zhǔn)確的試驗(yàn)數(shù)據(jù)、提高試驗(yàn)效率的前提。

多重PCR(Multiplex PCR)技術(shù)由Chamberlain等于1998年提出，在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，針對多個(gè)DNA模板或同一個(gè)模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)，是對普通PCR技術(shù)的改進(jìn)。與單一基因分子標(biāo)記的PCR相比，多重PCR在一次PCR中可同時(shí)檢測幾個(gè)目標(biāo)基因，工作效率顯著提高，成本明顯降低。由于多重PCR技術(shù)具有以上優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，如病毒檢測、細(xì)菌檢測、禽流感檢測以及品質(zhì)性狀分子標(biāo)記等多個(gè)方面。

目前，多重PCR-SSR技術(shù)在植物上的研究還不夠深入，研究內(nèi)容大多集中在引物的篩選、多重PCR體系的建立和優(yōu)化；僅在甜菜、棉花、楊梅、辣椒等少數(shù)幾種植物上有較為深入的研究。但已有的研究均證明該方法可顯著提高單次SSR分析的信息量，降低利用SSR引物進(jìn)行大規(guī)模分析時(shí)的成本，縮短試驗(yàn)所需時(shí)間。目前，尚未見有關(guān)利用多重PCR-SSR對四倍體紫花苜蓿進(jìn)行遺傳多樣性分析的方法。本專利旨在篩選優(yōu)良的苜蓿SSR標(biāo)記，并建立基于多重PCR的高通量分析方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用多重PCR技術(shù)對四倍體紫花苜蓿進(jìn)行SSR分析的方法。

本發(fā)明技術(shù)方案概述如下：首先篩選出24對SSR引物，通過優(yōu)化組合成9個(gè)PCR組；然后在一個(gè)PCR反應(yīng)管中加入同屬一組但濃度不同的2-3對SSR特異性引物對，采用不同的反應(yīng)體系同時(shí)對同一個(gè)模板的不同區(qū)域擴(kuò)增出多個(gè)目的片段；最后通過一次電泳將不同引物的多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物加以分離。

具體地，本發(fā)明技術(shù)方案包括以下步驟：

1、篩選出24對SSR引物

根據(jù)已有的文獻(xiàn)資料，綜合考慮PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件，引物在染色體上的分布情況，條帶的大小、清晰度和多態(tài)性，基因型的準(zhǔn)確率和穩(wěn)定性等因素，篩選出24對SSR引物。下表為篩選出的SSR引物SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：48(其中SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2為一對正、反向引物對，依此順序類推)。

表1適用于紫花苜蓿多重PCR的SSR引物

2、多重PCR

依據(jù)上述引物各自的特征，優(yōu)化組合成9個(gè)PCR組。在一個(gè)PCR反應(yīng)管中加入同屬一組的2-3對SSR特異性引物對，針對同一個(gè)DNA模板構(gòu)成多個(gè)不同反應(yīng)體系，并按照同一PCR擴(kuò)增程序完成多重PCR。多重PCR反應(yīng)的分組及引物濃度見表2。

表2多重PCR的分組

注：引物濃度均指正、反向引物各自的濃度

進(jìn)一步地，所述反應(yīng)體系包含以下組分：模板DNA 1.0～2.5ng/μL，Taq DNA聚合酶0.03～0.10U/μL，dNTPs 0.20～0.35mM，1×PCR Buffer(含1.5mM MgCl2)，引物濃度0.085～0.285μM，去離子水補(bǔ)至15μL。

進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增程序包括以下步驟：

(1)合成表1中的24對引物；

(2)按照表2設(shè)置9個(gè)PCR組，并按如下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；

72℃延伸8min，4℃保存。

3、電泳檢測

采用常規(guī)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：

1)通過9個(gè)PCR反應(yīng)，得到了24個(gè)SSR標(biāo)記的圖譜數(shù)據(jù)。分析過程中，模板DNA、Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR反應(yīng)管等藥品與耗材的用量平均降為單引物PCR的37.5％(9/24)，從執(zhí)行PCR操作開始至電泳加樣的時(shí)間也縮短為單引物PCR的37.5％(9/24)。

2)準(zhǔn)確性：標(biāo)記的基因型易于辨識，讀取數(shù)據(jù)快；所選出的SSR標(biāo)記在染色體上分布均勻，平均基因型準(zhǔn)確率高于95％，遺傳多樣性分析的結(jié)果可靠。

附圖說明

圖1：A組3對引物對12個(gè)WL323苜蓿單株的擴(kuò)增圖譜；其中：M為Marker，1-12為不同苜蓿單株的擴(kuò)增結(jié)果。

圖2：H組2對引物對12個(gè)阿爾岡金苜蓿單株的擴(kuò)增圖譜；其中：M為Marker，1-12為不同苜蓿單株的擴(kuò)增結(jié)果。

圖3：D組3對引物對12個(gè)中苜1號苜蓿單株的擴(kuò)增圖譜；其中：M為Marker，1-12為不同苜蓿單株的擴(kuò)增結(jié)果。

圖4：B組3對引物對12個(gè)牧歌苜蓿單株的擴(kuò)增圖譜；其中：M為Marker，1-12為不同苜蓿單株的擴(kuò)增結(jié)果。

圖5：C組3對引物對12個(gè)三得利苜蓿單株的擴(kuò)增圖譜；其中：M為Marker，1-12為不同苜蓿單株的擴(kuò)增結(jié)果。

圖6：E組3對引物對12個(gè)維多利亞苜蓿單株的擴(kuò)增圖譜；其中：M為Marker，1-12為不同苜蓿單株的擴(kuò)增結(jié)果。

圖7：F組3對引物對12個(gè)馴鹿苜蓿單株的擴(kuò)增圖譜；其中：M為Marker，1-12為不同苜蓿單株的擴(kuò)增結(jié)果。

圖8：G組2對引物對12個(gè)保定苜蓿單株的擴(kuò)增圖譜；其中：M為Marker，1-12為不同苜蓿單株的擴(kuò)增結(jié)果。

圖9：I組2對引物對12個(gè)隴東苜蓿單株的擴(kuò)增圖譜；其中：M為Marker，1-12為不同苜蓿單株的擴(kuò)增結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

以下實(shí)施例中選用的苜蓿品種應(yīng)理解為示例性的，本發(fā)明方法對于目前已知的所有紫花苜蓿品種均適用。

實(shí)施例1：

1、基因組DNA的提取及引物合成

以紫花苜蓿品種WL323為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取12個(gè)單株，剪取足量幼嫩葉片，液氮冷凍研磨后，采用Doyle等人的CTAB法提取基因組DNA，以λDNA作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用0.8％瓊脂糖凝膠對基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行電泳檢測。

按照表1中的引物序列合成A組引物BBI131F、GBG230和E776153。

2、多重PCR

(1)反應(yīng)體系包含以下組分：

模板DNA 1.5ng/μL，Taq DNA聚合酶0.035U/μL，dNTPs 0.25mM，1×PCR Buffer(含1.5mM MgCl2)，引物BBI131F、GBG230和E776153的濃度分別為0.145μM、0.170μM和0.135μM(正反向引物濃度相同)，去離子水補(bǔ)至15μL。

(2)按如下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；

72℃延伸8min，4℃保存。

3、電泳檢測

采用常規(guī)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。圖1為A組3對引物(BBI131、GBG230和E776153)的擴(kuò)增圖譜。從圖1可以看出3對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、多態(tài)位點(diǎn)豐富，相互之間很容易區(qū)分。以a3為例，從上到下共有4條帶，相當(dāng)于4個(gè)等位基因，分別命名為a、b、c、d，則12個(gè)樣品的基因型依次為：bccc、aadd、abcd、cccd、bbdd、aaab、abbd、abcd、accd、addd、cccc、bccd。

實(shí)施例2：

1、基因組DNA的提取及引物合成

以紫花苜蓿品種阿爾岡金為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取12個(gè)單株，剪取足量幼嫩葉片，液氮冷凍研磨后，采用Doyle等人的CTAB法提取基因組DNA，以λDNA作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用0.8％瓊脂糖凝膠對基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行電泳檢測。

按照表1中的引物序列合成H組引物CBF96和GAW212。

2、多重PCR

(1)反應(yīng)體系包含以下組分：

模板DNA 1.5ng/μL，Taq DNA聚合酶0.035U/μL，dNTPs 0.25mM，1×PCR Buffer(含1.5mM MgCl2)，引物CBF96和GAW212分別為0.160μM和0.140μM(正反向引物濃度相同)，去離子水補(bǔ)至15μL。

(2)按如下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；

72℃延伸8min，4℃保存

3、電泳檢測

采用常規(guī)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。圖2為H組引物CBF96和GAW212的擴(kuò)增圖譜。從圖2可以看出這兩對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、多態(tài)位點(diǎn)豐富，相互之間很容易區(qū)分。以h1為例，從上到下共有6條帶，相當(dāng)于6個(gè)等位基因，分別命名為a、b、c、d、e、f，則12個(gè)樣品的基因型依次為：ccce、abee、bbee、eeee、eeef、adee、abde、ddee、aabd、acde、abee、bbdd。

實(shí)施例3：

1、基因組DNA的提取及引物合成

以紫花苜蓿品種中苜1號為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取12個(gè)單株，剪取足量幼嫩葉片，液氮冷凍研磨后，采用Doyle等人的CTAB法提取基因組DNA，以λDNA作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用0.8％瓊脂糖凝膠對基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行電泳檢測。

按照表1中的引物序列合成D組引物GBF56、CAW306和BBG28。

2、多重PCR

(1)反應(yīng)體系包含以下組分：

模板DNA 1.5ng/μL，Taq DNA聚合酶0.035U/μL，dNTPs 0.25mM，1×PCR Buffer(含1.5mM MgCl2)，引物GBF56、CAW306和BBG28分別為0.285μM、0.115μM和0.125μM(正反向引物濃度相同)，去離子水補(bǔ)至15μL。

(2)按如下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；

72℃延伸8min，4℃保存

3、電泳檢測

采用常規(guī)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。圖3為D組3對引物GBF56、CAW306和BBG28的擴(kuò)增圖譜。從圖中可以看出這3對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、多態(tài)位點(diǎn)豐富，相互之間很容易區(qū)分。以d2為例，從上到下共有5條帶，相當(dāng)于5個(gè)等位基因，分別命名為a、b、c、d、e，則12個(gè)樣品的基因型依次為：bcde、acde、bcde、ccdd、abce、dddd、ccde、abbd、cddd、acdd、bdde、bcde。

實(shí)施例4：

1、基因組DNA的提取及引物合成

以紫花苜蓿品種牧歌為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取12個(gè)單株，剪取足量幼嫩葉片，液氮冷凍研磨后，采用Doyle等人的CTAB法提取基因組DNA，以λDNA作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用0.8％瓊脂糖凝膠對基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行電泳檢測。

按照表1中的引物序列合成B組引物DMt1H10、CBF156和DBI28。

2、多重PCR

(1)反應(yīng)體系包含以下組分：

模板DNA 1.5ng/μL，Taq DNA聚合酶0.035U/μL，dNTPs 0.25mM，1×PCR Buffer(含1.5mM MgCl2)，引物DMt1H10、CBF156和DBI28分別為0.225μM、0.105μM和0.120μM(正反向引物濃度相同)，去離子水補(bǔ)至15μL。

(2)按如下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；

72℃延伸8min，4℃保存

3、電泳檢測

采用常規(guī)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。圖4為B組3對引物DMt1H10、CBF156和DBI28的擴(kuò)增圖譜。從圖中可以看出這3對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、多態(tài)位點(diǎn)豐富，相互之間很容易區(qū)分。以b3為例，從上到下共有8條帶，相當(dāng)于8個(gè)等位基因，分別命名為a、b、c、d、e、f、g、h，則12個(gè)樣品的基因型依次為：dggg、eeef、eefg、abgh、ccee、ddef、efhh、adde、aabg、eeeh、deeh、bdee。

實(shí)施例5：

1、基因組DNA的提取及引物合成

以紫花苜蓿品種三得利為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取12個(gè)單株，剪取足量幼嫩葉片，液氮冷凍研磨后，采用Doyle等人的CTAB法提取基因組DNA，以λDNA作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用0.8％瓊脂糖凝膠對基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行電泳檢測。

按照表1中的引物序列合成C組引物ABE93、CIC338和AMTIC95。

2、多重PCR

(1)反應(yīng)體系包含以下組分：

模板DNA 1.5ng/μL，Taq DNA聚合酶0.035U/μL，dNTPs 0.25mM，1×PCR Buffer(含1.5mM MgCl2)，引物ABE93、CIC338和AMTIC95分別為0.235μM、0.150μM和0.140μM(正反向引物濃度相同)，去離子水補(bǔ)至15μL。

(2)按如下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；

72℃延伸8min，4℃保存

3、電泳檢測

采用常規(guī)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。圖5為C組3對引物ABE93、CIC338和AMTIC95的擴(kuò)增圖譜。從圖中可以看出這3對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、多態(tài)位點(diǎn)豐富，相互之間很容易區(qū)分。以c3為例，從上到下共有5條帶，相當(dāng)于5個(gè)等位基因，分別命名為a、b、c、d、e，則12個(gè)樣品的基因型依次為：beee、aace、aaae、bdde、bcce、bbbe、abee、bccc、ccee、abcd、bcee、ccce。

實(shí)施例6：

1、基因組DNA的提取及引物合成

以紫花苜蓿品種維多利亞為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取12個(gè)單株，剪取足量幼嫩葉片，液氮冷凍研磨后，采用Doyle等人的CTAB法提取基因組DNA，以λDNA作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用0.8％瓊脂糖凝膠對基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行電泳檢測。

按照表1中的引物序列合成E組引物HAW178、AAW365和HAL82。

2、多重PCR

(1)反應(yīng)體系包含以下組分：

模板DNA 1.5ng/μL，Taq DNA聚合酶0.035U/μL，dNTPs 0.25mM，1×PCR Buffer(含1.5mM MgCl2)，引物HAW178、AAW365和HAL82分別為0.205μM、0.100μM和0.145μM(正反向引物濃度相同)，去離子水補(bǔ)至15μL。

(2)按如下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；

72℃延伸8min，4℃保存

3、電泳檢測

采用常規(guī)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。圖6為E組3對引物HAW178、AAW365和HAL82的擴(kuò)增圖譜。從圖中可以看出這3對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、多態(tài)位點(diǎn)豐富，相互之間很容易區(qū)分。以e1為例，從上到下共有7條帶，相當(dāng)于7個(gè)等位基因，分別命名為a、b、c、d、e、f、g，則12個(gè)樣品的基因型依次為：gggg、fggg、fggg、cfgg、bggg、dfgg、aefg、bdff、bdfg、ffgg、bdgg、bggg。

實(shí)施例7：

1、基因組DNA的提取及引物合成

以紫花苜蓿品種馴鹿為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取12個(gè)單株，剪取足量幼嫩葉片，液氮冷凍研磨后，采用Doyle等人的CTAB法提取基因組DNA，以λDNA作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用0.8％瓊脂糖凝膠對基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行電泳檢測。

按照表1中的引物序列合成F組引物DAW289、DBE84和BBG280。

2、多重PCR

(1)反應(yīng)體系包含以下組分：

模板DNA 1.5ng/μL，Taq DNA聚合酶0.035U/μL，dNTPs 0.25mM，1×PCR Buffer(含1.5mM MgCl2)，引物DAW289、DBE84和BBG280分別為0.160μM、0.205μM和0.160μM正反向引物濃度相同)，去離子水補(bǔ)至15μL。

(2)按如下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；

72℃延伸8min，4℃保存

3、電泳檢測

采用常規(guī)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。圖7為F組3對引物DAW289、DBE84和BBG280的擴(kuò)增圖譜。從圖中可以看出這3對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、多態(tài)位點(diǎn)豐富，相互之間很容易區(qū)分。以f2為例，從上到下共有5條帶，相當(dāng)于5個(gè)等位基因，分別命名為a、b、c、d、e，則12個(gè)樣品的基因型依次為：abbd、aabe、aaae、aaaa、aaad、ccce、accc、aaaa、aaac、aadd、bbcc、aabc。

實(shí)施例8：

1、基因組DNA的提取及引物合成

以紫花苜蓿品種保定為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取12個(gè)單株，剪取足量幼嫩葉片，液氮冷凍研磨后，采用Doyle等人的CTAB法提取基因組DNA，以λDNA作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用0.8％瓊脂糖凝膠對基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行電泳檢測。

按照表1中的引物序列合成G組引物HMt1G03和FAW115。

2、多重PCR

(1)反應(yīng)體系包含以下組分：

模板DNA 1.5ng/μL，Taq DNA聚合酶0.035U/μL，dNTPs 0.25mM，1×PCR Buffer(含1.5mM MgCl2)，引物HMt1G03和FAW115分別為0.195μM和0.105μM(正反向引物濃度相同)，去離子水補(bǔ)至15μL。

(2)按如下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；

72℃延伸8min，4℃保存

3、電泳檢測

采用常規(guī)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。圖8為G組2對引物HMt1G03和FAW115的擴(kuò)增圖譜。從圖中可以看出這3對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、多態(tài)位點(diǎn)豐富，相互之間很容易區(qū)分。以g2為例，從上到下共有7條帶，相當(dāng)于7個(gè)等位基因，分別命名為a、b、c、d、e、f、g，則12個(gè)樣品的基因型依次為：ddfg、ccgg、accc、bddd、aade、cccd、cceg、abbd、addd、ddfg、adee、dddd。

實(shí)施例9：

1、基因組DNA的提取及引物合成

以紫花苜蓿品種隴東為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取12個(gè)單株，剪取足量幼嫩葉片，液氮冷凍研磨后，采用Doyle等人的CTAB法提取基因組DNA，以λDNA作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用0.8％瓊脂糖凝膠對基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行電泳檢測。

按照表1中的引物序列合成I組引物GBG288和BBG238。

2、多重PCR

(1)反應(yīng)體系包含以下組分：

模板DNA 1.5ng/μL，Taq DNA聚合酶0.035U/μL，dNTPs 0.25mM，1×PCR Buffer(含1.5mM MgCl2)，引物GBG288和BBG238分別為0.085μM和0.215μM(正反向引物濃度相同)，去離子水補(bǔ)至15μL。

(2)按如下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；

72℃延伸8min，4℃保存

3、電泳檢測

采用常規(guī)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。圖9為I組2對引物GBG288和BBG238的擴(kuò)增圖譜。從圖中可以看出這2對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、多態(tài)位點(diǎn)豐富，相互之間很容易區(qū)分。以i1為例，從上到下共有5條帶，相當(dāng)于7個(gè)等位基因，分別命名為a、b、c、d、e、f、g，則12個(gè)樣品的基因型依次為：ccdf、ccef、dddf、deeg、dddd、eeeg、addf、bdef、bcdd、abdd、cdef、deeg。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津農(nóng)學(xué)院

<120> 一種利用多重PCR對四倍體紫花苜蓿進(jìn)行SSR分析的方法

<130> 2017

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttttaggag aaggaggaga cg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caataatcaa caacggcaga ag 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgcggtgtt tattgtaaga tg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggttattgca ggttttggac tt 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgggtggagg aaattacgac 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccacatatgt tgctgtttcc a 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgttgtgggc atgtctcatt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cactctccac ttgccatcct 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tggtcctcat tcttcaacag ag 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgtcatcgta tttggaactg aa 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgaaccaact gcacgaagag 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agcgaatgat ttctttgcgt a 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttgtaatgga ggaggtttca cc 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agaaaatggt tacggtcgaa ga 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tccccttaag cttcactctt ttc 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cattggtgga cgaggtctct 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aaaggtgttg ggttttgtgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aggaaggaga gggacgaaag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tctcacaccc caaaaacaca 20

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcaaagttgt tgttctgctt gaa 23

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gcatttccct ctctttccat aa 22

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtgttcgtcg catatcacct c 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gagcaaaggg gtttgtctca 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gcaactccag ctgcatcttt 20

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ttgcctcaac ctctgctaat tc 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gccgaagagc ctttgatagt aa 22

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

caccactatc tcttccctca cc 22

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tgttggtaat gttcaagctc ca 22

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ccgaatgaga gcaaccattt 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ttgatcaaca gcgaatcgag 20

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

acgaggcaca cactctctct ct 22

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ggtgctttca ttacatccca ta 22

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tccgaaccct acttccaaat ta 22

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tgggatactg attttctgct tc 22

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tcagcagtta gttttggtat gc 22

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

tgttgaagtt ggagttttgg tg 22

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

aaagagattg ggtcggtgaa 20

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tggttgatca atgttcctcc t 21

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

accaaaccca cttcccatct 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ttgaagttgg tggaacagca 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

cgatctggct tgaggatagg 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ggcagggcta agcttctcat 20

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gtcgaaatgg ttgcttctct tt 22

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ggttagggtt ttgggtttga a 21

<210> 45

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

gaaggagaaa aggtgagggt tt 22

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tcggatgatg atgaagaagt gt 22

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ccggctcaac gatccagt 18

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

agtgggaatt ggagggtca 19