一、技術領域
本發(fā)明涉及一種caco-2和huvec細胞共培養(yǎng)體系的構建方法，屬于生物技術領域。
二、
背景技術：
人結腸癌細胞(humancolonadenocarcinomacelllines，簡稱caco-2細胞)具有與小腸上皮細胞相同的微絨毛結構和緊密連接，含有與小腸刷狀緣上皮相關的代謝酶系、糖類、氨基酸、p450同工酶及各種主動轉運的載體，是用于研究腸道吸收轉運機制的經(jīng)典模型。
人臍靜脈血管內皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells，簡稱huvec)是從正常人體臍帶分離得到的靜脈血管內皮細胞，含有大量的細胞質內含物、平滑肌肌動球蛋白、abg抗原，具有多種生理功能，能產(chǎn)生和分泌許多生物活性物質，在維持血管舒縮，抗凝血等方面起重要作用，是循環(huán)系統(tǒng)和內皮組織生理、藥理研究中廣泛應用的細胞模型。
生物利用度(bioavailability)廣義說包括消化、吸收、代謝、分布、排泄以及發(fā)揮的生物活性(bioactivity)，而狹義的生物利用度是僅指營養(yǎng)物質被機體吸收進入循環(huán)的相對量和速率，應是生物吸收率(bioaccessibility)。通常人們采用caco-2腸道細胞研究藥物的生物利用，然而這僅僅反映的是腸道的吸收轉運機制，忽略了藥物在體內代謝后真正達到的生理作用。生物利用首要的是吸收，但最關鍵的還是保證其在體內發(fā)揮生物活性作用。因此，需要一種既可以反映吸收又可以反映生理活性的細胞模型來研究生物利用度。
細胞共培養(yǎng)技術是將兩種或多種的細胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，由于具有更好地反映體內環(huán)境的優(yōu)點，這種方法被廣泛應用于現(xiàn)代細胞研究中。細胞共培養(yǎng)體系主要通過兩種方式建立：①接觸共培養(yǎng)體系，即將兩種細胞同時或分別接種于同一載體上，不同種類的細胞之間直接接觸；②非接觸共培養(yǎng)體系，即將兩種細胞分別接種于不同的載體上，然后將這兩種載體置于同一培養(yǎng)環(huán)境之中，使不同種類的細胞共用同一種培養(yǎng)體系而不直接接觸。細胞共培養(yǎng)體系模擬細胞間相互作用，包括分泌生長因子發(fā)揮作用，可以用于誘導細胞分化、維持細胞功能和活力、調控細胞增殖、促進早期胚胎發(fā)育和提高代謝物產(chǎn)量。huvec/纖維母細胞共培養(yǎng)體系用于研究花青素對血管生成的影響，huvec/jurkat細胞共培養(yǎng)體系用于研究葡萄籽原花青素對t細胞與內皮細胞的粘附特性。尚未見把研究吸收的caco-2細胞模型與研究藥理功能的huvec細胞模型結合起來全面反映藥物生物利用度的體外細胞模型方面的報道。
三、
技術實現(xiàn)要素：
技術問題本發(fā)明主要是涉及一種caco-2和huvec細胞共培養(yǎng)體系的構建方法，該共培養(yǎng)體系可以提供一種反映藥物生物利用度的體外細胞模型。
技術方案本發(fā)明包括了以下步驟：
1)將25～40代的caco-2細胞用dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，ph7.4)于37℃、5％co2環(huán)境培養(yǎng)，將對數(shù)生長期caco-2細胞接種到transwell板上層，培養(yǎng)至細胞完全分化，采用電位儀監(jiān)測caco-2細胞層的電阻值teer大于550ω·cm2。
2)將2～6代的huvec細胞用dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、100μg/ml血管內皮細胞生長因子、2％青霉素-鏈霉素雙抗液，ph7.4)于37℃、5％co2環(huán)境培養(yǎng)，將對數(shù)生長期huvec細胞接種到transwell板下層，至細胞長滿80～90％。
3)將分化完全的caco-2細胞transwell上層小室插入到培養(yǎng)好的huvec細胞transwell下層小室中，微調整dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100μg/ml血管內皮細胞生長因子、2％青霉素-鏈霉素雙抗液，ph7.4)，于37℃、5％co2環(huán)境非接觸共同培養(yǎng)。
有益效果
本發(fā)明旨在構建一種caco-2/huvec細胞共培養(yǎng)體系，用于提供一種反映藥物生物利用度的體外細胞模型。
傳統(tǒng)的caco-2細胞模型適用于腸道吸收轉運機制與代謝研究，僅反映腸道吸收代謝，不考慮體內活性。傳統(tǒng)的huvec細胞模型適用于循環(huán)系統(tǒng)和內皮組織生理、藥理研究，僅反映活性機理，不考慮體內消化吸收與代謝。本發(fā)明打破單一研究吸收代謝或生理活性的固有思路，把研究吸收的caco-2模型與研究藥理功能的huvec細胞結合起來，采用非接觸式共培養(yǎng)方式搭建caco-2/huvec共培養(yǎng)體系。通過微調整共培養(yǎng)所用的dmem培養(yǎng)基，既適于caco-2生長，又適于huvec生長。共培養(yǎng)體系包含兩種細胞的吸收轉運載體和代謝酶系、與生理活性相關因子與酶系，此外兩種細胞可以通過transwell跨膜交換胞外分泌物質。caco-2模仿腸道層，huvec模擬循環(huán)系統(tǒng)血管層，適宜用來研究物質的腸道與循環(huán)系統(tǒng)的吸收轉運機制、代謝情況及生理活性。該體系能夠同時研究藥物的吸收代謝和生理活性，更好地模擬了藥物經(jīng)腸道吸收代謝后在循環(huán)系統(tǒng)的藥理作用，全面反映生物利用，提供了一種更真實反映藥物生物利用度的體外細胞模型。
附圖說明
圖1transwell非接觸式共培養(yǎng)示意圖
四、具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明：
實施例1
將25～40代的caco-2細胞用dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，ph7.4)于37℃、5％co2環(huán)境培養(yǎng)，隔天換液，每3天用0.25％胰酶/0.53mmol/ledta溶液消化細胞，按1∶3的比例傳代。將對數(shù)生長期細胞按1×105/ml接種到24孔transwell板上層，培養(yǎng)至21天，用電位儀測caco-2細胞層的電阻值teer大于550ω·cm2，細胞完全分化。將2～6代的huvec細胞用dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、100μg/ml血管內皮細胞生長因子、2％青霉素-鏈霉素雙抗液，ph7.4)于37℃、5％co2環(huán)境培養(yǎng)，隔天換液，用0.25％胰酶/0.1％edta溶液消化細胞，按1∶3的比例傳代。將對數(shù)生長期細胞按1×105/ml接種到24孔用明膠包被好的transwell板下層，至細胞長滿至細胞長滿80～90％。分化完全的caco-2細胞transwell上層小室插入到培養(yǎng)好的huvec細胞transwell下層小室中，微調整dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100μg/ml血管內皮細胞生長因子、2％青霉素-鏈霉素雙抗液，ph7.4)，于37℃、5％co2環(huán)境非接觸共同培養(yǎng)，mtt法檢測細胞存活率大于95％，caco-2/huvec細胞共培養(yǎng)體系構建完成，用于研究藍莓花青素經(jīng)腸道吸收后在血管內皮細胞中的生物利用度。