本發(fā)明屬于生化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用固相堿解法從動(dòng)物軟骨中提取得到硫酸軟骨素鈉的方法。
背景技術(shù)：
硫酸軟骨素是一種酸性粘多糖，臨床上主要用于治療神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)炎、耳鳴以及促進(jìn)潰瘍愈合和防治高血脂癥等。
硫酸軟骨素廣泛存在于動(dòng)物的軟骨組織中，目前是以提取法生產(chǎn)，由于提取過(guò)程大多在有NaOH存在的條件下進(jìn)行，所以最終產(chǎn)品通常以硫酸軟骨素鈉的形式得到。動(dòng)物軟骨中的硫酸軟骨素通常是以共價(jià)鍵連接在蛋白質(zhì)分子上形成了蛋白聚糖，因此，在提取硫酸軟骨素時(shí)首先必須將它從蛋白質(zhì)分子上解離下來(lái)，然后將雜質(zhì)蛋白分子變性分離除去。目前常用的提取方法有稀堿－酶解提取法、濃堿—復(fù)合酶酶解提取法、以及雙酶酶解法等。這些提取方法都是在液相中進(jìn)行，通常是先將洗凈的動(dòng)物軟骨進(jìn)行2～3hr的堿解，接著在特定的溫度和pH下進(jìn)行5hr左右的酶解反應(yīng)，在酶的催化作用下糖肽鍵斷裂，硫酸軟骨素從蛋白質(zhì)中游離出來(lái)，過(guò)濾除去雜質(zhì)蛋白，提取液經(jīng)醇沉后得到硫酸軟骨素鈉?？梢钥闯觯@些方法存在著工藝過(guò)程繁瑣、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、廢液污染大的不足。
固相反應(yīng)是指所有包含固相物質(zhì)參加的化學(xué)反應(yīng)，固相反應(yīng)不需要使用溶劑，具有高選擇性、高產(chǎn)率、工藝過(guò)程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為人們制備新型材料的重要方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的從動(dòng)物軟骨中提取硫酸軟骨素鈉的方法，是以固相堿解法，在室溫下，存在或不存在固相反應(yīng)促進(jìn)劑，將動(dòng)物軟骨粉與NaOH、NaCl混合，在機(jī)械力的作用下發(fā)生反應(yīng)10～60min，然后用水溶解反應(yīng)混合物中的硫酸軟骨素鈉，用無(wú)機(jī)酸調(diào)節(jié)體系的pH為5.5～7.5，濾去殘?jiān)?，濾液中加入乙醇析出固體、過(guò)濾、將固體用乙醇洗滌并干燥后得到成品硫酸軟骨素鈉；
所述的無(wú)機(jī)酸通常用硫酸或者鹽酸，推薦采用0.5-2M的硫酸或者鹽酸水溶液，如采用1M鹽酸則調(diào)節(jié)體系的pH為接近中性。
所述的固相反應(yīng)促進(jìn)劑選自Al2O3、ZrO2、SiO2、SiC或SiN的一種或幾種混合促進(jìn)劑，推薦為Al2O3，最好它們的顆粒度為100～300目。
所述的動(dòng)物軟骨粉、NaOH、NaCl和固相反應(yīng)促進(jìn)劑的質(zhì)量比為1：0.05-0.5:0.1-0.8:0-3。推薦動(dòng)物軟骨粉、NaOH、NaCl和固相反應(yīng)促進(jìn)劑的質(zhì)量比為1：0.1-0.5:0.2-0.6:0.5-2。
前述的機(jī)械力為研磨、捶打。所述的研磨、捶打是在研缽、高速球磨機(jī)、研磨粉碎機(jī)中進(jìn)行。
所述的水溶解反應(yīng)混合物中的硫酸軟骨素鈉，系將固相反應(yīng)混合物用水分散，其中每1Kg反應(yīng)混合物加2～8L水。
所述的濾液中加入乙醇，是在攪拌下，向?yàn)V液中滴加乙醇產(chǎn)生沉淀，其中，加入乙醇的體積為濾液體積的1.8～3.0倍，乙醇滴加完后靜置陳化8～14hr。過(guò)濾，濾餅用少量乙醇洗滌2～3遍，60℃真空干燥8hr，得到白色疏松的硫酸軟骨素鈉粉體。
采用本發(fā)明方法時(shí)，所述的動(dòng)物軟骨粉推薦采用豬鼻軟骨粉，軟骨粉由以下工藝獲得：
將軟骨清洗干凈，除去殘留的碎肉和筋膜，然后用蒸煮法或者溶劑浸泡法除去油脂，干燥并粉碎得到顆粒度為100～300目的脫脂軟骨粉。
其中，采用蒸煮法時(shí)，蒸煮溫度≥70℃，蒸煮時(shí)間20～60min，蒸煮結(jié)束后，趁熱將軟骨濾出，干燥，粉碎；
采用溶劑浸泡法時(shí)，選擇能夠溶解油脂的溶劑浸泡2～5hr，浸泡結(jié)束后，將軟骨濾出，干燥，粉碎；所述的溶劑是乙醇、丙酮、石油醚、甲醇或者它們的混合溶劑；其中，每1Kg新鮮軟骨加3～5L溶劑。
本發(fā)明采用固相堿解法從動(dòng)物軟骨中提取得到硫酸軟骨素鈉，是在固相條件下，將動(dòng)物軟骨粉與NaOH、NaCl混合，在外部機(jī)械力的作用下發(fā)生反應(yīng)，NaOH使得硫酸軟骨素分子從蛋白質(zhì)上解離下來(lái)，同時(shí)，NaCl使得蛋白質(zhì)分子變性而得以分離。與液相法相比，本發(fā)明的固相法具有工藝簡(jiǎn)單，提取效率高、生產(chǎn)周期短，溶劑用量及廢液量少的優(yōu)點(diǎn)。
在固相提取體系中加入促進(jìn)劑，例如Al2O3、ZrO2、SiO2、SiC、SiN等，通過(guò)它們對(duì)反應(yīng)組分施加切割和摩擦力，能夠促進(jìn)反應(yīng)物分子間的接觸與反應(yīng)，加速糖肽鍵的斷裂，有利于硫酸軟骨素的解離以及與蛋白質(zhì)的分離。
與對(duì)比文獻(xiàn)(中國(guó)專利CN 105399860 A，“一種研磨法提取硫酸軟骨素的方法”)相比，該專利是采用研磨法提取硫酸軟骨素，將軟骨粉、NaOH和SiO2混合研磨，在固相中只是發(fā)生了硫酸軟骨素的解離過(guò)程。本發(fā)明是將軟骨粉、NaOH、NaCl混合反應(yīng)，在固相提取體系中引入NaCl，使得硫酸軟骨素的解離和蛋白質(zhì)分子的變性分離過(guò)程同時(shí)發(fā)生，更有利于提取過(guò)程的快速和正向進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)更高效的提取。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，但不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。
【實(shí)施例1】
將豬鼻軟骨清洗干凈并剝?nèi)埩舻乃槿夂徒钅?，加水至剛好淹沒軟骨，加熱至沸騰并保持30min，趁熱將水瀝去，軟骨在110℃干燥12hr，粉碎，過(guò)200目篩得到豬鼻軟骨粉。
稱量50g豬鼻軟骨粉、5gNaOH，10gNaCl，將三者在研缽中混合研磨40min，向固體混合物中加入200ml水，將體系攪拌30min后，用1M的HCl調(diào)節(jié)體系的pH為7.0，過(guò)濾；在良好的攪拌下，向?yàn)V液中滴加2.5倍體積的乙醇，滴加完后，靜置陳化8hr，過(guò)濾，濾餅用少量乙醇洗滌兩遍，60℃真空干燥，得到白色硫酸軟骨素鈉粉體6.4g，HPLC純度90％。
【實(shí)施例2】
將豬鼻軟骨清洗干凈并剝?nèi)埩舻乃槿夂徒钅?，加乙醇至剛好淹沒軟骨，浸泡3hr，將乙醇瀝去，軟骨在110℃干燥12hr，粉碎，過(guò)200目篩得到豬鼻軟骨粉。
稱量50g豬鼻軟骨粉、25gNaOH、20gNaCl、70g粒度為100～200目的Al2O3，將四種組分在研缽中混合研磨30min，向固體混合物中加入350ml水，將體系攪拌30min后，用1M的HCl調(diào)節(jié)體系的pH為7.0，過(guò)濾；在良好的攪拌下，向?yàn)V液中滴加2.5倍體積的乙醇，滴加完后，靜置陳化8hr，過(guò)濾，濾餅用少量乙醇洗滌兩遍，60℃真空干燥，得到白色疏松的硫酸軟骨素鈉粉體9.2g，HPLC純度96％。
【實(shí)施例3】
將豬鼻軟骨清洗干凈并剝?nèi)埩舻乃槿夂徒钅ぃ铀羷偤醚蜎]軟骨，加熱至沸騰并保持30min，趁熱將水瀝去，軟骨在110℃干燥12hr，粉碎，過(guò)200目篩得到豬鼻軟骨粉。
稱量50g豬鼻軟骨粉、25gNaOH、20gNaCl、40g粒度為100～200目的Al2O3，將四種組分在研缽中混合研磨30min，向固體混合物中加入400ml水，將體系攪拌30min后，用1M的HCl調(diào)節(jié)體系的pH為6.5，過(guò)濾；在良好的攪拌下，向?yàn)V液中滴加2.5倍體積的乙醇，滴加完后，靜置陳化8hr，過(guò)濾，濾餅用少量乙醇洗滌兩遍，60℃真空干燥，得到白色疏松的硫酸軟骨素鈉粉體9.5g，HPLC純度98％。
【實(shí)施例4】
將豬鼻軟骨清洗干凈并剝?nèi)埩舻乃槿夂徒钅?，加水至剛好淹沒軟骨，加熱至沸騰并保持30min，趁熱將水瀝去，軟骨在110℃干燥12hr，粉碎，過(guò)200目篩得到豬鼻軟骨粉。
稱量50g豬鼻軟骨粉、25gNaOH、40g粒度為200目的SiO2，將三種組分在研缽中混合研磨30min，向固體混合物中加入400ml質(zhì)量濃度為10％的NaCl水溶液，將體系攪拌30min后，用1M的HCl調(diào)節(jié)體系的pH為6.5，過(guò)濾；在良好的攪拌下，向?yàn)V液中滴加2.5倍體積的乙醇，滴加完后，靜置陳化8hr，過(guò)濾，濾餅用少量乙醇洗滌兩遍，60℃真空干燥，得到白色硫酸軟骨素鈉粉體8.1g，HPLC純度91％。