本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)伸展蛋白水稻的分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用伸展蛋白提高水稻莖稈抗倒伏能力的方法。

背景技術(shù)：

伸展蛋白(extensin)是一種細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白，一般由一條多肽鏈組成，并富含羥脯氨酸殘基[1](tierneyetal.,1987)。伸展蛋白廣泛存在于植物細(xì)胞壁中，在整個(gè)植物界從單細(xì)胞的團(tuán)藻、低等的苔蘚植物，到高等的裸子植物、被子植物中均有表達(dá)[2](merkouropoulosetal.,1999)。其脯氨酸殘基可被羥基化,羥脯氨酸及絲氨酸殘基可被糖基化，有些種類伸展蛋白還進(jìn)行分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)反應(yīng)。伸展蛋白幾乎涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育的各方面，包括花粉的識(shí)別與受精[3](wuetal.,2001)，細(xì)胞分裂與分化，細(xì)胞伸長(zhǎng)的停止[4](itoetal.,1998)，衰老與脫落[5](merkouropoulosetal.,2003)，參與生物與非生物脅迫反應(yīng)[6](showalter,1993)等。wei[7]等(2006)證實(shí)在擬南芥中，伸展蛋白基因atext1的過(guò)量表達(dá)限制了病原菌丁香假單胞菌的入侵。擬南芥atext3，atext18的突變體植株正常生長(zhǎng)受到影響[8,9,10,11](halletal.,2002；cannonetal.,2008；sahaetal.,2013；choudharyetal.,2015)。roberts[12]等(2006)在擬南芥中超表達(dá)atext1，轉(zhuǎn)基因植株莖粗增大，而莖的高度降低。但迄今為止，尚無(wú)伸展蛋白對(duì)提高植物抗倒伏能力的報(bào)道。

參考文獻(xiàn)：

1.tierneyml，varnerje.reviewtheextensins.plantphysiol1987；84:1-2.

2.merkouropoulosg，barnettdc，shirsatah.thearabidopsisextensingeneisdevelopmentallyregulated，isinducedbywounding，methyljasmonate，abscisicandsalicylicacid,andcodesforaproteinwithunusualmotifs.planta1999；208(2):212-219.

3.wuh，degb，marianic，etal.hydroxyproline-richglycoproteinsinplantreproductivetissues:structure，functionsandregulation.cellularandmolecularlifesciences2001；58(10):1418-1429.

4.itom，kodamah，komaminea，etal.expressionofextensingenesisdependentonthestageofthecellcycleandcellproliferationinsuspension-culturedcatharanthusroseuscells.plantmolecularbiology1998；36(3):343-351.

5.merkouropoulosg，shirsatah.theunusualarabidopsisextensiongeneatext1isexpressedthroughoutplantdevelopmentandisinducedbyavarietyofbioticandabioticstresses.planta2003；217(3):356-366.

6.showalteram.structureandfunctionofplantcellwallproteins.plantcell1993；5(1):9-23.

7.wei,g.,andshirsat,a.h.extensinover-expressioninarabidopsislimitspathogeninvasiveness.mol.plant.pathol.2006；7,579-592.

8.hallq,cannonmc.thecellwallhydroxyproline-richglycoproteinrshisessentialfornormalembryodevelopmentinarabidopsis.plantcell2002；14(5):1161-72.

9.cannonmc,terneusk,hallq,tanl,wangy,wegenhartbl,etal.self-assemblyoftheplantcellwallrequiresanextensinscaffold.pnas2008；105(6),2226-31.

10.sahap,rayt,tangy,duttai,evangelousnr,kieliszewskimj,etal.self-rescueofanextensinmutantrevealsalternativegeneexpressionprogramsandcandidateproteinsfornewcellwallassemblyinarabidopsis.plantj,2013；75(1):104-16.

11.choudharyp,sahap,rayt,tangyh,yangd,cannonmc.extensin18isrequiredforfullmalefertilityaswellasnormalvegetativegrowthinarabidopsis.frontplantsci2015；6.

12.robertsk,shirsatah.increasedextensinlevelsinarabidopsisaffectinflorescencestemthickeningandheight.jexpbot2006；57:537-45.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種利用伸展蛋白提高水稻莖稈抗倒伏能力的方法，即利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)水稻進(jìn)行遺傳改良，提高莖稈抗倒伏能力，為提高植物機(jī)械支撐力做理論以及技術(shù)上的探索。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一、利用伸展蛋白提高水稻莖稈抗倒伏能力的方法(簡(jiǎn)稱方法)

本方法包括下列步驟：

①?gòu)乃局锌寺sextl基因cdna

基因編碼區(qū)序列如seqidno：1，cdna長(zhǎng)度為844bp；

②構(gòu)建含ubi啟動(dòng)子的基因載體，并轉(zhuǎn)化水稻中花11，獲得轉(zhuǎn)基因植株，其轉(zhuǎn)基因水稻種子extl(oryzasativaextl)于2017年1月3日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)郵編：430072)，保藏編號(hào)為cctccno：p201701；

③將獲得的轉(zhuǎn)基因水稻種子extl開花后30天進(jìn)行莖稈抗倒伏能力的測(cè)定。

本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

增加osextl基因在水稻中的表達(dá)量，使轉(zhuǎn)基因水稻莖稈抗倒伏能力(開花后30天測(cè)定)提高了48％。

附圖說(shuō)明

圖1是轉(zhuǎn)osextl基因水稻莖稈的抗倒伏能力的比較圖片；

圖2是植物表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。

轉(zhuǎn)基因水稻種子extl(oryzasativaextl)于2017年1月3日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)郵編：430072)，保藏編號(hào)為cctccno：p201701。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明：

一、實(shí)施例1：osextl基因cdna的克隆

從水稻中克隆osextl基因的cdna，如序列1，長(zhǎng)度為844bp；pcr產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收，酶切，連接載體。

——合成引物擴(kuò)增osextl的cdna(844bp，包含cds519bp)

正向引物：cgcggatccacgaccattattcctcctcctc；

反向引物：cggggtaccgcctgatagaaagcgacaacatg。

二、實(shí)施例2：表達(dá)載體的構(gòu)建

將osextl的cdna序列連接t載體后，酶切，轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pubi-zh2，見圖2。

三、實(shí)施例3：植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1、農(nóng)桿菌活化

將保存的農(nóng)桿菌(eha105)在固體lb培養(yǎng)基上畫線(加抗生素：kan，如果不加抗生素就有可能造成這些菌株的ti質(zhì)粒丟失，導(dǎo)致農(nóng)桿菌缺乏侵染性)，抗生素濃度為：50μg/ml，28℃培養(yǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)移到新的加有抗生素的固體lb培養(yǎng)基上再培養(yǎng)2天；

2、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

將100μl接種于1mllb液體培養(yǎng)基中，150rpm28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

吸取1ml菌液接種到100ml液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od600＝0.5；

將菌液置冰上30min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃；

4℃，5000rpm離心30s，棄去上清液；

沉淀用60ml0.1mcacl2懸浮，冰浴30min；

5000rpm離心30s，棄去上清液；

每管用100μl含15％甘油的20mmcacl2懸浮，用于轉(zhuǎn)化；

制備好的感受態(tài)細(xì)胞可馬上使用，也可按每管200μl分裝于無(wú)菌離心管中，于4℃保存48小時(shí)內(nèi)使用，長(zhǎng)期貯存時(shí)必須在液氮中速凍后轉(zhuǎn)-80℃保存，使用時(shí)從-80℃取出，置冰上融化后使用。

3、dna直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

200μl農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒dna0.1～1μg(5-10μl)，之后冰浴30min；

放入液氮中7-8min，然后立即放入37℃水浴鍋中水浴5min；

取出離心管，冰上放置2min，加入0.8mllb，28℃，150rpm振蕩培養(yǎng)3～4hr；

取出菌液于kan抗生素的lb平板上涂板，在培養(yǎng)箱中28℃條件下倒置培養(yǎng)，2天左右菌落可見。

4、重組農(nóng)桿菌鑒定

挑取單菌落，接種于含相應(yīng)抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

小量提取質(zhì)粒dna，加gte同時(shí)加5μl溶菌酶(50μg/ml，貯藏濃度為50mg/ml或10mg/ml)；

質(zhì)粒酶切或pcr鑒定。

四、實(shí)施例4：水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)、分化、生根及移栽方法

1、愈傷誘導(dǎo)

將成熟的水稻種子去殼，先用無(wú)菌水沖洗3遍，然后用70％的乙醇處理1分鐘，不時(shí)搖動(dòng)；

無(wú)菌水沖洗3遍，每次30秒，不時(shí)搖動(dòng)；

0.1％升汞溶液消毒12分鐘(或2.5％naclo消毒30min)，不時(shí)搖動(dòng)；

無(wú)菌水沖洗5遍以上，每次30秒，不時(shí)搖動(dòng)；

將種子放在滅菌濾紙上吸干水分，然后放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；

28℃，暗培養(yǎng)4周；

2、愈傷繼代

挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷(即散落到培養(yǎng)基上的愈傷，不要選從種子上發(fā)出來(lái)的愈傷)，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度28℃；

3、預(yù)培養(yǎng)

挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4-14天，溫度28℃；

4、愈傷與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)

1)農(nóng)桿菌培養(yǎng)

在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的lb培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌兩天，溫度28℃；

將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至裝有懸浮培養(yǎng)基的帶塞試管或離心管里，重懸農(nóng)桿菌，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至od600為0.8-1.0；

2)農(nóng)桿菌侵染

將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的三角瓶?jī)?nèi)；

將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；

轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吹干(30min-1h)；

然后放置在已鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。

5、選擇培養(yǎng)

將共培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的三角瓶?jī)?nèi)；

滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；

浸泡在含400ppm羧芐青霉素的滅菌水中30分鐘；

轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干(1h以上)；

轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2次，每次2周。(第一次羧芐青霉素篩選濃度為400ppm，第二次為250ppm)；

6、分化培養(yǎng)

將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7天(可省略)；

轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26℃；

7、生根培養(yǎng)

剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根(留1-2mm)；

然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2周，溫度26℃；

8、移栽

待苗高10-12cm，根系發(fā)生較好，打開瓶蓋，洗掉根上的殘留培養(yǎng)基(注意不要傷根)，移栽花盆中。在最初的幾天，蒙上保鮮膜，保持水分濕潤(rùn)。

五、實(shí)施例5：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的鑒定

1、基因插入鑒定

檢測(cè)引物：潮霉素通用引物和基因特異性引物；

2、表達(dá)鑒定

基因特異引物。

六、實(shí)施例6：水稻秸桿抗倒伏的測(cè)定

抗倒伏指數(shù)測(cè)定：用開花后30天水稻材料進(jìn)行倒四節(jié)倒伏指數(shù)測(cè)定。倒四節(jié)倒伏指數(shù)計(jì)算公式如下：倒伏指數(shù)＝(鮮重×株高)/折斷力。鮮重：地上部分倒四節(jié)基部以上所有重量(包括莖稈、葉片、葉鞘、穗子)；株高：倒四節(jié)基部到穗頂端長(zhǎng)度；折斷力：將待測(cè)樣品倒四節(jié)水平放置在寬帶度為5cm的裝置中，采用折斷力儀(dik7401；daiki,osaka,japan)對(duì)倒四節(jié)進(jìn)行折斷力測(cè)定，結(jié)果見圖1。

<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>利用伸展蛋白提高水稻莖稈抗倒伏能力的方法

<140>

<141>

<160>3

<210>1

<211>844

<212>osextl基因的cdna

<400>

acgaccattattcctcctcctctctggagtctagtctcctctcctcactcctcactcgccccactccgccgcttcactcgcgagctcgtcgttggcgccggcggcaatggcgtccccccgcgcgctctccctcctcctcgtcctcctgggcatggccctcgcgtcgttcccctccgccgcctccgcctcccgcgacctccgcccccgccgcgcgggcttcgtcgtccgcggccgcgtctggtgcgacacctgcctcgccggcttcgagacccccgcctccacctacatcgccggagcgaaggtaaaggttgagtgcagatcgaaatccactggcgccaagacatgcagcttcgagggccagactgaccacactggcacctacaacatccctgtcaacgatgagcatgagcacgagctctgcgagtctgtccttgtgagcagcccggacgcaaagtgtggcaagattgttgctggacgggagagggctcctgtcttcctcaccaacaacaatggtgtgacatctaatgttcggttggcgaacgctctgggcttccagaaggatgctcctcttgctgcgtgcgcacaaatcctcaagatgtacgaggaagtggacgaccgcgtttgaaggatgtgagttatgtatcaatattcgtacgttgttgaaatactctaagaagacttctatataccttttactgagagcaaaactatcagcatcagatgttgcgtgcttgataagttgtgatatagcttagcacttgagtatgttatatgtatgttcgtctgcagctgaactgcaaaactcatcagttactaaatcgacatgttgtgctttctatcaggc；

<210>2

<211>31

<212>正向引物

<400>

cgcggatccacgaccattattcctcctcctc；

<210>3

<211>32

<212>反向引物

<400>

cggggtaccgcctgatagaaagcgacaacatg。