本發(fā)明涉及生物技術(shù)育種領(lǐng)域，具體涉及一種利用基因組編輯技術(shù)定點(diǎn)突變小麥相關(guān)基因?qū)π←溸M(jìn)行改造的方法。
背景技術(shù)：
：：小麥起源于中東新月沃土(levant)地區(qū)，是世界上重要的糧食作物之一，也是我國僅次于水稻的第二大農(nóng)作物，其生產(chǎn)關(guān)系到世界和我國的糧食安全。小麥?zhǔn)且环N溫帶長日照植物，適應(yīng)范圍較廣，自北緯17°-50°，從平原到海拔約4000m的高原(如中國西藏)均有種植。全世界有43個(gè)國家，有35％-40％的人口以小麥為主要糧食。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織2004年統(tǒng)計(jì)，全世界小麥?zhǔn)斋@面積32.36億畝，單產(chǎn)193.8千克/畝，總產(chǎn)6.27億噸。隨著世界糧食生產(chǎn)形勢日益嚴(yán)峻，進(jìn)一步提高小麥triticumaestivuml.,2n＝42,aabbdd)產(chǎn)量成為當(dāng)前迫切需要解決的問題。小麥產(chǎn)量是由單位面積有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重構(gòu)成的，實(shí)現(xiàn)三者的最佳協(xié)調(diào)關(guān)系，力爭達(dá)到產(chǎn)量最大化，是目前亟待解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種改造小麥的方法。本發(fā)明所提供的改造小麥的方法，包括如下步驟：抑制小麥中dep1蛋白的表達(dá)和/或活性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)小麥改造。上述方法中，所述抑制dep1蛋白表達(dá)的方法可以為使dep1蛋白的編碼基因功能降低或喪失。使dep1蛋白的編碼基因功能降低或喪失，可采用現(xiàn)有技術(shù)中的任何方式實(shí)現(xiàn)，以使基因產(chǎn)生缺失突變、插入突變或堿基變換突變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因功能降低或喪失。使dep1蛋白的編碼基因功能降低或喪失具體可以采取化學(xué)誘變、物理誘變、rnai、基因組定點(diǎn)編輯、同源重組等方法。無論采取哪種方法，既可對dep1蛋白的整個(gè)編碼基因作為靶標(biāo)，又可將調(diào)控dep1基因表達(dá)的各個(gè)元件作為靶標(biāo)，只要能實(shí)現(xiàn)基因功能喪失或降低即可。如可以將dep1的編碼基因的第1外顯子、第2外顯子、第3外顯子、第4外顯子或第5外顯子作為靶標(biāo)。上述基因組定點(diǎn)編輯方法中，可采用鋅指核酸酶(zincfingernuclease,zfn)技術(shù)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,talen)技術(shù)或成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crisprassociated,crispr/cas9system)技術(shù)，以及其它能實(shí)現(xiàn)基因組定點(diǎn)編輯的技術(shù)。上述各種基因定點(diǎn)突變技術(shù)，在操作中具體可按照如下步驟進(jìn)行：在小麥中表達(dá)特異于靶標(biāo)片段的核酸酶，在核酸酶的作用下，所述靶標(biāo)片段被剪切，再通過小麥的自身dna修復(fù)，完成對所述靶標(biāo)片段的定點(diǎn)改造，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)使dep1蛋白的編碼基因功能降低或喪失。上述方法中，在小麥中表達(dá)特異于靶標(biāo)片段的核酸酶的方法為：直接向小麥中導(dǎo)入核酸酶或向小麥中導(dǎo)入用于表達(dá)所述核酸酶的遺傳物質(zhì)。其中的遺傳物質(zhì)為dna質(zhì)?；騞na線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的rna。核酸酶指進(jìn)行定點(diǎn)編輯的活性功能物質(zhì)。上述在小麥中表達(dá)特異于靶標(biāo)片段的核酸酶的方法中還可包括如下步驟：將導(dǎo)入所述核酸酶或所述遺傳物質(zhì)后的小麥在無選擇壓力的情況下種植生長，所述核酸酶或未整合在小麥染色體上的所述遺傳物質(zhì)被細(xì)胞降解。在無選擇壓力情況下，植物自身的防御機(jī)制會抑制外源基因的進(jìn)入并將已進(jìn)入的外源基因降解。因而，將導(dǎo)入所述核酸酶或所述遺傳物質(zhì)后的小麥進(jìn)行種植生長，外源基因(包括用于表達(dá)特異于所述靶標(biāo)片段的核酸酶的質(zhì)?；虺商踪|(zhì)粒上的任何片段)不會整合入小麥基因組中，最終獲得的小麥為非轉(zhuǎn)基因的定點(diǎn)改造小麥。當(dāng)使用crispr/cas9方法時(shí)，相應(yīng)的，所述遺傳物質(zhì)為能轉(zhuǎn)錄向?qū)na和表達(dá)cas9蛋白的重組載體或dna線性片段；或所述遺傳物質(zhì)由能轉(zhuǎn)錄向?qū)na的重組載體或dna線性片段(或分別轉(zhuǎn)錄crrna和tracrrna的兩個(gè)重組載體或dna線性片段)，以及能表達(dá)cas9蛋白的重組載體或dna線性片段或rna組成；或所述遺傳物質(zhì)由向?qū)na，以及能表達(dá)cas9蛋白的重組載體或dna線性片段或rna組成；所述向?qū)na為由crrna和tracrrna通過部分堿基配對結(jié)合而成的具有回文結(jié)構(gòu)的rna；所述crrna含有能夠與所述靶標(biāo)片段互補(bǔ)結(jié)合的rna片段。在所述重組載體中，啟動所述向?qū)na的編碼核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子可為u3啟動子或者u6啟動子。當(dāng)使用talen核酸酶時(shí)，所述用于表達(dá)特異于所述靶標(biāo)片段的核酸酶的遺傳物質(zhì)可為同時(shí)表達(dá)成對talen蛋白的重組質(zhì)粒，或同時(shí)表達(dá)成對talen蛋白的dna線性片段；或同時(shí)表達(dá)成對talen蛋白的rna；所述talen蛋白由能夠識別所述靶標(biāo)片段并與其結(jié)合的dna結(jié)合域和foki結(jié)構(gòu)域組成；當(dāng)使用鋅指核酸酶時(shí)，所述用于表達(dá)特異于所述靶標(biāo)片段的核酸酶的遺傳物質(zhì)可為同時(shí)表達(dá)成對zfn蛋白的重組質(zhì)粒，或同時(shí)表達(dá)成對zfn蛋白的dna線性片段；或同時(shí)表達(dá)成對zfn蛋白的rna；所述zfn蛋白由能夠識別所述靶標(biāo)片段并與其結(jié)合的dna結(jié)合域和foki結(jié)構(gòu)域組成。本發(fā)明的具體例子中采用了crispr/cas9技術(shù)，其中涉及的靶序列為seqidno.1，使用的向?qū)na序列為seqidno.2。進(jìn)一步具體的，本發(fā)明中使用了如下(1)或(2)所示載體，當(dāng)使用(1)所示載體時(shí)需與pjit163-ubi-rcas9載體聯(lián)合使用，才能實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的：(1)能轉(zhuǎn)錄向?qū)na的重組載體，按照如下方法制備：將seqidno.3和seqidno.4所示片段進(jìn)行退火，然后與經(jīng)bbsi酶切的ptau6-grna載體骨架相連，得到重組載體，記作ptau6-grna-tadep1-1；(2)能轉(zhuǎn)錄向?qū)na和表達(dá)cas9蛋白的重組載體，按照如下方法制備得到：以載體ptau6-grna-tadep1-1為模板，用seqidno.5和seqidno.6所示引物對進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；將擴(kuò)增產(chǎn)物用spei進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)spei酶切的pjit163-ubi-rcas9載體骨架相連，得到重組載體。上述方法中，所述改造小麥可為增強(qiáng)小麥的光合作用能力、和/或增加小麥葉片葉綠素含量和/或改變小麥株型。其中的改變小麥株型具體可為使小麥株高變矮小。上述方法適用于任何小麥，只要含有上述靶序列即可，本發(fā)明列舉的例子是普通小麥(triticumaestivuml.)。由于小麥?zhǔn)嵌啾扼w植物，因此上述方法改造后得到的小麥可以是所有染色單體均被定點(diǎn)編輯的小麥，也可以是部分染色單體被定點(diǎn)編輯的小麥。本發(fā)明還提供了實(shí)現(xiàn)上述方法的一種工具，即用于改造小麥的試劑盒。本發(fā)明所提供的改造小麥的試劑盒，包括如下任一種：(1)sgrna分子：其序列如seqidno.2所示；(2)所述sgrna的編碼dna分子；(3)表達(dá)所述sgrna的載體；(4)能轉(zhuǎn)錄向?qū)na的重組載體，按照如下方法制備：將seqidno.3和seqidno.4所示片段進(jìn)行退火，然后與經(jīng)bbsi酶切的ptau6-grna載體骨架相連，得到重組載體，記作ptau6-grna-tadep1-1；(5)能轉(zhuǎn)錄向?qū)na和表達(dá)cas9蛋白的重組載體，按照如下方法制備得到：以載體ptau6-grna-tadep1-1為模板，用seqidno.5和seqidno.6所示引物對進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；將擴(kuò)增產(chǎn)物用spei進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)spei酶切的pjit163-ubi-rcas9載體骨架相連，得到重組載體；(6)對小麥進(jìn)行基因組定點(diǎn)編輯的crispr/cas9系統(tǒng)，其中的靶標(biāo)序列為seqidno.1；(7)對小麥進(jìn)行基因組定點(diǎn)編輯的crispr/cas9系統(tǒng)，其中的sgrna分子序列為seqidno.2所示。本發(fā)明通過基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)同時(shí)突變小麥中dep1基因的三個(gè)位點(diǎn)(即同時(shí)敲除tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因)，得到了株型變矮小且光合作用增強(qiáng)的小麥。附圖說明圖1為靶位點(diǎn)位置，及tadep1基因靶位點(diǎn)的sgrna在小麥原生質(zhì)體中的活性檢測。圖2為用pcr/re檢測crispr介導(dǎo)的小麥dep1基因t0代突變體以及測序結(jié)果。圖3為小麥dep1基因純合突變體tadep1-aabbdd的株高表型。圖4為小麥dep1基因純合突變體tadep1-aabbdd的光合能力。圖5為小麥dep1基因純合突變體tadep1-aabbdd的旗葉厚度和葉綠素含量。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。pjit163-ubi-rcas9載體在如下文獻(xiàn)中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得：“wang,y.etal.simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.nat.biotechnol.32,947-95(2014).ptau6-grna載體在如下文獻(xiàn)中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得：shan,q.etal.targetedgenomemodifiationofcropplantsusingacrispr-cassystem.nat.biotechnol.31,686–688(2013).pjit163載體：guerineau,f.,lucy,a.&mullineaux,p.effectoftwoconsensussequencesprecedingthetranslationinitiatorcodonongeneexpressioninplantprotoplasts.plantmol.biol.18,815–818(1992).小麥品種“科農(nóng)199”在如下文獻(xiàn)中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得：李俊明；張相岐；張愛民；王志國；安調(diào)過；紀(jì)軍；王靜.高產(chǎn)廣適小麥新品種——科農(nóng)199.麥類作物學(xué)報(bào).2007.368-368。實(shí)施例1、小麥tadep1靶位點(diǎn)的選擇并構(gòu)建敲除載體一、tadep1靶位點(diǎn)的選擇普通小麥(triticumaestivuml.)是六倍體植物，大部分基因都以多個(gè)拷貝的形式分布在基因組a、基因組b和基因組d組上。小麥dep1基因在基因組a、基因組b和基因組d上都有分布，分別命名為tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因。tadep1的三個(gè)拷貝分別位于小麥5a、5b、5d染色體上，包含5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，構(gòu)建敲除載體選擇的靶位點(diǎn)位于第4外顯子的保守區(qū)(圖1a)。利用crispr技術(shù)敲除的靶標(biāo)雙鏈中的一條鏈具有如下結(jié)構(gòu)：5-nx-ngg-3，pam(ngg)中的n表示a、t、c和g中的任一種，nx中的n表示a、t、c和g中的任一種，x＝20。crispr對tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因的靶序列分別如下(seqidno.1)(參見圖1a)，“ccg”為pam(原型間隔序列毗鄰基序),下劃線表示avaii酶切位點(diǎn)。tadep1-a1基因:ccggtcctggcgtctttattggt；tadep1-b1基因:ccggtcctgccgtctttattggt；tadep1-d1基因:ccggtcctgccgtctttactggt；即在tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因中，此靶序列存在snp，加粗的即是snp。二、sgrna的設(shè)計(jì)根據(jù)靶序列，設(shè)計(jì)sgrna，其序列為accaauaaagacggcaggacguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu(seqidno.2)。三、重組載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶bbsi酶切ptau6-grna，回收約2.85kb的載體骨架。根據(jù)設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)tadep1序列，合成如下帶有粘性末端(下劃線部分)的引物：tadep1-1f：cttgaccaataaagacggcaggac(seqidno.3)；tadep1-1r：aaacgtcctgccgtctttattggt(seqidno.4)。將tadep1-1f和tadep1-1r進(jìn)行退火，形成有粘性末端的雙鏈dna命名為tadep1-1,將其和上述載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證陽性質(zhì)粒，即在ptau6-grna質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)bbsi處正向插入seqidno.3所示dna片段后得到的重組質(zhì)粒為陽性，命名為ptau6-grna-tadep1-1。在小麥細(xì)胞中，當(dāng)pjit163-ubi-cas9載體和含有靶標(biāo)序列的ptau6-grna-tadep1-1質(zhì)粒同時(shí)存在時(shí)在有活性的sgrna的介導(dǎo)下，cas9蛋白在靶序列區(qū)域切割，形成dna雙鏈斷裂，觸發(fā)機(jī)體內(nèi)的自我損傷修復(fù)機(jī)制，細(xì)胞自發(fā)修復(fù)該缺口的過程中會引入突變(本處“突變”指的是廣義突變，包括插入、缺失、狹義突變等形式，這些突變使基因功能失活)。上述靶序列tadep1含有avaii酶切識別序列，可以被avaii限制性內(nèi)切酶切割。靶序列區(qū)域被編輯后，如果發(fā)生了突變，則avaii酶切識別序列被破壞，將不能被限制性內(nèi)切酶avaii切割；如果沒有發(fā)生突變，將可以被限制性內(nèi)切酶avaii切割。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體及檢測重組載體在原生質(zhì)體中的活性將質(zhì)粒ptau6-grna-tadep1-1和pjit163-ubi-rcas9通過peg介導(dǎo)的方式共轉(zhuǎn)入小麥品種科農(nóng)199的原生質(zhì)體，然后提取原生質(zhì)體的基因組dna，用a、b、d的通用引物通過pcr擴(kuò)增包含靶位點(diǎn)的tadep1基因，然后將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用avaii單酶切，將不能被限制性內(nèi)切酶切開的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。用于擴(kuò)增含有靶位點(diǎn)tadep1的通用引物序列如下：上游引物tadep1-f:cagcaaaccccacttgcatcagaac下游引物tadep1-r:cagcacagccatgaagcacatatgca原生質(zhì)體中檢測重組載體活性的酶切結(jié)果見圖1b，泳道1和泳道2中含有不能被avaii切開的pcr條帶，說明靶位點(diǎn)tadep1-1有活性，泳道3為野生型對照pcr產(chǎn)物可以被avaii完全切開，泳道4為pcr產(chǎn)物對照。測序(圖1b)結(jié)果表明靶位點(diǎn)處產(chǎn)生了少量堿基的插入與缺失，證實(shí)重組載體tau6-sgrna-tadep1-1在靶位點(diǎn)處進(jìn)行了基因定點(diǎn)編輯。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)化小麥及表型鑒定一、轉(zhuǎn)化為了提高在植物中的轉(zhuǎn)化效率，我們將質(zhì)粒ptau6-grna-tadep1-1和pjit163-ubi-rcas9構(gòu)建到同一個(gè)質(zhì)粒中。具體操作如下：用u6-spei-f：cggactagtgaccaagcccgttattctgac(seqidno.5)和sgrna-spei-r：cggactagtaaaaaaagcaccgactcggtgccac(seqidno.6)為引物，質(zhì)粒ptau6-grna-tadep1-1為模板擴(kuò)增tau6-grna片段，將該pcr產(chǎn)物用spei進(jìn)行酶切純化后與同樣用spei酶切回收后的pjit163-ubi-rcas9載體相連，最終構(gòu)建在同一載體上，命名為pge-tadep1，并將載體進(jìn)行測序驗(yàn)證。將該載體通過基因槍轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入小麥品種科農(nóng)199中。提取t0代轉(zhuǎn)基因植株基因組dna，用含有靶位點(diǎn)tadep1-1的特異引物對基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物用avaii單酶切，酶切結(jié)果見圖2a。經(jīng)pcr、酶切檢測后，在t0代，得到小麥dep1基因發(fā)生定點(diǎn)突變的轉(zhuǎn)基因植株，其中包括tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因同時(shí)發(fā)生定點(diǎn)突變的雜合株。對其中8株突變體的測序結(jié)果見圖2b。將t0代轉(zhuǎn)基因植株自交，得到t1代和t2代植株，其中包括tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因同時(shí)發(fā)生定點(diǎn)突變的純合株。用于擴(kuò)增tadep1-a1基因的引物對如下：上游引物：ccagcaaaccccacttgcatcagaac；下游引物：gtgtactctactggaaggaaggttacaag。用于擴(kuò)增tadep1-b1基因的引物對如下：上游引物：ccagcaaaccccacttgcatcagaac；下游引物：cagatgaatactgcgtccctacgataggt。用于擴(kuò)增tadep1-d1基因的引物對如下：上游引物：ccagcaaaccccacttgcatcagaac；下游引物：ctgggcgggttcagttagcaggttac。二、表型鑒定將t0-7植株進(jìn)行自交，鑒定，選取dep1-aabbdd基因型(即純合型)植株，15個(gè)重復(fù)進(jìn)行表型的觀察鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無論是在營養(yǎng)生長還是生殖生長階段，突變體均表現(xiàn)出株高顯著矮小的表型(圖3a)，在生殖生長階段，突變體株高(36.7cm)相對于野生型(56.0cm)降低19.3cm。(圖3b)。通過測量不同光合強(qiáng)度下小麥旗葉光合速率，結(jié)果表明光強(qiáng)在0-200區(qū)間時(shí)，突變體與野生型光合作用強(qiáng)度無明顯差別，而在500-2000范圍內(nèi)光強(qiáng)下，突變體光合作用顯著高于野生型(p<0.05)(圖4)。通過測量突變體及野生型旗葉厚度及葉綠素含量指標(biāo)，結(jié)果表明突變體旗葉厚度顯著比其野生型增厚約5cm(圖5a),且葉綠素含量相比較于其野生型成明顯增高的趨勢(圖5b)。序列表<110>中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所<120>一種改造小麥的方法<160>6<210>1<211>23<212>dna<213>普通小麥（triticumaestivuml.）<221>misc_feature<222>(10)，(19)<223>s為c或g，y為c或t<400>1ccggtcctgscgtctttaytggt23<210>2<211>103<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2accaauaaagacggcaggacguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu103<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3cttgaccaataaagacggcaggac24<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4aaacgtcctgccgtctttattggt24<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5cggactagtgaccaagcccgttattctgac30<210>6<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6cggactagtaaaaaaagcaccgactcggtgccac34當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12