本發(fā)明涉及一種基于人工多酶生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)合成蛋白質(zhì)的配方和方法。
背景技術(shù)：
：進(jìn)入21世紀(jì)，生命科學(xué)迅猛發(fā)展，生物學(xué)研究的重心逐漸由破譯或解釋基因遺傳信息轉(zhuǎn)移到基因生物學(xué)功能的研究，在分子層面上探索生命的奧秘。2005年人類基因組計(jì)劃測(cè)序工作全部完成，大量生物體的基因遺傳信息被解碼，而蛋白質(zhì)是生物體進(jìn)行基因功能活動(dòng)的直接執(zhí)行者，以基因遺傳信息為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)功能研究變得尤為重要。蛋白質(zhì)合成是蛋白質(zhì)功能研究中最基本的環(huán)節(jié)，如何快速、簡(jiǎn)便、高效地合成蛋白質(zhì)成為共同關(guān)注的問(wèn)題?，F(xiàn)階段，蛋白質(zhì)傳統(tǒng)生物合成主要通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方式將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，隨后利用細(xì)胞內(nèi)的氨基酸殘基、核糖體及酶等必需物質(zhì)和三磷酸腺苷等能量物質(zhì)，在新的遺傳背景下進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)增和表達(dá)，完成蛋白質(zhì)的合成。宿主細(xì)胞分為兩大系統(tǒng)，即原核細(xì)胞系統(tǒng)和真核細(xì)胞系統(tǒng)。原核細(xì)胞主要包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，酵母、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等屬于真核細(xì)胞，也常用于蛋白質(zhì)合成。原核細(xì)胞系統(tǒng)具有生長(zhǎng)速率快、轉(zhuǎn)化率高、成本低、易操作、可大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。但是仍存在一定的局限性，例如不能進(jìn)行蛋白質(zhì)的修飾，持續(xù)表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，易形成包涵體，蛋白質(zhì)純化也比較困難。真核細(xì)胞系統(tǒng)具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾能力，接近真核生物蛋白質(zhì)或天然蛋白質(zhì)，克服了原核細(xì)胞系統(tǒng)的不足，具有許多優(yōu)勢(shì)。但其產(chǎn)物蛋白不均一、形成多聚體、信號(hào)肽加工不完全、產(chǎn)量低、細(xì)胞培養(yǎng)成本高、技術(shù)復(fù)雜等是也是亟需解決的問(wèn)題。蛋白質(zhì)傳統(tǒng)生物合成較適用于對(duì)單個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)的研究，而目前，高通量、大數(shù)據(jù)、快速高效研究已經(jīng)成為蛋白質(zhì)功能研究的趨勢(shì)，傳統(tǒng)方式已無(wú)法滿足研究要求，這就需要我們探索一種快速、高效、簡(jiǎn)便地合成大量蛋白質(zhì)的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無(wú)需細(xì)胞，方法簡(jiǎn)便、廉價(jià)、可控和高產(chǎn)率的基于人工多酶生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)合成蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種基于人工多酶生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)合成蛋白質(zhì)的配方。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：一種基于人工多酶生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)合成蛋白質(zhì)的配方，包括：1)用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物；2)用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物；3)用于蛋白質(zhì)合成的基因質(zhì)粒。用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物包括比例為1g:0.01～0.1ml:1～3ml的細(xì)胞破碎產(chǎn)物、緩沖溶液1和緩沖溶液2；所述緩沖溶液1為：5-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸鉀，10-20mmol/L谷氨酸鎂，0.5-2mmol/L二硫蘇糖醇，5-10mmol/L2-巰基乙醇；溶劑是去離子水；所述緩沖溶液2為：5-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸鉀，10-20mmol/L谷氨酸鎂，0.5-2mmol/L二硫蘇糖醇；溶劑是去離子水。優(yōu)選地：用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物由按體積比為(2-8):(20-30):(2-5):1的氨基酸混合液、反應(yīng)緩沖液、能量補(bǔ)充液和濃度為5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液組成：所述氨基酸混合液，溶劑為去離子水；每種氨基酸的濃度均為5-20mmol/L的等摩爾濃度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；所述反應(yīng)緩沖液包括：40-60mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸鉀、10-25mmol/L谷氨酸鎂、10-40mmol/L3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L環(huán)磷酸腺苷、2.0-4.0mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0-4.0mmol/L輔酶A、0.4-0.8mmol/L亞葉酸、1.0-5.0mg/mL轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亞精胺；溶劑是去離子水；所述能量補(bǔ)充液包括：1.0-3.0mmol/L三磷酸尿苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸胞苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸腺苷，3.0-9.0mmol/L三磷酸鳥(niǎo)苷，溶劑是去離子水。所述細(xì)胞為真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。一種基于人工多酶生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)合成蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：將用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物、用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物和用于蛋白質(zhì)合成的基因質(zhì)?；旌?，置于恒溫反應(yīng)容器中，在25-37℃放置10min-48h。優(yōu)選地：用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物、用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物和用于蛋白質(zhì)合成的基因質(zhì)粒的體積比為(10-20):(15-35):1用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物包括比例為1g:0.01～0.1ml:1～3ml的細(xì)胞破碎產(chǎn)物、緩沖溶液1和緩沖溶液2；所述緩沖溶液1為：5-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸鉀，10-20mmol/L谷氨酸鎂，0.5-2mmol/L二硫蘇糖醇，5-10mmol/L2-巰基乙醇；溶劑是去離子水；所述緩沖溶液2為：5-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸鉀，10-20mmol/L谷氨酸鎂，0.5-2mmol/L二硫蘇糖醇；溶劑是去離子水。用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物由按體積比為(2-8):(20-30):(2-5):1的氨基酸混合液、反應(yīng)緩沖液、能量補(bǔ)充液和濃度為5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液組成：所述氨基酸混合液，溶劑為去離子水；每種氨基酸的濃度均為5-20mmol/L的等摩爾濃度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；所述反應(yīng)緩沖液包括：40-60mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸鉀、10-25mmol/L谷氨酸鎂、10-40mmol/L3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L環(huán)磷酸腺苷、2.0-4.0mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0-4.0mmol/L輔酶A、0.4-0.8mmol/L亞葉酸、1.0-5.0mg/mL轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亞精胺；溶劑是去離子水；所述能量補(bǔ)充液包括：1.0-3.0mmol/L三磷酸尿苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸胞苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸腺苷，3.0-9.0mmol/L三磷酸鳥(niǎo)苷，溶劑是去離子水。所述細(xì)胞為真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明以基因質(zhì)粒為模板，利用細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)合成機(jī)器、蛋白質(zhì)折疊因子及其他相關(guān)酶系，通過(guò)添加氨基酸、三磷酸核糖核苷、核糖核酸聚合酶和能量物質(zhì)等，在細(xì)胞外場(chǎng)所進(jìn)行蛋白質(zhì)合成與翻譯后修飾的過(guò)程，從而完成蛋白質(zhì)的合成。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便快速，能夠在極短時(shí)間內(nèi)合成大量蛋白質(zhì)，這是傳統(tǒng)的生物合成法所不能實(shí)現(xiàn)的，可滿足目前蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能組學(xué)的研究要求。能夠合成一些生物合成法不能合成的蛋白質(zhì)，比如對(duì)細(xì)胞有毒害作用的蛋白質(zhì)，避免毒性蛋白對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害甚至致死作用；通過(guò)加入人工合成的氨基乙酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，可用于合成含有非天然氨基酸或用同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)。該方法還可直接以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物為模板進(jìn)行相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成，能夠快速篩選具有所需突變基因的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的體外定向進(jìn)化。反應(yīng)條件的可控性使得靈活控制蛋白質(zhì)的合成和翻譯后的蛋白加工折疊成為可能，能防止包涵體的形成，減少內(nèi)源蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的攻擊，使大部分的能源集中用于合成蛋白質(zhì)，而非消耗在細(xì)胞生長(zhǎng)等其他過(guò)程。附圖說(shuō)明圖1是實(shí)施例26、實(shí)施例27、實(shí)施例28合成的蛋白質(zhì)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。泳道1：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2：實(shí)施例26合成的蛋白質(zhì)；泳道3：實(shí)施例27合成的蛋白質(zhì)；泳道4：實(shí)施例28合成的蛋白質(zhì)。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。下面的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā)明作任何限制。緩沖溶液1的組成見(jiàn)表1的實(shí)施例1-3表1實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3三羥甲基氨基甲烷5mmol/L10mmol/L20mmol/L谷氨酸鉀30mmol/L60mmol/L100mmol/L谷氨酸鎂10mmol/L14mmol/L20mmol/L二硫蘇糖醇0.5mmol/L1mmol/L2mmol/L2-巰基乙醇5mmol/L7mmol/L10mmol/L溶劑是去離子水補(bǔ)足至1L補(bǔ)足至1L補(bǔ)足至1L緩沖溶液2的組成見(jiàn)表2的實(shí)施例4-6表2實(shí)施例4實(shí)施例5實(shí)施例6三羥甲基氨基甲烷5mmol/L10mmol/L20mmol/L谷氨酸鉀30mmol/L60mmol/L100mmol/L谷氨酸鎂10mmol/L14mmol/L20mmol/L二硫蘇糖醇0.5mmol/L1mmol/L2mmol/L溶劑是去離子水補(bǔ)足至1L補(bǔ)足至1L補(bǔ)足至1L實(shí)施例7細(xì)胞破碎產(chǎn)物的制備：將培養(yǎng)后的酵母細(xì)胞(真核細(xì)胞)收集、懸浮、離心、用機(jī)械法破碎、保存。用實(shí)施例7的方法，制備麥胚細(xì)胞、粉紋夜蛾、草地夜蛾、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞的細(xì)胞破碎產(chǎn)物。用實(shí)施例7的方法，制備原核細(xì)胞大腸桿菌或枯草芽孢桿菌的細(xì)胞破碎產(chǎn)物。細(xì)胞破碎的方法除機(jī)械法外，還可以采用反復(fù)凍融法、超聲處理法、酶解法、堿裂解法或化學(xué)滲透法。用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物的配方見(jiàn)表3實(shí)施例8-10表3氨基酸混合液見(jiàn)表4實(shí)施例11-13表4反應(yīng)緩沖液見(jiàn)表5實(shí)施例14-16表5能量補(bǔ)充液見(jiàn)表6實(shí)施例17-19表6實(shí)施例17實(shí)施例18實(shí)施例19三磷酸尿苷1mmol/L2mmol/L3mmol/L三磷酸胞苷1mmol/L2mmol/L3mmol/L三磷酸腺苷1mmol/L2mmol/L3mmol/L三磷酸鳥(niǎo)苷3mmol/L6mmol/L9mmol/L去離子水補(bǔ)足至1L補(bǔ)足至1L補(bǔ)足至1L用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物見(jiàn)表7實(shí)施例20-22(體積比，單位為mL)表7基因質(zhì)粒可以購(gòu)買或通過(guò)基因改造獲得。pRset-CFP(購(gòu)于：PromegaCorporation)pRset-YFP(購(gòu)于：PromegaCorporation)pRset-eGFP(購(gòu)于：PromegaCorporation)上述質(zhì)粒的舉例是為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對(duì)其進(jìn)行限定，其它質(zhì)粒也可以用于本發(fā)明。實(shí)施例23一種基于人工多酶生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)合成蛋白質(zhì)的配方，包括：1)用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物(實(shí)施例8制備)；2)用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物；(實(shí)施例20制備)3)用于蛋白質(zhì)合成的基因質(zhì)粒pRset-CFP。實(shí)施例24一種基于人工多酶生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)合成蛋白質(zhì)的配方，包括：1)用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物(實(shí)施例9制備)；2)用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物；(實(shí)施例21制備)3)用于蛋白質(zhì)合成的基因質(zhì)粒pRset-YFP。實(shí)施例25一種基于人工多酶生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)合成蛋白質(zhì)的配方，包括：1)用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物(實(shí)施例10制備)；2)用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物；(實(shí)施例22制備)3)用于蛋白質(zhì)合成的基因質(zhì)粒pRset-eGFP。實(shí)施例26基于人工多酶生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)合成蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：按體積比為10：15：1的比例，將實(shí)施例8的用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物、實(shí)施例20的用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物和用于蛋白質(zhì)合成的基因質(zhì)粒pRset-CFP混合，置于恒溫反應(yīng)容器中，在30℃放置10min。實(shí)施例27基于人工多酶生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)合成蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：按體積比為20：35：1的比例，將實(shí)施例9的用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物、實(shí)施例21的用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物和用于蛋白質(zhì)合成的基因質(zhì)粒pRset-YFP混合，置于恒溫反應(yīng)容器中，在25℃放置12h。實(shí)施例28基于人工多酶生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)合成蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：按體積比為15：25：1的比例，將實(shí)施例10的用于蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞提取物、實(shí)施例22的用于蛋白質(zhì)合成的外加反應(yīng)物和用于蛋白質(zhì)合成的基因質(zhì)粒pRset-eGFP混合，置于恒溫反應(yīng)容器中，在37℃放置48h。實(shí)施例26、實(shí)施例27、實(shí)施例28合成的蛋白質(zhì)見(jiàn)圖1。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3