本發(fā)明涉及生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及用于生產(chǎn)泛酸的基因工程菌。

背景技術(shù)：

D-泛酸(D-pantothenic acid)又稱維生素B5，是水溶性維生素B族的一種，是CoA和?；d體蛋白ACP的重要前體，而據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫查閱，CoA(Kanechisa M，2006)參與的酶促反應(yīng)達(dá)400多種，涉及脂肪酸代謝，細(xì)胞信號傳遞，三羧酸循環(huán)等中心代謝反應(yīng)(Ganesh Samala，2015)。天然泛酸具有右旋光性，即D-泛酸，是一種重要的食品添加劑和飼料添加劑，也是一種重要的維生素藥物。臨床上用于治療維生素B缺乏癥、周圍神經(jīng)炎、手術(shù)后腸梗阻、鏈霉素中毒及類風(fēng)濕等疾病。

泛酸的商品形式主要為D-泛酸鈣。自20世紀(jì)40年代起，世界上已開始研究泛酸鈣的合成，60年代開始進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。目前，世界年產(chǎn)量約20000噸，主要生產(chǎn)公司有浙江鑫富藥業(yè)，新發(fā)藥業(yè)，山東華辰，帝斯曼以及巴斯夫等，其中浙江鑫富生化股份有限公司D-泛酸鈣年產(chǎn)量達(dá)7500噸，全球市場占有率達(dá)38.86％以上。中國在D-泛酸鈣的生產(chǎn)能力占世界總生產(chǎn)能力的60％，其中用于飼料行業(yè)產(chǎn)品占據(jù)了94％，而對于醫(yī)藥級和食品級的D-泛酸鈣仍然不能滿足內(nèi)需。

泛酸的合成有化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法主要采用stiller法，將異丁醛，氰化鈉法或者乙醛酸-異丁醛法合成DL-泛解酸內(nèi)酯，再將β丙氨酸鈣與DL-泛解酸內(nèi)酯直接縮合獲得DL-泛酸鈣(孫志浩，2002)，然后拆分獲得D-泛酸鈣。由于化學(xué)法存在底物毒性以及拆分中生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)量小，產(chǎn)品光學(xué)純度差等問題，研究者仍然在尋找能產(chǎn)生泛酸生物合成過程中有用的酶或微生物系統(tǒng)。生物法合成泛酸主要是在生物體內(nèi)，由α-酮異戊酸經(jīng)過通泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，酮泛解酸還原酶，L-天冬氨酸-α-脫羧酶，泛酸合成酶(PANC)的作用下生成泛酸(Christophe Chassagnole，2003)。泛酸合成酶是泛酸合成的最后一步，是泛酸合成的關(guān)鍵酶之一，是將β-丙氨酸和泛解酸在ATP的參與下形成泛酸。1990年，日本專利報道Miki Hiroshi等大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)來源于大腸桿菌IFO03301泛酸合成酶，添加DL-泛解酸和β-丙氨酸的方法，得到D-泛酸，發(fā)酵60h，產(chǎn)泛酸117.5g/L(EP493060，1992)。1994年，Hikichi Yuichi等人開發(fā)了從葡萄糖生物合成D-泛解酸的大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)大腸桿菌FV525泛酸合成酶的方法，僅添加β-丙氨酸，培養(yǎng)72h，直接發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生D-泛酸達(dá)65.4g/L(US5932457，1999)2005年，巴斯夫的專利CN02803857.6報道的用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)通過表達(dá)來源于枯草芽孢桿菌的panBCD，panE1，panE2，ilvD，ilvBNC，glyA等基因生產(chǎn)泛酸，發(fā)酵48h產(chǎn)量達(dá)86g/L。以上均為大腸桿菌或者枯草芽孢桿菌表達(dá)自身或者同種的泛酸合成酶，而對于異源表達(dá)的泛酸合成酶報道的較少，發(fā)酵時間較長。而目前泛酸合成酶的研究報道主要集中在發(fā)展一些Mycobacterium tuberculosis泛酸合成酶結(jié)構(gòu)，機(jī)理以及一些小分子抑制劑等(Yaw Sing Tan，2011)，而對于其他來源的泛酸合成酶(PANC)的研究報道卻非常少，1978年，Kazutaka Miyatake等報道的來源于E.coli B的泛酸合成酶酶活2.05μmol/min/mg，1999年，Hermann Sahm報道的來源于谷氨酸棒狀桿菌的酶活12nmol/min/mg蛋白，2008年，Silvia Ronconi等報道的來源于Methanosarcina mazei的泛酸合成酶的酶活為0.14μmol/min/mg，報道的酶活都較低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的是高效、環(huán)保合成泛酸，由于化學(xué)法合成泛酸存在底物毒性以及拆分中生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)量小，產(chǎn)品光學(xué)純度差等問題；而微生物法合成泛酸主要是大腸桿菌或者枯草芽孢桿菌表達(dá)自身或者同種的泛酸合成酶來實現(xiàn)合成泛酸，其中酶活性是合成效率的決定環(huán)節(jié)，目前的酶活性都較低。

本發(fā)明為了尋找到高活性的泛酸合成酶菌株，通過大量的實驗發(fā)現(xiàn)：通過在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)篩選不同來源的泛酸合成酶，通過比較，獲得高活性的泛酸合成酶菌株，添加底物D-泛解酸和β-丙氨酸，生產(chǎn)泛酸，即篩選6種不同來源的泛酸合成酶，構(gòu)建基因工程菌株，通過酶活比較，提供了泛酸合成酶活性高的工程菌，用以高效合成泛酸。

本發(fā)明的工程菌，通過如下方法構(gòu)建：

(1)酶的選取

選取了來源于大腸桿菌，谷氨酸棒狀桿菌，枯草芽孢桿菌,蠟樣芽胞桿菌，陰溝腸桿菌，蘇云金芽孢桿菌等菌株的泛酸合成酶基因。

(2)高效表達(dá)系統(tǒng)的選擇

選取了高效表達(dá)蛋白的宿主大腸桿菌BL21(DE3)，高效表達(dá)載體PET30將不同來源的基因連入高效表達(dá)載體PET30，然后轉(zhuǎn)入高效表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)。

(3)檢測酶活

獲得高活性的泛酸合成酶菌株對高酶活的菌株進(jìn)行發(fā)酵，獲得高產(chǎn)泛酸的菌株。

與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的效果和優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明采用高效的大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)，異源表達(dá)多種不同來源的泛酸合成酶，獲得高活性的泛酸合成酶菌株。該菌種具有活性高、發(fā)酵時間短、產(chǎn)量高等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1工程菌E.coli BL21(DE3)/PET30-panC_C的泛酸合成圖。

具體實施方式

實施例1

基因工程菌的構(gòu)建

分別選取來源于大腸桿菌(Escherichia coli BL21(DE3))，谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)，蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus E33L)，陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae EcWSU1)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis BMB171)，同時使用了大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)/PET30構(gòu)建基因工程菌。

以大腸桿菌(E.coliBL21(DE3))panc基因(序列表1)為模板，用引物E-panc-for和E-panc-rev分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得片段panC_E，將PCR產(chǎn)物panC_E片段經(jīng)過1％的瓊脂糖電泳回收，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH 1和Xho 1雙酶切后連接到同樣酶切后的載體pET30上，獲得重組質(zhì)粒pET30-panC_E，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性重組子，限制性內(nèi)切酶BamH 1和Xho1雙酶切鑒定插入片段大小，然后經(jīng)測序獲得正確的陽性克隆E.coli DH5α/pET30-panC_E。測序正確后再將質(zhì)粒pET30-panC_E轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)宿主，獲得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_E。

以谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicumATCC 13032)panc基因(序列表2)為模板，利用引物C-panc-for和C-panc-rev分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得片段panC_C；將PCR產(chǎn)物panC_C片段經(jīng)過1％的瓊脂糖電泳回收，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde 1和Kpn 1雙酶切后連接到同樣酶切后的載體pET30上，獲得重組質(zhì)粒pET30-panC_C；轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性重組子，限制性內(nèi)切酶Nde 1和Kpn 1雙酶切鑒定插入片段大小，然后經(jīng)測序獲得正確的陽性克隆E.coli DH5α/pET30-panCc。測序正確后再將質(zhì)粒pET30-panC_C轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)宿主，獲得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_C。

以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilissubsp.subtilis str.168)panc基因(序列表3)為模板，利用引物B-panc-for和B-panc-rev，將PCR產(chǎn)物panC_C片段經(jīng)過1％的瓊脂糖電泳回收，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde 1和Kpn 1雙酶切后連接到同樣酶切后的載體pET30上，獲得重組質(zhì)粒pET30-panC_b，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性重組子，限制性內(nèi)切酶Nde 1和Kpn 1雙酶切鑒定插入片段大小，然后經(jīng)測序獲得正確的陽性克隆E.coli DH5α/pET30-panC_b。測序正確后再將質(zhì)粒pET30-panC_b轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)宿主，獲得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_b。

以蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus E33L)panc基因(序列表4)為模板，利用引物BC-panc-for和BC-panc-rev，將PCR產(chǎn)物panC_bc片段經(jīng)過1％的瓊脂糖電泳回收，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde 1和Kpn 1雙酶切后連接到同樣酶切后的載體pET30上，獲得重組質(zhì)粒pET30-panC_bc，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性重組子，限制性內(nèi)切酶Nde 1和Kpn 1雙酶切鑒定插入片段大小，然后經(jīng)測序獲得正確的陽性克隆E.coli DH5α/pET30-panC_bc。測序正確后再將質(zhì)粒pET30-panC_bc轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)宿主，獲得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_bc。

以陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae EcWSU1)panc基因(序列表5)為模板，利用引物EC-panc-for和EC-panc-rev，將PCR產(chǎn)物panC_ec片段經(jīng)過1％的瓊脂糖電泳回收，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde 1和Xho 1雙酶切后連接到同樣酶切后的載體pET30上，獲得重組質(zhì)粒pET30-panC_ec，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性重組子，限制性內(nèi)切酶Nde 1和Xho 1雙酶切鑒定插入片段大小，然后經(jīng)測序獲得正確的陽性克隆E.coli DH5α/pET30-panC_ec。測序正確后再將質(zhì)粒pET30-panC_ec轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)宿主，獲得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_ec。

以蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis BMB171)panc基因(序列表6)為模板，利用引物BT-panc-for和BT-panc-rev，將PCR產(chǎn)物panC_bt片段經(jīng)過1％的瓊脂糖電泳回收，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde 1和Kpn 1雙酶切后連接到同樣酶切后的載體pET30上，獲得重組質(zhì)粒pET30-panC_bt，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性重組子，限制性內(nèi)切酶Nde 1和Kpn 1雙酶切鑒定插入片段大小，然后經(jīng)測序獲得正確的陽性克隆E.coli DH5α/pET30-panC_bt。測序正確后再將質(zhì)粒pET30-panC_bt轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)宿主，獲得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_bt。

表一，實施案例1中菌株構(gòu)建所涉及的引物和序列

實施例2

基因工程菌株酶活檢測

從平板上分別挑取E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_E，E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_C，E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_b，E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_bc，E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_ec和E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_bt單菌落接種于5mL的LB培養(yǎng)基(含50μg/ml Kan)37℃過夜培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)液1:100轉(zhuǎn)接于20mL的LB培養(yǎng)基(含50μg/ml Kan)，37℃培養(yǎng)，OD達(dá)到0.4-0.6時，加0.2mM的IPTG，30℃培養(yǎng)16h。收集10OD菌體，用1ml緩沖液(100mM Hepes，20mM MgCl₂.6H₂O，1mM EDTA，pH8.0)懸浮，然后超聲波破碎菌體細(xì)胞，離心取上清稀釋10倍。取稀釋后液體5μL，加入1.1mL反應(yīng)緩沖液(25mMβ-alanine，25mM DL-pantoic acid，4.5mM ATP，10mM MgCl₂，15mM KCl)。37℃，反應(yīng)20min，12000r/min離心取上清，用于HPLC檢測。

HPLC檢測方法：檢測樣品后使用Agilent色譜柱(Eclipse XDB-C18，5μm，4.6×250mm)分離。流動相(95％，50mM NH₄H₂PO₄(用磷酸調(diào)至pH3.0)，5％乙腈)，流速0.5mL/min。紫外檢測210nm。每分鐘生成1μmol產(chǎn)物所需要的酶量定義為一個酶活單位。

結(jié)果：上述構(gòu)建的不同來源的工程菌泛酸合成酶的酶活見表二，來源谷氨酸棒狀桿菌的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panCc的酶活最高，為35.3U/mL。

表二泛酸合成酶酶活

實施例3

高密度發(fā)酵

(1)從平板上挑取含有谷氨酸棒桿菌的泛酸合成酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/PET30-panC_C單菌落，接種于10mL的LB液體培養(yǎng)基((酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L))中，37℃過夜培養(yǎng)；

(2)取3mL轉(zhuǎn)接到100mL的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，(NH₄)₂SO₄ 9g/L，Na₂CO₃2g/L，KH₂PO₄ 6.67g/L，(NH₄)₂HPO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，檸檬酸0.8g/L,NaHCO₃2g/L，離子母液5mL，pH 7.0)中，50μg/ml卡那霉素(Kan)，37℃培養(yǎng)12h；

(3)將第二步中的100ml的培養(yǎng)基中取60ml，1:10轉(zhuǎn)接到含有600mL的發(fā)酵培養(yǎng)基的1L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溶氧控制15％，30℃培養(yǎng)；發(fā)酵第8h添加補(bǔ)料(葡萄糖，650g/L)；發(fā)酵第9h添加IPTG(終濃度0.057mM)和150ml底物(45g泛解酸內(nèi)酯(用NaOH溶液將底物液體調(diào)節(jié)pH＝7.0)和30gβ-丙氨酸)；發(fā)酵第22h添加150ml底物(45g泛解酸內(nèi)酯(用NaOH溶液將底物液體調(diào)節(jié)pH＝7.0)和30gβ-丙氨酸)，結(jié)果如圖1，發(fā)酵第38h，泛酸達(dá)101.2g/L。

序列表

<110> 中國科學(xué)院微生物研究所

<120> 一種高效合成泛酸的質(zhì)粒及其基因工程菌

<160> 8

<210> 1

<211> 852

<212> DNA

<213> 大腸桿菌（Escherichia coli BL21(DE3)）

<400> 1

gtgttaatta tcgaaaccct gccgctgctg cgtcagcaaa ttcgccgcct gcgtatggaa 60

ggcaagcgcg tggcgctggt gcctaccatg ggtaacctgc acgatggcca tatgaagctg 120

gtcgacgaag ccaaagcccg cgccgatgtg gtcgtcgtca gtattttcgt taacccgatg 180

cagttcgacc gcccggaaga tctggctcgt tatccacgca ccttgcagga ggactgcgaa 240

aagctaaaca aacgtaaagt ggatttagtt ttcgcccctt cggtaaaaga gatctacccg 300

aacggtactg aaacccacac ttacgttgac gttcctggcc tttcgaccat gctggaaggt 360

gccagccgtc cgggacattt tcgcggcgtt tcgactattg tcagcaagct gttcaacctg 420

gtccagccgg acatcgcctg cttcggtgaa aaagattttc agcaactggc gctgatccgc 480

aaaatggttg ctgatatggg ctttgatatt gagattgtcg gtgtgccaat tatgcgcgcc 540

aaagacggtc tggcgctgag ttcccgtaac ggttatctga cggcggaaca acgcaaaatt 600

gcgcccggtc tgtacaaagt tttaagttcg attgccgaca aattgcaggt tggcgaacgg 660

gatctcgatg aaattattac tattgccggg caagaactga atgaaaaagg cttccgcgcc 720

gatgatattc agattcgcga tgccgacacg ttgctggaag tttctgaaac cagcaaacgg 780

gcagtaattc tggtagccgc ctggcttggc gatgctcgcc tgatcgacaa caaaatggtc 840

gagctggcgt aa 852

<210> 2

<211> 840

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum ATCC 13032）

<400> 2

atgcaggtag caaccacaaa gcaggcgctt atcgacgccc tcctccacca caaatccgtc 60

gggctcgtcc ccaccatggg tgcgctacac agcggacacg cctcgttggt taaagcagca 120

cgcgctgaaa acgacactgt tgtagccagt atttttgtca atcccctgca gtttgaagca 180

ctcggtgatt gcgatgatta ccgcaactat ccccgccaac tcgacgccga tttagcactg 240

cttgaagagg caggtgtgga tattgtgttc gcacccgatg tggaggaaat gtaccccggt 300

ggcttgccac tagtgtgggc gcgcaccggt tccatcggaa caaaattgga gggtgccagc 360

aggcctggcc atttcgatgg tgtggctacc gtggtggcga agctgttcaa tttggtgcgc 420

cctgatcgtg catattttgg acaaaaagat gctcagcagg ttgcggtgat tcggcgattg 480

gttgccgatc tagacattcc cgtggagatt cgtcccgttc cgattattcg tggcgccgat 540

ggcttagccg aatccagccg caatcaacgt ctttctgcgg atcagcgagc gcaagctctg 600

gtgctgccgc aggtgttgag tgggttgcag cgtcgaaaag cagctggtga agcgctagat 660

atccaaggtg cgcgcgacac cttggccagc gccgacggcg tgcgcttgga tcacctggaa 720

attgtcgatc cagccaccct cgaaccatta gaaatcgacg gcctgctcac ccaaccagcg 780

ttggtggtcg gcgcgatttt cgtggggccg gtgcggttga tcgacaatat cgagctctag 840

<210> 3

<211> 861

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）

<400> 3

atgagacaga ttactgatat ttcacagctg aaagaagcca taaaacaata ccattcagag 60

ggcaagtcaa tcggatttgt tccgacgatg gggtttctgc atgaggggca tttaacctta 120

gcagacaaag caagacaaga aaacgacgcc gttattatga gtatttttgt gaatcctgca 180

caattcggcc ctaatgaaga ttttgaagca tatccgcgcg atattgagcg ggatgcagct 240

cttgcagaaa acgccggagt cgatattctt tttacgccag atgctcatga tatgtatccc 300

ggtgaaaaga atgtcacgat tcatgtagaa agacgcacag acgtgttatg cgggcgctca 360

agagaaggac attttgacgg ggtcgcgatc gtactgacga agcttttcaa tctagtcaag 420

ccgactcgtg cctatttcgg tttaaaagat gcgcagcagg tagctgttgt tgatgggtta 480

atcagcgact tcttcatgga tattgaattg gttcctgtcg atacggtcag agaggaagac 540

ggcttagcca aaagctctcg caatgtatac ttaacagctg aggaaagaaa agaagcgcct 600

aagctgtatc gggcccttca aacaagtgcg gaacttgtcc aagccggtga aagagatcct 660

gaagcggtga taaaagctgc aaaagatatc attgaaacga ctagcggaac catagactat 720

gtagagcttt attcctatcc ggaactcgag cctgtgaatg aaattgctgg aaagatgatt 780

ctcgctgttg cagttgcttt ttcaaaagcg cgtttaatag ataatatcat tattgatatt 840

cgagaaatgg agagaatata a 861

<210> 4

<211> 850

<212> DNA

<213> 蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus E33L）

<400> 4

atgaaaatcg taacgacagt acaagagatg cagcacatta caaaagaact gcgtgcaagt 60

ggaaaaagta ttggttttgt cccaacgatg gggtatttac atgaaggtca tgcgacttta 120

ttacgtaagg caagagaaga aaatgaaatt gtagttttaa gcgtgtttgt aaatccacta 180

cagtttggac cgaatgaaga tttagatcga tatcctcgtg atattgatag agatgaaaat 240

gtagcaaaag aaaacggtgt agattattta ttttatccga gtgtagaaga aatgtatcca 300

gcagaacaaa cgacaacggt agaagttgtg aagcgtaccg atgtattatg cggtaaacaa 360

agaccaggtc atttcgctgg tgttgcgact gtactcatga aactatttaa cattacattg 420

ccaacacgcg cgtatttcgg tatgaaagat gcacagcaag ttgctgtcat tgaaggattt 480

gtcgctgatt ttaatattcc ggttacaatc gtacgggtgg atattgtaag ggaagaagat 540

ggattagcga aaagttctcg taacgtgtat ttatcacaag aagagcgtaa agaggctcct 600

catttatacc gcagtctatg tatggcaaaa gaaagaattg aggcaggaga acgtaatgca 660

gaaattatta caactcttgt aaaagaatat attgagacgt atacgaaagg cactgtagat 720

tatgctgatt tatatgccta cccttcacta caagtagtgg atcaaattga agggcgaatc 780

attttagcaa ttgcagttaa atttgaaaat gtacgattaa ttgacaatat aacattaacg 840

gttaaataa 850

<210> 5

<211> 852

<212> DNA

<213> 陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae EcWSU1）

<400> 5

gtgctaatca ttgaaaccct gccgctgctt cgccagcata tccgtcgtgc acgtcaggaa 60

ggtaaacgta tcgcactggt tcccacgatg ggtaacctgc atgacggcca catgaagctt 120

gtcgatgaag ccagagcgcg tgcagatgtc gtggtggtca gtatcttcgt gaaccccatg 180

caatttgacc gtgccgacga cctggcgcgc tatccgcgca ccctgcagga agattgcgaa 240

aaactcaaaa aacgccacgc ggatattgtc ttctctccgg cacctgcaga cgtctacccg 300

caggggaccg aggacgcgac ctacgtggac gtgccgggca tttcaaccat gctggaaggc 360

gccagccgtc cgggccattt ccgcggcgtt tcaaccatcg tcagcaagct gtttaacctg 420

gtgcagcccg acgttgcctg cttcggtgag aaggacttcc agcagctggc gttgatccgt 480

aagatggtcg ccgacatggg ttatgatatt gagatcgtgg gcgtgccgat tgtgcgtgcc 540

aaagacggtc tggcgctcag ttcccgtaac gggtacctta ccgcggatga gcgtaaaatc 600

gcgccgggat tgagcaaggt catgaatacc atggcggaac agcttgtggc taaagagctg 660

agtgcagaag agatcgttgc cctcgccgaa caggcgctga acgacaaagg cttccgcgct 720

gacgatatcc aaatccgtga tgccgatacg ctgcttgagc tgaccgatac cagcaagcgc 780

gcggtgcttc tggtggctgc atggctcggt caggcacgcc ttatcgacaa taaagtggtt 840

gagctggcat aa 852

<210> 6

<211> 849

<212> DNA

<213> 蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis BMB171）

<400> 6

atgaaaatcg taactacagt gcaagagatg cagcaaatta cgagcgaact tcgtgcaagt 60

ggaaagagta ttggttttgt tccaacaatg ggttatttac atgaaggcca tgctacttta 120

ttacgtaagg caagagaaga aaatgaaact gtagttttaa gtgtatttgt aaacccacta 180

caatttggcc caaatgaaga tttagatcga tatcctcgtg atattgatag agatgaaaat 240

gtagcaaaag aaaacggtgt agattattta ttttatccga gtgtagaaga aatgtatcca 300

gcagaacaaa caacaacggt agaagttgtg aagcgcacgg acgtattatg cggtcaacaa 360

agacctggtc attttgctgg tgttgcaact gtactaatga aactatttaa tattacgctg 420

ccaaatcgtg cttatttcgg tatgaaagat gctcaacaag ttgcagtaat tgaaggattt 480

gtaactgatt tcaatattcc agttacaatc gtaccagttg atattgtaag ggaagaagat 540

ggtttagcga aaagttctcg taacgtgtac ctatcacaag atgaacgtga agaagctctt 600

catttatacc gcagcctatg tatggcgaaa gaaagaattg aggcaggtga acgtaatccg 660

gaaatcatta caaatcttgt gaaagagtat attgagacgc atacgaaagg cactgtagat 720

tatgcagatt tatatgcata tccgtcatta acaatggtag agaaagtcga aggaagaatc 780

attttagcta ttgcagttaa gtttgaaaat gtaagattaa ttgacaatat aacattaacg 840

gttaaataa 849

<210> 7

<211> 6157

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum ATCC 13032）

<400> 7

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga tctcgatccc 4980

gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 5040

ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgat gcaggtagca accacaaagc 5100

aggcgcttat cgacgccctc ctccaccaca aatccgtcgg gctcgtcccc accatgggtg 5160

cgctacacag cggacacgcc tcgttggtta aagcagcacg cgctgaaaac gacactgttg 5220

tagccagtat ttttgtcaat cccctgcagt ttgaagcact cggtgattgc gatgattacc 5280

gcaactatcc ccgccaactc gacgccgatt tagcactgct tgaagaggca ggtgtggata 5340

ttgtgttcgc acccgatgtg gaggaaatgt accccggtgg cttgccacta gtgtgggcgc 5400

gcaccggttc catcggaaca aaattggagg gtgccagcag gcctggccat ttcgatggtg 5460

tggctaccgt ggtggcgaag ctgttcaatt tggtgcgccc tgatcgtgca tattttggac 5520

aaaaagatgc tcagcaggtt gcggtgattc ggcgattggt tgccgatcta gacattcccg 5580

tggagattcg tcccgttccg attattcgtg gcgccgatgg cttagccgaa tccagccgca 5640

atcaacgtct ttctgcggat cagcgagcgc aagctctggt gctgccgcag gtgttgagtg 5700

ggttgcagcg tcgaaaagca gctggtgaag cgctagatat ccaaggtgcg cgcgacacct 5760

tggccagcgc cgacggcgtg cgcttggatc acctggaaat tgtcgatcca gccaccctcg 5820

aaccattaga aatcgacggc ctgctcaccc aaccagcgtt ggtggtcggc gcgattttcg 5880

tggggccggt gcggttgatc gacaatatcg agctctaggg taccgacgac gacgacaagg 5940

ccatggctga tatcggatcc gaattcgagc tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag 6000

caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 6060

gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 6120

aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggat 6157

<210> 8

<211> 299

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum ATCC 13032）

<400> 8

Met Gln Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His

1 5 10 15

His Lys Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly

20 25 30

His Ala Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val

35 40 45

Ala Ser Ile Phe Val Asn Pro Leu Gln Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys

50 55 60

Asp Asp Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gln Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu

65 70 75 80

Leu Glu Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu

85 90 95

Met Tyr Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile

100 105 110

Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val

115 120 125

Ala Thr Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala

130 135 140

Tyr Phe Gly Gln Lys Asp Ala Gln Gln Val Ala Val Ile Arg Arg Leu

145 150 155 180

Val Ala Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile

185 190 195

Arg Gly Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gln Arg Leu Ser

200 205 210

Ala Asp Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val Leu Pro Gln Val Leu Ser Gly

215 220 225

Leu Gln Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gln Gly Ala

230 235 240

Arg Asp Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu

245 250 255 260

Ile Val Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu

265 270 275

Thr Gln Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg

280 285 290

Leu Ile Asp Asn Ile Glu Leu

295