本發(fā)明涉及一種α-吡喃酮衍生物，尤其是涉及一種用海洋青霉菌制備一種α-吡喃酮衍生物的方法以及該類化合物在制備白色念珠菌抑制劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

α-吡喃酮是一類含有不飽和鍵的六元環(huán)內(nèi)酯，廣泛存在于很多天然產(chǎn)物和中，研究發(fā)現(xiàn)擁有α-吡喃酮環(huán)的許多化合物具有多種生物活性，在抗炎、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒治療、阿爾茲海默癥等方面表現(xiàn)出重要的作用。本發(fā)明人研究得知，海洋青霉菌penicilliumdipodomyicoladj008（保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：cctccno:m2014087）的固體發(fā)酵的乙酸乙酯提取物有較好的抗白色念珠菌活性，遂對(duì)其活性成分進(jìn)行了研究。目前尚未見該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗白色念珠菌活性的報(bào)道，因此市場(chǎng)上也尚未見有與此相關(guān)的藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有抗白色念珠菌活性的α-吡喃酮衍生物及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：

一種α-吡喃酮衍生物，該α-吡喃酮衍生物的結(jié)構(gòu)式如ⅰ所示：

（i）。

上述α-吡喃酮衍生物的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）發(fā)酵生產(chǎn)

將保藏號(hào)為cctccno.m2014087的青霉（penicilliumdipodomyicoladj008）劃線復(fù)活轉(zhuǎn)接到pdb培養(yǎng)基中，于28℃、180r/min培養(yǎng)4天，獲得種子培養(yǎng)液；之后按照體積比10%的接種量將種子液接種到大米培養(yǎng)基中，于28℃靜置培養(yǎng)35天，獲得發(fā)酵物；

（2）浸膏的獲得

將上述發(fā)酵物用4l甲醇浸泡3次，而后對(duì)甲醇浸提液濃縮蒸干，用1l的水復(fù)溶，再用1l乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，合并三次萃取所得萃取液，將萃取液減壓濃縮除去乙酸乙酯，獲得粗浸膏；

（3）化合物的分離精制

將上述粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶劑溶解后，加200-300目硅膠拌樣，采用石油醚/乙酸乙酯以體積比8:1梯度為洗脫劑進(jìn)行洗脫，對(duì)粗浸膏進(jìn)行減壓硅膠柱層析，收集洗脫組分，再經(jīng)過(guò)半制備反相高效液相色譜進(jìn)行分離純化得到α-吡喃酮衍生物，其結(jié)構(gòu)如式i所示：

（i）。

步驟（1）所述的大米培養(yǎng)基的配制方法如下：將80g大米溶于120ml海水，浸泡過(guò)夜后，于121℃高壓滅菌20min即可。

步驟（3）所述的二氯甲烷和甲醇混合溶劑中二氯甲烷與甲醇的體積比為1：1。

步驟（3）所述的半制備反相高效液相色譜的洗脫液為甲醇與水按體積比60:40的比例混合。

上述α-吡喃酮衍生物的應(yīng)用，所述的α-吡喃酮衍生物在用于制備白色念珠菌抑制劑方面的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明一種α-吡喃酮衍生物及其制備方法和應(yīng)用，通過(guò)微生物發(fā)酵培養(yǎng)來(lái)獲取含新α-吡喃酮衍生物的發(fā)酵物，然后將發(fā)酵物用甲醇浸泡、乙酸乙酯提取，得粗浸膏，將該粗浸膏經(jīng)減壓硅膠柱層析和反相半制備高效液相色譜分離純化得到，該α-吡喃酮衍生物具有抗白色念珠菌作用，可以作為白色念珠菌的抑制劑成分或其他抗真菌的藥物先導(dǎo)化合物。

上述青霉（penicilliumdipodomyicola），該菌為dj008菌株，保藏編號(hào)為cctccno.m2014087，于2014年03月14日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

一種α-吡喃酮衍生物結(jié)構(gòu)式如ⅰ所示：

（i）。

實(shí)施例2

如i式所示的α-吡喃酮衍生物的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）發(fā)酵生產(chǎn)

將保藏號(hào)為cctccno.m2014087的青霉（penicilliumdipodomyicoladj008）劃線復(fù)活，轉(zhuǎn)接到裝有100mlpdb培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，于28℃、180r/min培養(yǎng)4天，獲得種子培養(yǎng)液；之后按照10%的接種量將種子液接種到裝有大米培養(yǎng)基（將80g大米溶于120ml海水，浸泡過(guò)夜后，于121℃高壓滅菌20min即可）的1000ml錐形瓶中，28℃靜置培養(yǎng)35天，獲得發(fā)酵物；

（2）浸膏的獲得

將上述發(fā)酵物用4l甲醇浸泡3次，而后對(duì)甲醇浸提液濃縮蒸干，用1l的水復(fù)溶，再用1l乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，合并三次萃取所得萃取液，將萃取液減壓濃縮除去乙酸乙酯，獲得粗浸膏；

（3）化合物的分離精制

將上述粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶劑（其中二氯甲烷與甲醇的體積比為1：1）溶解后，加200-300目硅膠拌樣，采用石油醚/乙酸乙酯以體積比8:1梯度為洗脫劑進(jìn)行洗脫，對(duì)粗浸膏進(jìn)行減壓硅膠柱層析，收集洗脫組分，再經(jīng)過(guò)半制備反相高效液相色譜（采用的洗脫液為甲醇與水按體積比60:40的比例混合）進(jìn)行分離純化得到α-吡喃酮衍生物，其結(jié)構(gòu)如式i所示：

（i）。

該化合物ⅰ，白色粉末，分子式c16h17no5，陽(yáng)離子hresimsm/z：304.1183[m+h]⁺，¹h和¹³c-nmr數(shù)據(jù)見表1。

表1化合物ⅰ的¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)（600和150mhz，incdcl3）

實(shí)施例3

體外抗白色念珠菌活性的測(cè)試（96孔板抑菌法）

（1）實(shí)驗(yàn)樣品

被測(cè)樣品溶液的配制：測(cè)試樣品為上述實(shí)施例1中分離純化的化合物ⅰ純品，精密稱取適量樣品，用dmso配制成所需濃度的溶液，供測(cè)活性。

（2）實(shí)驗(yàn)方法

96孔板抗白色念珠菌測(cè)試方法：將待測(cè)化合物逐級(jí)稀釋在20％dmso/鹽水中，并轉(zhuǎn)移10μl到96孔平底微孔板中。在需氧條件下，將白色念珠菌菌株于30℃條件下在沙氏瓊脂培養(yǎng)基(sda)培養(yǎng)16-20小時(shí)。加入一系列不同濃度的化合物置于rpmi1640培養(yǎng)基中，并接種白色念珠菌菌株，在35℃培養(yǎng)46小時(shí)。8μg/ml氟康唑用作陽(yáng)性對(duì)照，dmso溶液作為陰性對(duì)照。待測(cè)化合物的濃度分別為1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml。培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定600nm下吸光值，根據(jù)如下公式計(jì)算抑制率。抑制率（%）=(odr-od)/(odr-odb)

odr：菌液對(duì)照孔吸光值；odb：空白吸光值；od：樣品測(cè)定孔吸光值。

（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在96孔板抗真菌測(cè)試中，不同濃度的化合物ⅰ對(duì)白色念珠菌抑制結(jié)果分別見表2。

表2不同濃度的化合物ⅰ對(duì)白色念珠菌的抑制率（%）

由上表可知化合物ⅰ具有顯著的抗白色念珠菌的作用，可作為白色念珠菌抑制劑或其他抗真菌藥物先導(dǎo)化合物的研究。

上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。