本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

Glynou等通過在免疫層析試紙條的質(zhì)控線與檢測線上分別噴涂鏈霉親和素和polyA，利用生物素-親和素放大系統(tǒng)加快產(chǎn)物在固相載體膜上的反應(yīng)，當(dāng)標(biāo)記有polyT的膠體金與帶有polyA的擴增產(chǎn)物在試紙條上雜交時，大量膠體金顆粒富集在檢測線處顯色，即可用肉眼進(jìn)行判讀結(jié)果(Glynou et al,2003)。Cater等建立了核酸試紙條技術(shù)，并通過試驗證明了這一技術(shù)具有較高的敏感性。通過核酸試紙條可在復(fù)雜的核酸混合物中檢測到特定的分子標(biāo)簽，檢測用量低至250Amol。這種核酸試紙條技術(shù)減少了傳統(tǒng)檢測中試劑的消耗和檢測時間(Carter et al,2007)，有利于在基層檢測中推廣應(yīng)用。

新型鴨呼腸孤病毒(NDRV)病，是由分節(jié)段的dsRNA病毒引起的，以肝臟不規(guī)則壞死，出血斑點和心肌，法氏囊出血為主要癥狀的新疫病。目前，對該病毒的檢測方法有多種，但都存在一定的缺陷：如常規(guī)的血清學(xué)檢測方法靈敏性不夠高；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法需要昂貴PCR儀器、操作條件苛刻且操作過程復(fù)雜，檢測時間過長，不能滿足現(xiàn)場及基層快速檢測需要；現(xiàn)有新型鴨呼腸孤病毒的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)快速檢測方法極易出現(xiàn)假陽性問題。

因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種RT-LAMP核酸試紙條檢測方法及應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有的新型鴨呼腸孤病毒檢測方法檢測靈敏度不高，需要大型儀器且操作復(fù)雜以及檢測結(jié)果易出現(xiàn)假陽性的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其中，包括如下引物組和核酸檢測試紙條:

所述引物組的核苷酸序列如下所示：

外引物：F3：5’-CGTGGATGGTCAAAGTCGT-3’；

B3：5’-ACCTACACTCCAGGAAGGAC-3’；

內(nèi)引物：FIP：

5-Biotin-TAGTTCTGGCATGGCCTCGC-CTTTACATGTGCTGCAGGGA-3’；

BIP：

5-Fitc-TGTTCGGACGTTCTCTTCCGGA-TTTAATGGCGCGGACGAC-3’；

環(huán)引物：LoopF：5’-AGCCTAGATTCGCACTCCG-3’；

LoopB：5’-CGAGGAGACTACCCACGTT-3’。

所述的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其中，用生物素和熒光素對上述引物組中的引物進(jìn)行標(biāo)記。

所述的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其中，還包括：硫酸鎂、甜菜堿、dNTPs、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、Bst聚合酶、緩沖液。

所述的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其中，RT-LAMP反應(yīng)的初始反應(yīng)體系包括：濃度為100mmol/L的硫酸鎂、濃度為5mmol/L的甜菜堿、濃度為2.5mmol/L的dNTPs、濃度為10U/μL的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、濃度為8U/μL的Bst聚合酶、RNase-free water的加入量為3.7μL、緩沖液的加入量為2.5μL、外引物的濃度為10μmol/L、環(huán)引物的濃度為10μmol/L、內(nèi)引物的濃度為10μmol/L。

所述的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其中，包含以下步驟：

(1)配置RT-LAMP反應(yīng)體系：按終濃度計算，濃度為0～6mmol/L的硫酸鎂、濃度為0～1.5mmol/L的甜菜堿、濃度為0.2～0.7mmol/L的dNTPs、濃度為0.06～0.16U/μL的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、濃度為0.08～0.48U/μL的Bst聚合酶、RNase-free water將反應(yīng)體系的總體積補足至25μL、緩沖液的加入量為反應(yīng)體系總體積的0～16％、內(nèi)引物與外引物的終濃度比為2:1～12:1、環(huán)引物與外引物的終濃度比為0～6:1、待測樣品RNA的加入量為2μL；

(2)反應(yīng)：將步驟(1)中的反應(yīng)體系恒溫反應(yīng)，然后將反應(yīng)后的產(chǎn)物用核酸檢測試紙條檢測，10～30min后讀取檢測結(jié)果；

(3)檢測結(jié)果判讀：

陰性：當(dāng)核酸檢測試紙條位于質(zhì)控區(qū)的條帶呈紅色，檢測區(qū)無條帶時，則表明待測目標(biāo)未被新型鴨呼腸孤病毒感染；

陽性：當(dāng)核酸檢測試紙條出現(xiàn)分別位于質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)的兩條紅色條帶時，則表明待測目標(biāo)已被新型鴨呼腸孤病毒感染；

無效：當(dāng)核酸檢測試紙條質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)均未出現(xiàn)條帶時，則表明檢測過程無效。

所述的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其中，步驟(1)中，內(nèi)引物終濃度為2.0μmol/L，外引物終濃度為0.2μmol/L，環(huán)引物的終濃度為0.8μmol/L。

所述的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其中，步驟(1)中，硫酸鎂的終濃度為3mmol/L、甜菜堿的終濃度為0.5mmol/L、dNTPs的終濃度為0.3mmol/L、AMV反轉(zhuǎn)錄酶的終濃度為0.14U/μL的、Bst聚合酶的終濃度為0.32U/μL。

所述的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其中，上述步驟(2)中的恒溫反應(yīng)的溫度為59～66℃。

所述的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其中，上述步驟(2)中的恒溫反應(yīng)的時間為10～60min。

所述的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其中，上述步驟(2)中的恒溫反應(yīng)條件為65℃反應(yīng)50min。

有益效果：本發(fā)明提供了一種RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用，通過在線引物設(shè)計軟件設(shè)計和篩選出了一套特異性好的新型鴨呼腸孤病毒的RT-LAMP反應(yīng)引物組，將該引物組應(yīng)用在RT-LAMP反應(yīng)中，并用核酸試紙條對RT-LAMP反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測，該檢測方法簡單易行、檢測結(jié)果的響應(yīng)速度快、且檢測靈敏度高，特異性好，能夠有效避免假陽性檢測結(jié)果的產(chǎn)生。

附圖說明

圖1為本發(fā)明酶切鑒定引物特異性檢測結(jié)果圖，其中：

泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1為酶切產(chǎn)物、泳道2為陽性、泳道3為ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖2為本發(fā)明RT-LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果圖，其中：

泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～9分別為66℃、65℃、64℃、63℃、62℃、61℃、60℃、59℃、ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖3為本發(fā)明RT-LAMP反應(yīng)時間優(yōu)化結(jié)果圖，其中：

泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～7分別為10min、20min、30min、40min、50min、60min、ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖4為本發(fā)明RT-LAMP反應(yīng)體系中硫酸鎂濃度優(yōu)化結(jié)果圖，其中：

泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～8分別為0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖5為本發(fā)明RT-LAMP反應(yīng)體系中甜菜堿濃度優(yōu)化結(jié)果圖，其中：

泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～5分別為0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖6為本發(fā)明RT-LAMP反應(yīng)體系中dNTPs濃度優(yōu)化結(jié)果圖，其中：

泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～7分別為0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖7為本發(fā)明RT-LAMP反應(yīng)體系中AMV酶濃度優(yōu)化結(jié)果圖，其中：

泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～7分別為0.06U/μL、0.08U/μL、0.1U/μL、0.12U/μL、0.14U/μL、0.16U/μL、ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖8為本發(fā)明RT-LAMP反應(yīng)體系中Bst聚合酶濃度優(yōu)化結(jié)果圖，其中：

泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～7分別為0.08U/μL、0.16U/μL、0.24U/μL、0.32U/μL、0.4U/μL、0.48U/μL、ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖9為本發(fā)明RT-LAMP反應(yīng)體系中緩沖液的體積濃度優(yōu)化結(jié)果圖，其中：

泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～7分別為0％、4％、8％、10％、12％、16％、ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖10為本發(fā)明RT-LAMP反應(yīng)體系中內(nèi)引物與外引物比例優(yōu)化結(jié)果圖，其中：泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～7分別為內(nèi)引物0.4μmol/L、外引物0.2μmol/L；內(nèi)引物0.8μmol/L、外引物0.2μmol/L；內(nèi)引物1.2μmol/L、外引物0.2μmol/L；內(nèi)引物1.6μmol/L、外引物0.2μmol/L；內(nèi)引物2.0μmol/L、外引物0.2μmol/L；內(nèi)引物2.4μmol/L、外引物0.2μmol/L；ddH2O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖11為本發(fā)明RT-LAMP反應(yīng)體系中環(huán)引物與外引物比例優(yōu)化結(jié)果圖，其中：泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～8分別為環(huán)引物0μmol/L、外引物0.2μmol/L；環(huán)引物0.2μmol/L、外引物0.2μmol/L；環(huán)引物0.4μmol/L、外引物0.2μmol/L；環(huán)引物0.6μmol/L、外引物0.2μmol/L；環(huán)引物0.8μmol/L、外引物0.2μmol/L；環(huán)引物1.0μmol/L、外引物0.2μmol/L；環(huán)引物1.2μmol/L、外引物0.2μmol/L；ddH2O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖12A為本發(fā)明中抽提的RNA敏感性檢測結(jié)果圖，其中：

泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～8中RNA含量為2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg、2fg、ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖12B為本發(fā)明中陽性質(zhì)粒敏感性檢測結(jié)果圖，其中：

泳道M為2000bp DNA Marker、泳道1～8中陽性質(zhì)粒含量為2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg、2fg、ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

圖12C為本發(fā)明中核酸試紙條敏感性檢測結(jié)果圖，其中：

試劑盒1～8中陽性質(zhì)粒含量為2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg、2fg、ddH₂O陰性得到的反應(yīng)產(chǎn)物。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

在以下實施例中，引物組由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成；新型鴨呼腸孤病毒QY株(DRV-QY)、番鴨呼腸孤毒株(MDRV)、禽呼腸孤毒株(ARV)和鴨瘟疫苗(DPV)、鴨肝炎疫苗(DHAV)、鴨新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(H9+H5)疫苗、禽流感(H7)疫苗、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)等病毒株均由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室保存和提供；Bst DNA大片段聚合酶、10×thermopol Buffer(Bst DNA大片段聚合酶試劑盒中自帶的緩沖液)、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、硫酸鎂均購自NEB公司，甜菜堿(Betaine)購自Sigma公司，Trizol Reagent試劑盒、RRI、Random Primer、Ex-Taq DNA聚合酶、瓊脂糖購自Takara公司，異戊醇、無水乙醇等為國產(chǎn)分析純試劑，一次性密閉核酸檢測裝置購自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司。

實施例1：引物設(shè)計

根據(jù)RT-LAMP反應(yīng)引物設(shè)計原則，以新型鴨呼腸孤病毒QY株sigmaB基因序列為設(shè)計模板(全長1104bp)，應(yīng)用LAMP在線引物設(shè)計軟件Primer Explorer4設(shè)計出若干套引物，利用Larsergene7.0PrimerSelect和Oligo7.0對引物進(jìn)行篩選，并利用Primer-BLAST檢索所設(shè)計引物的特異性，最后篩選出一套較佳引物和一套備選引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，且在引物合成過程中，對其采用生物素和熒光素進(jìn)行標(biāo)記，便于后續(xù)采用新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP核酸試紙對結(jié)果進(jìn)行檢測。經(jīng)過預(yù)設(shè)實驗從上述合成的兩套引物中，篩選驗證出一套最佳的引物，得到的最佳引物如下：

表1新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP核酸試紙條方法引物

新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP核酸試紙條方法引物在基因中的位置如下：

注：加雙下劃線的四個“CCGG”堿基為HpaⅡ酶的酶切位點，F(xiàn)IP由F1c(F1的互補序列)和F2序列組成，BIP由B1c和B2(B2c的互補序列)序列組成。

實施例2：病毒株抽提

(1)將250μL新型鴨呼腸孤病毒QY株的液體樣品加入1.5ml的Ep管中，再加入750μL用冰塊預(yù)冷的Trizol Reagent試劑，經(jīng)過劇烈震蕩(50下)混合后室溫靜置5min；

(2)加入200μL氯仿，顛倒Ep管兩次進(jìn)行混合，并再次劇烈震蕩(15下)混合，使液體充分混勻呈乳白狀(無分相現(xiàn)象)后室溫靜置5min；

(3)4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，將上層水相(500μL)轉(zhuǎn)移至一個新的1.5ml Ep管中，并加入等體積的異丙醇，混勻后置于4℃冰箱15min；

(4)4℃條件下，按上述12000r/min離心15min后，小心并盡可能地去除全部上清夜；

(5)用1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀和管壁后室溫靜置5min，在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min；

(6)小心棄去Ep管中液體，將RNA沉淀進(jìn)行干燥(不能完全干燥)處理后，加入15μL RNase-Free Water將RNA溶解，做好標(biāo)記并于-20℃保存。

實施例3：陽性質(zhì)粒的構(gòu)建

1、病毒RNA反轉(zhuǎn)錄

按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H^-)的使用說明書進(jìn)行。步驟如下：

(1)在以下組分配制RT反應(yīng)液：

(2)將以上各組分混勻后，置于PCR中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，程序為：30℃，10min，然后42℃作用1h，70℃保溫15min。反應(yīng)產(chǎn)物于－20℃保存或立即進(jìn)行PCR擴增。

2、PCR擴增

參照寶生物工程有限公司Ex Taq聚合酶的使用說明書進(jìn)行。根據(jù)袁遠(yuǎn)華等(2013)建立起的反應(yīng)PCR引物：

S3-F:GCTTTTTGAGTCCTCAGCGTG；

S3-R：GATGAATAGGCGAGTCCCGC。

反應(yīng)體系：Primix Ex TaqTM酶12.5μL，濃度為10μmol/L的上游引物(即所述外引物S3-F)、下游引物(即所述外引物S3-R)各1μL，CDNA模板2μL，加三蒸滅菌水至總體積為25μL。各組分混勻瞬時離心后，在溫度梯度PCR儀上執(zhí)行以下程序：94℃4min；94℃30s，55℃45s，72℃60s；進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

3、瓊脂糖凝膠電泳

PCR結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，同時以DL2000Marker作為參照，配制的瓊脂糖凝膠的濃度為1.0％，以Gold view為核酸染色劑，1xTAE作為電泳緩沖液，電泳儀設(shè)置為100V電壓，電泳25min，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照并保存。

4、PCR產(chǎn)物的純化

根據(jù)Takara公司凝膠DNA回收試劑盒的使用說明書，純化并回收目的片段，步驟如下：

(1)在紫外燈下將含有DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，轉(zhuǎn)移到一個自備的1.5mL離心管中；

(2)稱量切下的凝膠重量，加入3倍體積的BufferG(每1mg凝膠換算為1uL凝膠體積)；

(3)將裝有凝膠的離心管50℃水浴直至凝膠完全溶解(大約5-10min)；

(4)加入1倍凝膠體積的異丙醇，混合均勻；

(5)將溶膠液轉(zhuǎn)移到核酸純化柱中(核酸純化柱置于2mL離心管中)，12000×g離心30s；

(6)棄2ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2mL離心管中，加入500μL Buffer G,蓋上管蓋，12000×g離心30s；

(7)棄2mL離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2mL離心管中，加入700μL Buffer WG,蓋上管蓋，12000×g離心30s。重復(fù)步驟7)一次；

(8)棄2mL離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2mL離心管中，14000×g離心1min；

(9)棄2ml離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5mL離心管(試劑盒提供)中，在純化柱的膜中央加入25～30μL Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置1min，12000×g離心30s洗脫DNA；

(10)棄純化柱，洗脫的DNA可立即用于各種分子生物學(xué)實驗；或者將DNA儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

5、連接反應(yīng)

使用Takara公司PMD18-T載體連接試劑盒,反應(yīng)體系總體積為5ul如下：PCR純化產(chǎn)物2.25μL，2×Ligase Buffer(Ligation Solution I)2.5μL，pMD18-T Vector 0.25μL。在冰盒上操作，將以上各種反應(yīng)試劑加入一個滅菌的PCR管中，加完混勻后，16℃作用5～6h。若暫不做轉(zhuǎn)化，可將連接產(chǎn)物保存于-20℃約一個月。

6、感受態(tài)細(xì)胞的制備

將實驗室保存的DH5a菌株在LB平板上劃線,并倒置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；從生長有大腸桿菌DH5α的平板上挑取一個單菌落，接種于2mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，作為一級培養(yǎng)。

將一級培養(yǎng)物按1:50比例無菌轉(zhuǎn)接到5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)約2h～3h，進(jìn)行二級培養(yǎng)，使細(xì)菌的OD₆₀₀達(dá)到0.5左右。

將培養(yǎng)好的菌液冰浴30min后分裝到無菌的1.5mL離心管中，4℃4000r/min離心10min，棄上清。

加入1mL冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂重懸沉淀，繼續(xù)冰浴15min～30min，4℃4000r/min離心10min，棄上清。

沉淀中加入200μl用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂輕輕重懸。懸浮的感受態(tài)細(xì)胞可直接用于轉(zhuǎn)化，若要保存，則需加入無菌甘油至終濃度為15％，分裝100μL/管，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

7、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

取制備的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入連接產(chǎn)物5μL，輕輕混勻，冰浴30min。且同時設(shè)置陽性對照組(pMD18-T自環(huán)質(zhì)粒)及陰性對照組(不加入任何質(zhì)粒DNA的感受態(tài)細(xì)胞)。

42℃水浴熱激90s，再迅速放回冰上10min。

加入400μL新鮮LB液體培養(yǎng)基，37℃200r/min-220r/min振蕩培養(yǎng)45min后，以恢復(fù)質(zhì)粒的抗性。

4℃4000r/min離心5min，棄去上清400μL，將剩余的100μL菌液混勻后涂氨芐LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)30min(平皿正放)，待菌液吸收完全，再將平皿倒置培養(yǎng)約12h-16h，至單菌落出現(xiàn)。

8、轉(zhuǎn)化菌的篩選和鑒定

用滅菌接種環(huán)挑取白色疑似轉(zhuǎn)化子單菌落接種于含AMP(100ug/mL)的LB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)4-6h，進(jìn)行菌落PCR鑒定。其中，PCR反應(yīng)體系為Primix Ex Taq^TM12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，菌液2μL，滅菌雙蒸水8.5μL，溶液混勻后，進(jìn)行PCR。

9、序列測定分析

經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌液，送往上海生物工程有限公司測序。用測序得到的序列和DRV-QY株的對應(yīng)序列進(jìn)行比對分析，如果結(jié)果吻合，則抽提陽性菌質(zhì)粒，用分光光度計測定其OD值，按公式計算質(zhì)粒濃度C＝50×A×n(50：在260nm下1個OD260值表示50ug/ml的雙鏈DNA；A：吸光度值OD260值；n：稀釋倍數(shù))。

實施例4：酶切鑒定引物特異性

本發(fā)明篩選出的引物中存在“CCGG”的堿基為HpaⅡ酶的酶切位點，可以對RT-LAMP反應(yīng)擴增得到的產(chǎn)物的特異性進(jìn)行鑒定。用HpaⅡ酶對RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，對產(chǎn)物進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，可以看出，僅在100bp～250bp范圍靠近100bp(127bp和114bp)處有酶切條帶，這與預(yù)算的兩個條帶大小相符，表明本發(fā)明篩選出的引物特異性較好。

表2新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP核酸試紙條檢測方法初始反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

注：1、本發(fā)明中使用的緩沖液為10×thermopol buffer，即10倍濃度緩沖液。

2、本發(fā)明對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化過程中，最優(yōu)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的確定方法為：對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶越亮，則表明產(chǎn)物中新型鴨呼腸孤病毒含量越高。

實施例6：反應(yīng)條件的優(yōu)化

1、反應(yīng)溫度的優(yōu)化

在上述表2的初始反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，設(shè)計59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，8個溫度梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。每個反應(yīng)重復(fù)3次以上，反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示，可以看出，65℃下進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度最大，則表明65℃為RT-LAMP反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度。

2、反應(yīng)時間的優(yōu)化

在上述表2的初始反應(yīng)條件和反應(yīng)體系及優(yōu)化的反應(yīng)溫度的基礎(chǔ)上，設(shè)計10min、20min、30min、40min、50min、60min，6個時間梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。每個反應(yīng)至少重復(fù)3次，反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示，可以看出，進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)50min后，產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度最大，則表明最佳反應(yīng)時間為50min。

實施例7：反應(yīng)體系的優(yōu)化

1、硫酸鎂濃度優(yōu)化

在上述表2的初始反應(yīng)體系及優(yōu)化后的反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，設(shè)計0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L，7個硫酸鎂濃度梯度進(jìn)行反應(yīng)。每個反應(yīng)至少重復(fù)3次，反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，當(dāng)硫酸鎂終濃度不大于3.0mmol/L時(即，泳道1～3)，隨著硫酸鎂濃度的增加，電泳條帶亮度呈現(xiàn)上升趨勢；當(dāng)濃度大于3.0mM時(即，泳道4～7)，電泳條帶亮度下降但又趨于平穩(wěn)，故最佳反應(yīng)硫酸鎂濃度為3.0mmol/L。

2、甜菜堿濃度優(yōu)化

在上述表2的初始反應(yīng)體系及優(yōu)化后的反應(yīng)條件、優(yōu)化的反應(yīng)物的基礎(chǔ)上，計0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L，4個甜菜堿終濃度梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。每個反應(yīng)至少重復(fù)3次，反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出，無甜菜堿時，該反應(yīng)仍然可以順利擴增，但甜菜堿濃度為0.5mmol/L時，電泳條帶最亮，甜菜堿濃度大于0.5mmol/L時反而會使電泳條帶的亮度下降，因此，最佳的甜菜堿濃度為0.5mmol/L。

3、dNTPs濃度的優(yōu)化

在上述表2的初始反應(yīng)體系及優(yōu)化后的反應(yīng)條件、優(yōu)化的反應(yīng)物的基礎(chǔ)上，設(shè)計0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L，6個dNTPs濃度梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。每個反應(yīng)至少重復(fù)3次，反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6所示，從圖中可以看出，dNTPs終濃度為0.3mol/L時，電泳條帶亮度最大，即終濃度為0.3mmol/L的dNTPs能夠使反應(yīng)順利進(jìn)行，故最佳dNTPs濃度為0.3mmol/L。

4、AMV酶濃度優(yōu)化

在上述表2的初始反應(yīng)體系及優(yōu)化后的反應(yīng)條件、優(yōu)化的反應(yīng)物的基礎(chǔ)上，設(shè)計0.06U/μL、0.08U/μL、0.1U/μL、0.12U/μL、0.14U/μL、0.16U/μL6個AMV酶濃度梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。每個反應(yīng)至少重復(fù)3次，反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖7所示，可以看出，當(dāng)AMV酶終濃度為0.14U/μL時，RT-LAMP反應(yīng)擴增效率最高，即電泳條帶亮度越大。故選擇0.14U/μL為該RT-LAMP反應(yīng)的最佳AMV反轉(zhuǎn)錄酶終濃度。

5、Bst聚合酶濃度優(yōu)化

在上述表2的初始反應(yīng)體系及優(yōu)化后的反應(yīng)條件、優(yōu)化的反應(yīng)物的基礎(chǔ)上，設(shè)計0.08U/μL、0.16U/μL、0.24U/μL、0.32U/μL、0.4U/μL、0.48U/μL，6個Bst聚合酶濃度梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。每個反應(yīng)至少重復(fù)3次，反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖8所示，從圖中可以看出，隨著Bst聚合酶的濃度增加，RT-LAMP反應(yīng)擴增效率是上升的，即電泳條帶亮度增加，但是只有在濃度為0.32U/μL(泳道4)時，電泳條帶亮度最大，隨著Bst聚合酶濃度的繼續(xù)增加，RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物電泳條帶的亮度降低，故RT-LAMP反應(yīng)的最佳Bst聚合酶濃度為0.32U/μL。

6、10×thermopol Buffer優(yōu)化

在上述表2的初始反應(yīng)體系及優(yōu)化后的反應(yīng)條件、優(yōu)化的反應(yīng)物的基礎(chǔ)上，設(shè)計0、4％、8％、10％、12％、16％，6個10×thermopol Buffer的體積濃度(10×thermopol Buffer的加入體積與反應(yīng)體系總體積的比值)梯度進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。每個反應(yīng)至少重復(fù)3次，反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖9所示，從圖中可以看出，在第4泳道中，即10×thermopol Buffer的體積濃度為10％時，電泳條帶亮度最大，表面最終擴增效率最佳，能使反應(yīng)順利進(jìn)行，故RT-LAMP反應(yīng)的10×thermopol Buffer最佳體積濃度為10％(即向25μL反應(yīng)體系的加入量為2.5μL)。

7、內(nèi)引物與外引物比例優(yōu)化

在上述表2的初始反應(yīng)體系及優(yōu)化后的反應(yīng)條件、優(yōu)化的反應(yīng)物的基礎(chǔ)上，按照表3設(shè)計6組不同內(nèi)引物和外引物濃度比例的核酸試紙條，檢測RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。每個反應(yīng)至少重復(fù)3次，反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)構(gòu)如圖10所示從圖中可以看出，泳道5最終擴增效率最高，電泳條帶亮度最大，故RT-LAMP反應(yīng)最佳的內(nèi)引物與外引物比例為10:1，(終濃度為，內(nèi)引物(FIP+BIP)2.0μmol/L，外引物(F3+B3)0.2μmol/L)。。

表3新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP反應(yīng)內(nèi)引物與外引物濃度比例的優(yōu)化

8、環(huán)引物與外引物比例優(yōu)化

在上述表2的初始反應(yīng)體系及優(yōu)化后的反應(yīng)條件、優(yōu)化的反應(yīng)物的基礎(chǔ)上，按照表4設(shè)計7組不同內(nèi)引物和外引物濃度比例的核酸試紙條，檢測RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。每個反應(yīng)至少重復(fù)3次，產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖11所示，從圖中可以看出，當(dāng)不加入環(huán)引物(泳道1)時，并無擴增條帶產(chǎn)生，當(dāng)環(huán)引物與內(nèi)引物比例在4:1(泳道5)時，電泳條帶亮度最大，即最終擴增效率最佳，可使反應(yīng)有效進(jìn)行，故RT-LAMP反應(yīng)最佳的環(huán)引物與外引物比例為4:1(終濃度為，環(huán)引物(LoopF+LoopB)0.8μmol/L，外引物(F3+B3)0.2μmol/L)。

表4新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP反應(yīng)內(nèi)引物與外引物濃度比例的優(yōu)化

綜合上述實驗條件，得到新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP核酸試紙條方法優(yōu)化后反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下表5所示：

表5新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP核酸試紙條方法優(yōu)化后反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

新型鴨呼腸孤病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，包含以下步驟：

(1)配置RT-LAMP反應(yīng)體系：按終濃度計算，濃度為0～6mmol/L的硫酸鎂、濃度為0～1.5mmol/L的甜菜堿、濃度為0.2～0.7mmol/L的dNTPs、濃度為0.06～0.16U/μL的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、濃度為0.08～0.48U/μL的Bst聚合酶、RNase-free water將反應(yīng)體系的總體積補足至25μL、緩沖液的加入量為反應(yīng)體系總體積的0～16％、內(nèi)引物與外引物的終濃度比為2:1～12:1、環(huán)引物與外引物的終濃度比為0～6:1、待測樣品RNA的加入量為2μL；

(2)反應(yīng)：將步驟(1)中的反應(yīng)體系恒溫反應(yīng)，然后將反應(yīng)后的產(chǎn)物用核酸檢測試紙條檢測，10～30min后讀取檢測結(jié)果；

(3)檢測結(jié)果判讀：

陰性：當(dāng)核酸檢測試紙條位于質(zhì)控區(qū)的條帶呈紅色，檢測區(qū)無條帶時，則表明待測目標(biāo)未被新型鴨呼腸孤病毒感染；

陽性：當(dāng)核酸檢測試紙條出現(xiàn)分別位于質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)的兩條紅色條帶時，則表明待測目標(biāo)已被新型鴨呼腸孤病毒感染；

無效：當(dāng)核酸檢測試紙條質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)均未出現(xiàn)條帶時，則表明檢測過程無效。

進(jìn)行結(jié)果檢測時，試紙條位于全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置中。將上述RT-LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物，與展開液混合后點在試紙條的加樣孔處，混合液通過毛細(xì)作用向前流動。由于擴增過程的引物被生物素標(biāo)記，當(dāng)有擴增產(chǎn)物存在時，產(chǎn)物首先與金標(biāo)墊上有鏈霉親和素(SA)的膠體金(Au)結(jié)合，隨著液相繼續(xù)流動達(dá)到檢測線，固定在檢測線上的抗異硫氰酸熒光素抗體(Anti-F)將被熒光素(所述熒光素標(biāo)記在引物上)的擴增產(chǎn)物捕獲，這樣就使與擴增產(chǎn)物結(jié)合的膠體金都停留在檢測線處，產(chǎn)生紅色的條帶。相反，沒有與擴增產(chǎn)物結(jié)合的膠體金將繼續(xù)層析，最終被質(zhì)控線上的用BSA包被的生物素(Biotin，B)捕獲，使質(zhì)控線同樣顯色。所以擴增產(chǎn)物不存在時，膠體金顆粒無法停留在檢測線處，而被質(zhì)控線上的生物素捕獲，所以質(zhì)控線的顯色情況可以用來對試劑條進(jìn)行質(zhì)控。

實施例8、新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP核酸試紙條快速檢測方法的敏感性分析

對上述的新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP方法進(jìn)行敏感性分析，對抽提的RNA和陽性質(zhì)粒經(jīng)過分光光度計測定含量后，分別稀釋成1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg，7個敏感梯度的RNA溶液和陽性質(zhì)粒溶液進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖12A～C，從圖中可以看出，該方法對DRV-QY株基因組RNA和陽性質(zhì)粒的最低檢測量為100fg×2＝200fg(泳道5)，用新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP核酸試紙條進(jìn)行敏感性試驗，結(jié)果一致。而現(xiàn)有的RT-PCR進(jìn)行同樣的敏感性試驗時，結(jié)果最低檢測量為20pg(泳道3)。由以上結(jié)果可知，該研究建立的NDRV RT-LAMP核酸試紙條檢測方法的敏感性為常規(guī)RT-PCR方法的100倍。

綜上所述，本發(fā)明公開了一種RT-LAMP核酸試紙條檢測方法及應(yīng)用，本發(fā)明采用RT-LAMP技術(shù)與核酸試紙條檢測技術(shù)相結(jié)合的方法，能夠利用簡單的實驗儀器、快速高效的對新型鴨呼腸孤病毒進(jìn)行檢測，決了RT-LAMP產(chǎn)物檢測中的假陽性問題，不僅方便快捷，且敏感性比常規(guī)RT-PCR高約100倍，有利于核酸試紙條方法的推廣應(yīng)用。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

SEQ ID NO 1：

CGTGGATGGTCAAAGTCGT

SEQ ID NO 2：

ACCTACACTCCAGGAAGGAC

SEQ ID NO 3：

TAGTTCTGGCATGGCCTCGC-CTTTACATGTGCTGCAGGGA

SEQ ID NO 4：

TGTTCGGACGTTCTCTTCCGGA-TTTAATGGCGCGGACGAC

SEQ ID NO 5：

AGCCTAGATTCGCACTCCG

SEQ ID NO 6：

CGAGGAGACTACCCACGTT

SEQ ID NO 7：

CGTGTATGGTCAAAGTCGTGCTTTACATGTGCTGCAGGGATGGAGCCCGCGGAGTGCGAATCTAGGCTGCGAGGCCATGCCAGAACTATGTTCGGACGTTCTCTTCCGGATATCTGTGACTTCGAGGAGACTACCCACGTTGGCCAGTCGTCCGCGCCATTAAAGAAGGCCACGAAATTGTCCTTCCTGGAGTGTAGGT