本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體而言本發(fā)明涉及評估腫瘤異質(zhì)性的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：腫瘤是一種由基因改變引起的疾病。腫瘤往往涉及到多種遺傳學變異類型，包括單核苷酸變異(SingleNucleotideVariations，SNV)、短的插入缺失(smallinsertionsanddeletions，indel)、拷貝數(shù)變異(CopyNumberVariations，CNV)、結(jié)構(gòu)變異(StructureVariations，SV)等。從腫瘤細胞形成第一個變異開始，便開始了變異積累的過程。隨著時間推進和腫瘤的演化，先發(fā)生的有害變異為后發(fā)生的變異營造有利的維持條件，使腫瘤細胞不斷獲得或者增強諸如抑制凋亡、無限復制、免疫逃逸等方面的能力，因此腫瘤細胞的變異累積的速度比正常細胞快得多。最終形成的腫瘤其實是具有不同遺傳學特性的細胞群體的混合：有些細胞僅攜帶早期變異，有些則還同時攜帶后期變異；在這些腫瘤細胞中，變異所涉及的細胞比例也隨著其發(fā)生時間由早至晚而由大變??；在一個細胞同時發(fā)生的變異在腫瘤進化過程中共存亡，涉及的細胞比例相同。腫瘤中的變異的細胞比例分布的復雜性能夠反映腫瘤異質(zhì)性，后者是腫瘤復雜程度的最直接和最重要的體現(xiàn)，其與腫瘤患者預后和生存時間息息相關(guān)。目前評估腫瘤異質(zhì)性多采用同一腫瘤患者的多位點采樣和高通量測序的方法，即通過對患者的組織多個位置或多個病灶進行病理取樣后，通過高通量測序的方法分析每個取樣部位的變異，并對共有變異及變異所對應的細胞比例進行描述和分級統(tǒng)計。該方法有如下缺點：(1)多位點的臨床取樣存在偏倚性，只能代表所取部位的分子變異特征，不能代表整體腫瘤的復雜度；(2)具有一定的臨床風險；(3)部分類型的轉(zhuǎn)移灶難以獲取，如胸腹膜轉(zhuǎn)移病灶；(4)不準確性，通過共有變異進行的異質(zhì)性分析方法，將共有變異辨識為同一層級，并未對共有變異進行具體劃分，從而導致部分分析結(jié)果不準確(Gerlinger,M.etal.Intratumorheterogeneityandbranchedevolutionrevealedbymultiregionsequencing.TheNewEnglandjournalofmedicine366,883-892,doi:10.1056/NEJMoa1113205(2012)；Hao,J.J.etal.Spatialintratumoralheterogeneityandtemporalclonalevolutioninesophagealsquamouscellcarcinoma.Naturegenetics,doi:10.1038/ng.3683(2016))。此外，也有方法只通過單點采樣的拷貝數(shù)變異結(jié)果對腫瘤異質(zhì)性進行評估(Oesper,L.,Satas,G.&Raphael,B.J.Quantifyingtumorheterogeneityinwhole-genomeandwhole-exomesequencingdata.Bioinformatics30,3532-3540,doi:10.1093/bioinformatics/btu651(2014))，該方法除了存在取樣偏倚性的缺點外，還存在人群覆蓋度低的缺點，即只能覆蓋部分存在大量拷貝數(shù)變異的癌腫或人群。因此，本領(lǐng)域中需要更準確評估腫瘤的異質(zhì)性的分析方法，以有效地輔助腫瘤預后和治療方案制定。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了更準確評估腫瘤的異質(zhì)性，本發(fā)明提出了一種分子克隆(MolecularClone，mClone)分析方法，該方法基于高通量測序在循環(huán)腫瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)中的多種類型變異檢測結(jié)果，將所有變異劃分為不同的分子克隆，利用分子克隆層級評估腫瘤的異質(zhì)性。本發(fā)明的方法實現(xiàn)以ctDNA高通量變異檢測為基礎(chǔ)的腫瘤異質(zhì)性評估，以有效輔助腫瘤預后和治療方案制定。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種評估腫瘤異質(zhì)性的方法，所述方法包括：1)對患者的游離DNA(cell-freeDNA，cfDNA)進行測序(優(yōu)選高通量測序)，獲得測序信息；2)利用所述測序信息確定ctDNA變異，根據(jù)所述測序信息和所述確定的ctDNA變異，計算變異等位頻率，確定變異所在區(qū)域的實際總拷貝數(shù)，計算ctDNA占cfDNA的比例；3)根據(jù)所述步驟2)中確定的比例以及ctDNA變異的測序信息和拷貝數(shù)信息對所述ctDNA變異進行聚類，聚類得到的每一個簇確定為一個分子克隆，得到聚類的克隆層級；4)根據(jù)所述患者的克隆層級對其腫瘤異質(zhì)性進行評估，所述患者的克隆層級越多，其腫瘤異質(zhì)性越高。在第二方面，本發(fā)明提供了一種比較不同患者腫瘤異質(zhì)性的方法，所述方法包括：利用本發(fā)明第一方面的方法的步驟1)-3)對所述每個患者計算分子克隆層級，對于不同患者，克隆層級越多，其腫瘤異質(zhì)性越高。在本發(fā)明第一或第二方面的一個實施方案中，步驟2)包括：2.1)利用所述測序信息獲得變異V(所述變異V選自SNV、indel和SV)(Vi,i＝1,…,n)的參考等位測序深度(Ri)、變異等位測序深度(Mi)，并計算變異等位頻率(VariantAlleleFraction，VAFi)，其中，參考等位測序深度(Ri)是測序結(jié)果中在相應位點未發(fā)生該變異的正常序列的條數(shù)；變異等位測序深度(Mi)是測序結(jié)果中在相應位點發(fā)生該變異的變異序列的條數(shù)；2.2)利用變異Vi所在區(qū)域的CNV(CNVi,i＝1,…,n)，計算變異Vi所在區(qū)域的參考拷貝數(shù)(rCNi)和實際總拷貝數(shù)(CNi)，如果在步驟1)中使用精確的CNV檢測方法(如使用SNP芯片檢測)，對于不在男性性染色體上的變異，會得到兩條染色體上的等位特異的拷貝數(shù)變異(CNVi,major，CNVi,minor，CNVi,major≥CNVi,minor)信息，從而獲取實際的等位特異的拷貝數(shù)(CNi,major，CNi,minor)，2.3)ctDNA比例評估：以最大的變異等位頻率來評估cfDNA中ctDNA所占比例(CTF)，CTF＝max(VAFi),i＝1,…,n(公式5)在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟3)中，通過預測的變異細胞比例，對變異進行聚類，例如采用PyClone(v0.13，當前最新版本，如非特別注明，以下均指該版本)軟件。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟3)中，變異V(SNV/indel/SV)的參考和變異等位深度數(shù)據(jù)(Ri，Mi)：用于與CTF和CNV一塊評估變異腫瘤細胞比例。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟3)中，采用PyClone軟件對每個所述變異所在細胞群占所有腫瘤細胞的比例進行預測，軟件參數(shù)可以設(shè)定如下：總體腫瘤細胞比例(CTF)＝變異等位基因頻率的最高值；迭代次數(shù)＝20000；其他參數(shù)為默認。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟3)中，使用PyClone對檢出的n個變異V(SNV/indel/SV)進行聚類，除以下幾個參數(shù)外，均采用默認參數(shù)：(a)--tumour_contentsCTF；(b)--num_iters20000；(c)--priortotal_copy_number，當采用等位特異的CNV數(shù)據(jù)作為輸入時，該參數(shù)設(shè)置為parental_copy_number；(d)--densitypyclone_beta_binomial，當步驟1)采用的是測序深度較低的全基因組測序技術(shù)時，該參數(shù)設(shè)置為pyclone_binomial；(e)--in_filespatient.tsv，patient.tsv文件是以制表符為分割符的文件；除標題行外，每行包含一個變異V(SNV/indel/SV)的信息；內(nèi)含六列，依次為：mutation_id、ref_counts、var_counts、normal_cn、minor_cn和major_cn。在第三方面，本發(fā)明提供了一種評估腫瘤異質(zhì)性的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：1)用于測序(優(yōu)選高通量測序)患者的cfDNA的模塊；2)用于執(zhí)行如下步驟的模塊：a)接收來自模塊1)的測序信息；b)通過與正?；蛐蛄械男蛄行畔⒈容^，獲得cfDNA中的ctDNA變異；c)根據(jù)所述測序信息和所述ctDNA變異，計算變異等位頻率，確定變異所在區(qū)域的實際總拷貝數(shù)或?qū)嶋H的等位特異的拷貝數(shù)，計算ctDNA占cfDNA的比例；d)根據(jù)所述步驟c)中確定的比例以及ctDNA變異的測序信息和拷貝數(shù)信息對所述ctDNA變異進行聚類，確定分子克隆，并計算分子克隆層級；3)結(jié)果輸出模塊：根據(jù)所述患者的分子克隆層級輸出腫瘤異質(zhì)性的結(jié)果，所述患者的克隆層級越多，其腫瘤異質(zhì)性越高。在第四方面，本發(fā)明提供了一種比較不同患者腫瘤異質(zhì)性的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：1)用于測序(優(yōu)選高通量測序)患者的cfDNA的模塊；2)用于執(zhí)行如下步驟的模塊：a)接收來自模塊1)的測序信息；b)通過與正?；蛐蛄械男蛄行畔⒈容^，獲得cfDNA中的ctDNA變異；c)根據(jù)所述測序信息和所述變異結(jié)果，計算變異等位頻率，確定變異所在區(qū)域的實際總拷貝數(shù)或?qū)嶋H的等位特異的拷貝數(shù)，計算ctDNA占cfDNA的比例；d)根據(jù)所述步驟c)中確定的比例以及ctDNA變異的測序信息和拷貝數(shù)信息對所述ctDNA變異進行聚類，確定分子克隆，并計算分子克隆層級；3)結(jié)果輸出模塊：對不同患者的分子克隆層級進行比較，輸出不同患者的腫瘤異質(zhì)性比較的結(jié)果，患者的克隆層級越多，其腫瘤異質(zhì)性越高。在本發(fā)明第三或第四方面的一個實施方案中，模塊2)的步驟c)包括步驟：c.1)利用所述測序信息獲得變異V(所述變異V選自SNV、indel和SV)(Vi,i＝1,…,n)的參考等位測序深度(Ri)、變異等位測序深度(Mi)，并計算變異等位頻率(VariantAlleleFraction，VAFi)，其中，參考等位測序深度(Ri)是測序結(jié)果中在相應位點未發(fā)生該變異的正常序列的條數(shù)；變異等位測序深度(Mi)是測序結(jié)果中在相應位點發(fā)生該變異的變異序列的條數(shù)；c.2)利用變異Vi所在區(qū)域的CNV(CNVi,i＝1,…,n)，計算變異Vi所在區(qū)域的參考拷貝數(shù)(rCNi)和實際總拷貝數(shù)(CNi)，如果在步驟1)中使用精確的CNV檢測方法(如使用SNP芯片檢測)，對于不在男性性染色體上的變異，會得到兩條染色體上的等位特異的拷貝數(shù)變異(CNVi,major，CNVi,minor，CNVi,major≥CNVi,minor)信息，從而獲取實際的等位特異的拷貝數(shù)(CNi,major，CNi,minor)，c.3)ctDNA比例評估：以最大的變異等位頻率來評估cfDNA中ctDNA所占比例(CTF)，CTF＝max(VAFi),i＝1,…,n(公式5)在本發(fā)明第三或第四方面的一個實施方案中，模塊2)為執(zhí)行所述步驟的多條指令的計算機可讀介質(zhì)。模塊3)為執(zhí)行所述步驟的指令的計算機可讀介質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟d)中，變異V(SNV/indel/SV)的參考和變異等位深度數(shù)據(jù)(Ri，Mi)：用于與CTF和CNV一塊評估變異腫瘤細胞比例。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟d)中，采用PyClone軟件對每個所述變異所在細胞群占所有腫瘤細胞的比例進行預測，軟件參數(shù)可以設(shè)定如下：總體腫瘤細胞比例(CTF)＝變異等位基因頻率的最高值；迭代次數(shù)＝20000；其他參數(shù)為默認。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟d)中，通過預測的變異細胞比例，對變異進行聚類，例如采用PyClone軟件。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟d)中，使用PyClone對檢出的n個變異V(SNV/indel/SV)進行聚類，除以下幾個參數(shù)外，均采用默認參數(shù)：(a)--tumour_contentsCTF；(b)--num_iters20000；(c)--priortotal_copy_number，當采用等位特異的CNV數(shù)據(jù)作為輸入時，該參數(shù)設(shè)置為parental_copy_number；(d)--densitypyclone_beta_binomial，當模塊1)中采用的是測序深度較低的全基因組測序技術(shù)時，該參數(shù)設(shè)置為pyclone_binomial；(e)--in_filespatient.tsv，patient.tsv文件是以制表符為分割符的文件；除標題行外，每行包含一個變異V(SNV/indel/SV)的信息；內(nèi)含六列，依次為：mutation_id、ref_counts、var_counts、normal_cn、minor_cn和major_cn。本發(fā)明基于腫瘤進化的理論和ctDNA的高通量變異檢測技術(shù)，從克隆層面分析腫瘤變異，提供了更符合腫瘤發(fā)生發(fā)展規(guī)律的異質(zhì)性評估方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，較高的腫瘤異質(zhì)性具有更高的腫瘤進展風險。相對于其他分析方法，本發(fā)明的優(yōu)勢如下：1)信息全面性：相對于單位點或多位點的組織取樣偏倚性，ctDNA能反應更全面的腫瘤分子特征；2)取樣便捷性：組織取樣通常來源于手術(shù)或穿刺，相比于組織取樣，尤其是多位點組織取樣，ctDNA的檢測僅需要無創(chuàng)采血，在臨床上更容易可行；3)高度準確性：充分利用變異信息，涵蓋SNV、indel和SV，保留變異的具體頻率而非利用檢出/未檢出的二元值，基于腫瘤進化理論，從克隆層面而非變異層面對異質(zhì)性進行評估。借助以上三點，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可以更準確和合理的評估腫瘤的異質(zhì)性。附圖說明通過以下附圖對本發(fā)明進行說明。圖1mClone分析流程圖，帶*標志的步驟為對每個患者分別進行。圖2生存分析，左邊曲線為高異質(zhì)性，右邊曲線為低異質(zhì)性。具體實施方式在本發(fā)明中，基因名稱均采用NCBI-Gene里的官方命名(OfficialSymbol)，采用本領(lǐng)域通用表示法表示基因突變和蛋白質(zhì)突變。例如，c.518T>C(p.V173A)表示錯義突變，表示編碼區(qū)第518位的T堿基改變?yōu)镃堿基，從而導致173位的氨基酸由組氨酸V突變?yōu)榫彼酇；c.2235_2249delGGAATTAAGAGAAGC(p.E746_A750del)表示小片段缺失，表示編碼區(qū)第2235位到2249位的堿基GGAATTAAGAGAAGC缺失，從而導致第746位到750位的5個氨基酸缺失；c.2663+1G>A表示剪切突變，表示編碼區(qū)第2663位所在外顯子3端緊連內(nèi)含子的第一個堿基由G改變?yōu)锳；c.7081C>T(p.Q2361*)表示無義突變，編碼區(qū)第7081位的C堿基改變?yōu)門堿基，從而導致第2361位的Q變?yōu)榻K止密碼子。在本發(fā)明中，數(shù)學符號ceil是指向上取整。在本發(fā)明中，cfDNA還可以是血液(血漿)、唾液、胸腹腔積液、尿液、糞便等樣本DNA。在本發(fā)明中，所述腫瘤選自但不限于：肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、宮頸癌、食管癌和肝癌。在一個具體的實施方案中，所述腫瘤是肺癌，所述變異是表1中列出的變異。本發(fā)明的方法流程圖如圖1所示，對每位受試患者，在利用高通量測序?qū)tDNA變異進行檢測后，根據(jù)ctDNA變異的測序結(jié)果，評估ctDNA占cfDNA的比例；上述比例和檢出的變異一起，作為輸入，對變異進行聚類，聚類得到的每一個簇確定為一個分子克隆，然后計算克隆層級，最后根據(jù)所有患者的克隆層級對每位患者的腫瘤異質(zhì)性進行評估。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于肺癌而言，克隆層級大于3.5為異質(zhì)性高的患者，克隆層級小于3.5為異質(zhì)性低的患者。以下為本發(fā)明的方法的主要技術(shù)流程與原理介紹：1.高通量測序檢測ctDNA變異首先，對選定數(shù)個同癌種患者作為受試對象，對每個患者進行變異檢測和參數(shù)計算：1)通過全基因組、全外顯子組或探針捕獲測序等高通量測序技術(shù)及相應的信息學分析方法，對受試者cfDNA進行測序，獲取ctDNA中包含的變異，包括SNV、indel、SV、CNV等；2)根據(jù)步驟1)中的測序結(jié)果，獲得變異V(變異V選自SNV、indel和SV)(Vi,i＝1,…,n)的參考等位測序深度(Ri)、變異等位測序深度(Mi)，并計算變異等位頻率(VariantAlleleFraction，VAFi)，其中，參考等位測序深度(Ri)是測序結(jié)果中在相應位點未發(fā)生該變異的正常序列的條數(shù)；變異等位測序深度(Mi)是測序結(jié)果中在相應位點發(fā)生該變異的變異序列的條數(shù)；3)利用變異Vi所在區(qū)域的CNV(CNVi,i＝1,…,n)，計算變異Vi所在區(qū)域的參考拷貝數(shù)(rCNi)和實際總拷貝數(shù)(CNi)，如果在1)中使用精確的CNV檢測方法(如使用SNP芯片檢測)，對于不在男性性染色體上的變異，會得到兩條染色體上的等位特異的拷貝數(shù)變異(CNVi,major，CNVi,minor，CNVi,major≥CNVi,minor)信息，從而獲取實際的等位特異的拷貝數(shù)(CNi,major，CNi,minor)，精確的CNV檢測是指獲得兩條染色體的等位特異的拷貝數(shù)變異，例如使用SNP芯片檢測。2.變異聚類及克隆層級計算然后，對每位患者，依據(jù)1中得到的參數(shù)，將檢測到的變異進行聚類分析和克隆層級計算：1)ctDNA比例評估：以最大的變異等位頻率來評估cfDNA中ctDNA所占比例(CTF)，CTF＝max(VAFi),i＝1,…,n(公式5)2)變異聚類：對于任一變異(SNV/indel/SV)而言，cfDNA的來源細胞被分為三類：正常細胞(N)、不攜帶該變異的腫瘤細胞(C0)、攜帶該變異的腫瘤細胞(C1)，攜帶該變異的腫瘤細胞(C1)占所有腫瘤細胞(C1+C0)的比例稱為變異腫瘤細胞比例，如果兩個或以上變異的變異腫瘤細胞比例相當，那么他們發(fā)生的時間近似，會被賦予相同的簇標簽，聚類成一簇，即一個分子克隆。因此，對變異聚類需要用到以下數(shù)據(jù)：a)變異V(SNV/indel/SV)的參考和變異等位深度數(shù)據(jù)(Ri，Mi)：用于與CTF和CNV一塊評估變異腫瘤細胞比例；b)步驟1.3)中的參考拷貝數(shù)(rCNi)和實際總拷貝數(shù)(CNi)或?qū)嶋H的等位特異的拷貝數(shù)(CNi,major，CNi,minor)：對于某一變異，該變異等位的拷貝數(shù)擴增或缺失會造成變異腫瘤細胞比例估計值的假性升高或假性降低，因此加入拷貝數(shù)變化數(shù)據(jù)會更準確的判斷C1細胞的基因型，校正變異頻率，正確評估變異腫瘤細胞比例；c)CTF：用以估計cfDNA來源細胞的構(gòu)成，即所有細胞(N+C0+C1)中腫瘤細胞(C0+C1)所占的比例，該參數(shù)的準確設(shè)置有助于正確計算來自正常細胞的參考等位和來自腫瘤細胞的參考等位的數(shù)量比例。例如，使用PyClonev0.13(當前最新版本)對檢出的n個變異V(SNV/indel/SV)進行聚類，除以下幾個參數(shù)外，均采用默認參數(shù)：(a)--tumour_contentsCTF；(b)--num_iters20000；(c)--priortotal_copy_number，當采用等位特異的CNV數(shù)據(jù)作為輸入時，該參數(shù)設(shè)置為parental_copy_number；(d)--densitypyclone_beta_binomial，當1.1)采用的是測序深度較低的全基因組測序技術(shù)時，該參數(shù)設(shè)置為pyclone_binomial；(e)--in_filespatient.tsv，patient.tsv文件是以制表符為分割符的文件；除標題行外，每行包含一個變異V(SNV/indel/SV)的信息；內(nèi)含六列，依次為：mutation_id、ref_counts、var_counts、normal_cn、minor_cn和major_cn。PyClone(Roth,A.etal.PyClone:statisticalinferenceofclonalpopulationstructureincancer.Naturemethods11,396-398,doi:10.1038/nmeth.2883(2014).)根據(jù)變異V(SNV/indel/SV)和CNV信息估計Vi所在的細胞占所有腫瘤細胞的比例，并依此對每個變異賦予一個簇標簽(Ci,i＝1,…,n，Ci∈{1,…,c},c為簇的個數(shù))。對變異聚類還可以采用PyClone的其他版本或其他變異聚類軟件。3)克隆層級計算：克隆層級，即變異聚成的分子克隆數(shù)目c。腫瘤在不斷進展的過程中，腫瘤進化發(fā)生樹的結(jié)構(gòu)也逐漸變得龐大和復雜，分子克隆也會更多，克隆層級不斷加深，因此克隆層級的大小與腫瘤異質(zhì)性密切相關(guān)。3.腫瘤異質(zhì)性評估取所有受試患者的克隆層級中位數(shù)作為判斷每位患者腫瘤異質(zhì)性高/低的閾值；克隆層級低于該閾值的患者，其腫瘤異質(zhì)性較低，反之則腫瘤異質(zhì)性較高。由于癌種之間基因組變異情況會有明顯差異，因此本發(fā)明的方法不建議跨癌種比較異質(zhì)性。在本發(fā)明的方法中，除了測序步驟之外，其他步驟可以以指令的形式存在于計算機可讀介質(zhì)中，只需要將所述測序結(jié)果輸入計算設(shè)備，所述計算設(shè)備就可以讀取所述計算機可讀介質(zhì)中的指令，完成本發(fā)明方法的其他步驟。所述計算設(shè)備包括但不限于計算機、便攜式計算機、PAD、智能手機、智能手腕等。實施例在本實施例中，以10例肺癌患者為例，對本發(fā)明進行說明。需要說明的是，該實施例僅僅是為了說明目的，而不能以任何方式解釋成對本申請的限制。1.ctDNA高通量測序檢測出的變異列表1)變異V(SNV/indel/SV)10例肺癌患者分別檢出2-8個變異，變異V(SNV/indel/SV)檢出列表見表1。表1變異V(SNV/indel/SV)檢出列表2)CNV10例肺癌患者中，只有S5檢出EGFR擴增，擴增倍數(shù)為1.73，見表2。因此，S5中檢出的EGFRDeletion變異對應的實際總拷貝數(shù)被估計為4。表2CNV檢出列表樣品編號基因拷貝數(shù)變異狀態(tài)拷貝數(shù)變異倍數(shù)S5EGFRgain1.732.mClone分析結(jié)果統(tǒng)計Pyclone聚類使用PyClonev0.13對檢出的變異進行聚類，除以下幾個參數(shù)外，均采用默認參數(shù)：a)--tumour_contentsb)--num_iters20000c)--priortotal_copy_numberd)--densitypyclone_beta_binomiale)--in_files參數(shù)a)和e)分別指定CTF及輸入文件。每例患者的CTF及輸入文件的內(nèi)容見表3：表3Pyclone輸入數(shù)據(jù)其中，mutation_id表示變異編號，ref_counts表示參考計數(shù)，var_counts表示變異計數(shù)，normal_cn表示正常拷貝數(shù)，即CNi，minor_cn表示小拷貝數(shù)，即CNi,minor，major_cn表示大拷貝數(shù)，即CNi,major。利用本發(fā)明的方法進行的mClone分析的結(jié)果及后續(xù)隨訪數(shù)據(jù)如表4所示，取所有克隆層級的中位數(shù)，即cut-off＝3.5，克隆層級大于3.5為異質(zhì)性高的患者，克隆層級小于3.5為異質(zhì)性低的患者。表4mClone分析結(jié)果與臨床信息對照表樣品編號克隆層級腫瘤異質(zhì)性無進展生存期(周)S12低54S21低49S34高11S44高27S56高9S66高17S73低17S83低34S95高22S102低36對這批樣品進行生存分析(見圖2)，發(fā)現(xiàn)利用克隆層級評估的腫瘤異質(zhì)性結(jié)果，對患者預后(無進展生存期)有顯著的預測效果(p，0.044)，較高的腫瘤異質(zhì)性具有更高的進展風險(風險比為9.386)。該結(jié)果驗證了利用mClone分析技術(shù)評估腫瘤異質(zhì)性的有效性和準確性。本發(fā)明的分子克隆mClone分析方法得到的分子克隆層級可以用于評估腫瘤的異質(zhì)性，而腫瘤的異質(zhì)性代表了腫瘤的發(fā)展階段，異質(zhì)性越大表示患者處于腫瘤的越后期，患者的腫瘤近期繼續(xù)發(fā)展風險越大。以上實驗數(shù)據(jù)證實了這一點。當前第1頁1 2 3