本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種提高腈水合酶活性的枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：煙酰胺是一種水溶性維生素且是維生素B族中的一員，腈水合酶是一些微生物在進行肟或脲代謝過程中產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)這一物質(zhì)具有降解有毒物質(zhì)乙腈的功效，并命名為“腈水合酶”，由于具有高度的選擇性(區(qū)域選擇性和立體選擇性)，通過酶促反應(yīng)可以將腈類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成酰胺、醇、酯、氨基化合物、烯胺等價值更高、應(yīng)用范圍更廣的一些化合物。腈水合酶是生產(chǎn)煙酰胺的重要生物催化媒介。目前關(guān)于利用微生物中的腈水合酶在生物催化煙酰胺的報道有很多，枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，屬于革蘭氏陽性菌，無莢膜，周生鞭毛，能運動?？莶菅挎邨U菌作為益生菌，具有如下的優(yōu)點：枯草芽孢桿菌是一類重要的益生菌生產(chǎn)菌株，相對于其他類型益生菌(如乳酸菌)，芽孢桿菌一般對營養(yǎng)要求簡單，代謝速度快，而且易于分離、培養(yǎng)和保藏，對工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)條件不苛刻，此外芽孢桿菌生產(chǎn)的芽孢對熱、紫外線、電離輻射和低pH(2～3)等不良環(huán)境有極強的抵抗能力；能合成維生素B1、B2、B6、鹽酸等多種B族維生素。現(xiàn)有腈水合酶產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)過程中由于培養(yǎng)條件掌握不好，隨著反應(yīng)時間的延長，細(xì)胞受底物和產(chǎn)物的抑制效果逐漸增加，反應(yīng)速度下降，造成腈水合酶活較低，單位體積發(fā)酵液催化能力低，發(fā)酵成本高，最終難以得到高濃度的煙酰胺產(chǎn)物，使得煙酰胺產(chǎn)率較低，影響經(jīng)濟效益。技術(shù)實現(xiàn)要素：為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基，單位體積發(fā)酵液具有更高催化能力，強化枯草芽孢桿菌腈水合酶活性，提高煙酰胺產(chǎn)率，有效降低發(fā)酵成本，大大提高催化效益。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特點是發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖1～5g/v％、誘導(dǎo)劑IND0.5～5ml/L、KH2PO40.01～1g/v％、K2HPO4·3H2O0.01～1g/v％、MgSO4·7H2O0.01～0.05g/v％、谷氨酸0.05～1g/v％、脲0.01～1g/v％、NH4Cl0.1～1g/v％、酵母浸粉0.1～1g/v％、Tween-800.1～1g/v％。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基中，可選的，所述葡萄糖濃度為100～500g/L。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基中，可選的，所述誘導(dǎo)劑IND濃度為5～20ml/L。本發(fā)明的另一目的是提供一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特點是該培養(yǎng)基用于枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，在5L發(fā)酵罐中加入2～4L發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃實罐消毒10～30min，以5～15％的接種量將200～400ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在通氣量1～3vvm，罐壓0.01～0.1Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速100～300rpm，溫度25～35℃的條件下，發(fā)酵周期72～120h左右；培養(yǎng)過程中，每隔2～5h取樣，測定菌體生長量、發(fā)酵液pH變化、葡萄糖含量以及酶活變化情況，控制pH值在6.8～7.5，通過補加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其濃度保持在3～5g/L之間，當(dāng)酶活出現(xiàn)降低時結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌體待用。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基的應(yīng)用中，可選的在發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用葡萄糖-Co2+耦合補加工藝，添加葡萄糖和誘導(dǎo)劑IND二者配成的補料。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基的應(yīng)用中，可選的在發(fā)酵過程中需要控制細(xì)菌生長環(huán)境：通過添加氨水將pH控制在6.8～7.5，溫度控制在25～35℃，通氧量保持1～3vvm。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是單位體積發(fā)酵液具有催化能力高，強化枯草芽孢桿菌腈水合酶活性，提高煙酰胺產(chǎn)率，有效降低發(fā)酵成本，大大提高催化效益。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步的說明。本發(fā)明各實施例中使用的葡萄糖濃度為100-500g/L，誘導(dǎo)劑IND濃度為5-20ml/L，并且以下原料葡萄糖、誘導(dǎo)劑IND、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、谷氨酸、脲、NH4Cl、酵母浸粉、Tween-80均為市售。以上原料的是否有特殊要求比如純度等級；某些試劑只能使用某一公司出品：分析純級別，對廠家無要求。實施例1一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基，成分為：葡萄糖1～5g/v％、誘導(dǎo)劑IND0.5～5ml/L、KH2PO40.01～1g/v％、K2HPO4·3H2O0.01～1g/v％、MgSO4·7H2O0.01～0.05g/v％、谷氨酸0.05～1g/v％、脲0.01～1g/v％、NH4Cl0.1～1g/v％、酵母浸粉0.1～1g/v％、Tween-800.1～1g/v％。一種將上述培養(yǎng)基用于枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，在5L發(fā)酵罐中加入2～4L發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃實罐消毒10～30min，以5～15％的接種量將200～400ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在通氣量1～3vvm，罐壓0.01～0.1Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速100～300rpm，溫度25～35℃的條件下，發(fā)酵周期72～120h左右，培養(yǎng)過程中，每隔2～5h取樣，測定菌體生長量、發(fā)酵液pH變化、葡萄糖含量以及酶活變化情況；控制pH值在6.8～7.5，通過補加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其濃度保持在3～5g/L之間，當(dāng)酶活出現(xiàn)降低時結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌體待用。進一步的，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用葡萄糖-Co2+耦合補加工藝，添加葡萄糖和誘導(dǎo)劑IND二者配成的補料。進一步的，在發(fā)酵過程中需要控制細(xì)菌生長環(huán)境中通過添加氨水將PH控制在6.8～7.5；溫度控制在25～35℃；通氧量保持1～3vvm。實施例2一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基的應(yīng)用，包括以下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)：在5L發(fā)酵罐中加入2L發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量為2.05噸)，121℃實罐消毒30min，以10％的接種量將400ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在通氣量3vvm，罐壓0.05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，溫度25℃的條件下，發(fā)酵周期72h；在培養(yǎng)過程中，每隔2h取樣，測定菌體生長量、發(fā)酵液pH變化、葡萄糖含量以及酶活變化情況，通過添加30ml的氨水(ω:20％)控制pH值在6.8～7.5，補加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其濃度保持在3～5g/L之間，當(dāng)酶活出現(xiàn)降低時結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌體待用。其中：一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖5g/v％、誘導(dǎo)劑IND5ml/L、KH2PO40.4g/v％、K2HPO4·3H2O0.2g/v％、MgSO4·7H2O0.05g/v％、谷氨酸0.8g/v％、脲0.6g/v％、NH4Cl0.5g/v％、酵母浸粉0.5g/v％、Tween-800.5g/v％，pH控制為6.8～7.5，121℃滅菌10-30min。實施例3一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基的應(yīng)用，包括以下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)：在5L發(fā)酵罐中加入3L發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量為3.08噸)，121℃實罐消毒30min，以15％的接種量將400ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在通氣量2vvm，罐壓0.05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，溫度25℃的條件下，發(fā)酵周期96h；在培養(yǎng)過程中，每隔2h取樣，測定菌體生長量、發(fā)酵液pH變化、葡萄糖含量以及酶活變化情況，通過添加30ml的氨水(ω:30％)的控制pH值在6.8～7.5，補加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其濃度保持在3～5g/L之間，當(dāng)酶活出現(xiàn)降低時結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌體待用。其中：一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖5g/v％、誘導(dǎo)劑IND4ml/L、KH2PO40.8g/v％、K2HPO4·3H2O0.2g/v％、MgSO4·7H2O0.03g/v％、谷氨酸0.8g/v％、脲0.5g/v％、NH4Cl0.4g/v％、酵母浸粉0.5g/v％、Tween-800.8g/v％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min。實施例4一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基的應(yīng)用，包括以下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)：在5L發(fā)酵罐中加入4L發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量為4.1噸)，121℃實罐消毒30min，以8％的接種量將400ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在通氣量2vvm，罐壓0.05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，溫度35℃的條件下，發(fā)酵周期120h；在培養(yǎng)過程中，每隔3h取樣，測定菌體生長量、發(fā)酵液pH變化、葡萄糖含量以及酶活變化情況，通過添加80ml的氨水(ω:10％)的控制pH值在6.8～7.5，補加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其濃度保持在3～5g/L之間，當(dāng)酶活出現(xiàn)降低時結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌體待用。其中：一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4g/v％、誘導(dǎo)劑IND3ml/L、KH2PO40.9g/v％、K2HPO4·3H2O0.8g/v％、MgSO4·7H2O0.03g/v％、谷氨酸0.6g/v％、脲0.3g/v％、NH4Cl0.8g/v％、酵母浸粉0.8g/v％、Tween-800.3g/v％，pH控制為6.8～7.5，121℃滅菌10-30min。使用實施例2～4的枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌進行培養(yǎng)，其結(jié)果如表1所示。表1枯草芽孢桿菌培養(yǎng)實驗結(jié)果培養(yǎng)基培養(yǎng)時間菌體生長量酶活實施例272h62.08g/L6983U/ml實施例372h61.45g/L6774U/ml實施例472h60.37g/L6565U/ml當(dāng)前第1頁1 2 3