本發(fā)明屬于生物化工
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法。
背景技術(shù)：
：腈水合酶是生產(chǎn)煙酰胺的重要生物催化媒介。目前關(guān)于利用微生物中的腈水合酶在生物催化煙酰胺的報(bào)道有很多：如公開號(hào)為CN1424402A的發(fā)明專利報(bào)道了采用丙酸棒桿菌產(chǎn)生的腈水合酶將3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化成煙酰胺，在轉(zhuǎn)化過程中，當(dāng)產(chǎn)物濃度≥5％時(shí)用ultraflow膜過濾系統(tǒng)出產(chǎn)物，同時(shí)開始補(bǔ)加3-氰基吡啶和水，等產(chǎn)物的累積濃度≥10％以后一次性出罐；再如公開號(hào)為CN1154364A的發(fā)明專利報(bào)道了采用固定化的紅球菌屬rhodochrous微生物，再多段連續(xù)槽形反應(yīng)器中進(jìn)行3-氰基吡啶的催化水合反應(yīng)，其反應(yīng)液中3-氰基吡啶的含量在10～20％重量之間；再如公開號(hào)為CN1952114A的發(fā)明專利報(bào)道了一種產(chǎn)腈水合酶的谷氨酸棒桿菌，經(jīng)過固定化處理后在水溶液中轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶，最終在反應(yīng)物總重量中所加入的3-氰基吡啶的重量為10～25％。上述的三個(gè)專利生物催化工藝的不足之處在于生物催化劑一次性加入，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，細(xì)胞受底物和產(chǎn)物的抑制效果逐漸增加，反應(yīng)速度下降，腈水合酶活性降低，只能被動(dòng)的在較低產(chǎn)物濃度時(shí)選擇放料，最終難以得到高濃度的煙酰胺產(chǎn)物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有枯草芽孢桿菌腈水合酶活性較低的不足，提供一種能提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法，使單位體積發(fā)酵液具有更高催化能力，強(qiáng)化腈水合酶活性，有效降低發(fā)酵成本，提高煙酰胺產(chǎn)率。為了實(shí)現(xiàn)上述的發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案如下：一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法，包括以下步驟：(1)斜面培養(yǎng)將菌種接到滅過菌的斜面固體培養(yǎng)基中25-35℃培養(yǎng)2-6天，接入裝液量為50ml的500ml帶凹口三角搖瓶中，25-35℃搖床培養(yǎng)24-72h，搖床轉(zhuǎn)速100-300rpm，作為一級(jí)種子備用；(2)種子培養(yǎng)將培養(yǎng)好的一級(jí)種子按5-15％的接種量接入50ml的二級(jí)種子培養(yǎng)搖瓶中，25-35℃搖床培養(yǎng)24-72h，搖床轉(zhuǎn)速100-300rpm；(3)發(fā)酵培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐中加入2-4L發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃實(shí)罐消毒10-30min，以5-15％的接種量將200-400ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在通氣量1-3vvm，罐壓0.01-0.1Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速100-300rpm，溫度25-35℃的條件下，發(fā)酵周期72-120h；在培養(yǎng)過程中，每隔2-5h取樣，測(cè)定菌體生長量、發(fā)酵液pH變化、葡萄糖含量以及酶活變化情況，控制pH值在6.8-7.5，通過補(bǔ)加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其濃度保持在3～5g/L之間，當(dāng)酶活出現(xiàn)降低時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌體待用。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法中，可選的，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，通過添加氨水控制pH值在6.8-7.5。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法中，可選的，所述氨水的濃度(ω)為10％-30％，添加量為發(fā)酵液體積的0.5％-2.5％。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法中，可選的，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用葡萄糖-Co2+耦合補(bǔ)加工藝，添加葡萄糖和誘導(dǎo)劑IND二者配成的補(bǔ)料。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法中，可選的，所述斜面固體培養(yǎng)基成分為：葡萄糖1-5g/ml％、NaCl0.1-0.3g/ml％、KH2PO40.1-0.3g/ml％、蛋白胨0.2-0.7g/ml％、酵母浸粉0.2-0.7g/ml％、瓊脂粉1-5g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法中，可選的，所述種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖1-3g/ml％、KH2PO40.01-0.1g/ml％、K2HPO4·3H2O0.01-0.1g/ml％、MgSO4·7H2O0.01-0.05g/ml％、谷氨酸0.05-0.5g/ml％、酵母浸粉0.1-1g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法中，可選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖1-5g/ml％、誘導(dǎo)劑IND0.5-5ml/L、KH2PO40.01-1g/ml％、K2HPO4·3H2O0.01-1g/ml％、MgSO4·7H2O0.01-0.05g/ml％、谷氨酸0.05-1g/ml％、脲0.01-1g/ml％、NH4Cl0.1-1g/ml％、酵母浸粉0.1-1g/ml％、Tween-800.1-1g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法中，可選的，所述葡萄糖的濃度為100-500g/L。在上述的提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法中，可選的，所述誘導(dǎo)劑IND的濃度為5-20ml/L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果是：本發(fā)明一方面改變發(fā)酵培養(yǎng)基中各營養(yǎng)組分：發(fā)酵培養(yǎng)基中含有Tween-800.1-1g/ml％、NH4Cl0.1-1g/ml％、脲0.01-1g/ml％，并采用葡萄糖-Co2+耦合補(bǔ)加工藝，添加葡萄糖和誘導(dǎo)劑IND二者配成的補(bǔ)料；另一方面控制細(xì)菌生長環(huán)境：發(fā)酵過程中通過添加氨水將pH控制在6.8-7.5，溫度控制在25-35℃，通氧量保持1-3vvm，從而達(dá)到大幅度提高腈水合酶發(fā)酵生產(chǎn)中酶活性的目的。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。本發(fā)明各實(shí)施例中使用的葡萄糖濃度為100-500g/L，誘導(dǎo)劑IND濃度為5-20ml/L，并且以下原料葡萄糖、誘導(dǎo)劑IND、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、谷氨酸、脲、NH4Cl、酵母浸粉、Tween-80均為市售。以上原料的是否有特殊要求比如純度等級(jí)；某些試劑只能使用某一公司出品：分析純級(jí)別，對(duì)廠家無要求。實(shí)施例1一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法，包括以下步驟：(1)斜面培養(yǎng)：將菌種接到滅過菌的斜面固體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)6天，接入裝液量為50ml的500ml帶凹口三角搖瓶中，25℃搖床培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速300rpm，作為一級(jí)種子備用；(2)種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的一級(jí)種子按10％的接種量接入50ml的二級(jí)種子培養(yǎng)搖瓶中，25℃搖床培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速300rpm；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：在5L發(fā)酵罐中加入2L發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量為2.05噸)，121℃實(shí)罐消毒30min，以10％的接種量將400ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在通氣量3vvm，罐壓0.05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，溫度25℃的條件下，發(fā)酵周期72h；在培養(yǎng)過程中，每隔2h取樣，測(cè)定菌體生長量、發(fā)酵液pH變化、葡萄糖含量以及酶活變化情況，通過添加30ml的氨水(ω:20％)控制pH值在6.8-7.5，補(bǔ)加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其濃度保持在3～5g/L之間，當(dāng)酶活出現(xiàn)降低時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌體待用。其中：斜面固體培養(yǎng)基成分為：葡萄糖5g/ml％、NaCl0.3g/ml％、KH2PO40.3g/ml％、蛋白胨0.7g/ml％、酵母浸粉0.5g/ml％、瓊脂粉3g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min；種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖3g/ml％、KH2PO40.05g/ml％、K2HPO4·3H2O0.05g/ml％、MgSO4·7H2O0.05g/ml％、谷氨酸0.5g/ml％、酵母浸粉0.5g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖5g/ml％、誘導(dǎo)劑IND5ml/L、KH2PO40.4g/ml％、K2HPO4·3H2O0.2g/ml％、MgSO4·7H2O0.05g/ml％、谷氨酸0.8g/ml％、脲0.6g/ml％、NH4Cl0.5g/ml％、酵母浸粉0.5g/ml％、Tween-800.5g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min。實(shí)施例2一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法，包括以下步驟：(1)斜面培養(yǎng)：將菌種接到滅過菌的斜面固體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)5天，接入裝液量為50ml的500ml帶凹口三角搖瓶中，30℃搖床培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速100rpm，作為一級(jí)種子備用；(2)種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的一級(jí)種子按15％的接種量接入50mL的二級(jí)種子培養(yǎng)搖瓶中，30℃搖床培養(yǎng)72hh，搖床轉(zhuǎn)速200rpm；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：在5L發(fā)酵罐中加入3L發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量為3.08噸)，121℃實(shí)罐消毒30min，以15％的接種量將400ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在通氣量2vvm，罐壓0.05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，溫度25℃的條件下，發(fā)酵周期96h；在培養(yǎng)過程中，每隔2h取樣，測(cè)定菌體生長量、發(fā)酵液pH變化、葡萄糖含量以及酶活變化情況，通過添加30ml的氨水(ω:30％)控制pH值在6.8-7.5，補(bǔ)加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其濃度保持在3～5g/L之間，當(dāng)酶活出現(xiàn)降低時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌體待用。其中：斜面固體培養(yǎng)基成分為：葡萄糖4g/ml％、NaCl0.2g/ml％、KH2PO40.3g/ml％、蛋白胨0.6g/ml％、酵母浸粉0.5g/ml％、瓊脂粉4g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min；種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖2g/ml％、KH2PO40.05g/ml％、K2HPO4·3H2O0.06g/ml％、MgSO4·7H2O0.04g/ml％、谷氨酸0.3g/ml％、酵母浸粉0.6g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖5g/ml％、誘導(dǎo)劑IND4ml/L、KH2PO40.8g/ml％、K2HPO4·3H2O0.2g/ml％、MgSO4·7H2O0.03g/ml％、谷氨酸0.8g/ml％、脲0.5g/ml％、NH4Cl0.4g/ml％、酵母浸粉0.5g/ml％、Tween-800.8g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min。實(shí)施例3一種提高枯草芽孢桿菌腈水合酶活性的方法，包括以下步驟：(1)斜面培養(yǎng)：將菌種接到滅過菌的斜面固體培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)4天，接入裝液量為50ml的500ml帶凹口三角搖瓶中，35℃搖床培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，作為一級(jí)種子備用；(2)種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的一級(jí)種子按8％的接種量接入50ml的二級(jí)種子培養(yǎng)搖瓶中，35℃搖床培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速200rpm；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：在5L發(fā)酵罐中加入4L發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量為4.1噸)，121℃實(shí)罐消毒30min，以8％的接種量將400ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在通氣量2vvm，罐壓0.05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，溫度35℃的條件下，發(fā)酵周期120h；在培養(yǎng)過程中，每隔3h取樣，測(cè)定菌體生長量、發(fā)酵液pH變化、葡萄糖含量以及酶活變化情況，通過添加80ml的氨水(ω:10％)控制pH值在6.8-7.5，補(bǔ)加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其濃度保持在3～5g/L之間，當(dāng)酶活出現(xiàn)降低時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌體待用。其中：斜面固體培養(yǎng)基成分為：葡萄糖5g/ml％、NaCl0.3g/ml％、KH2PO40.25g/ml％、蛋白胨0.7g/ml％、酵母浸粉0.6g/ml％、瓊脂粉3g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min；種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖2g/ml％、KH2PO40.08g/ml％、K2HPO4·3H2O0.08g/ml％、MgSO4·7H2O0.03g/ml％、谷氨酸0.42g/ml％、酵母浸粉0.4g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖4g/ml％、誘導(dǎo)劑IND3ml/L、KH2PO40.9g/ml％、K2HPO4·3H2O0.8g/ml％、MgSO4·7H2O0.03g/ml％、谷氨酸0.6g/ml％、脲0.3g/ml％、NH4Cl0.8g/ml％、酵母浸粉0.8g/ml％、Tween-800.3g/ml％，pH控制為6.8-7.5，121℃滅菌10-30min。使用實(shí)施例1～3的枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，其結(jié)果如表1所示。表1枯草芽孢桿菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間菌體生長量酶活實(shí)施例272h62.08g/L6983U/ml實(shí)施例372h61.45g/L6774U/ml實(shí)施例472h60.37g/L6565U/ml當(dāng)前第1頁1 2 3