本發(fā)明涉及一種基因多態(tài)性的檢測產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的檢測體系，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：伊立替康(irinotecan,cpt-11)屬于細(xì)胞毒類藥物的新家族-喜樹堿類藥物，是半合成的可溶性喜樹堿類衍生物，是目前廣泛應(yīng)用于臨床的拓?fù)洚悩?gòu)酶i抑制劑。它是一種廣譜抗腫瘤藥物，已廣泛用于結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌及其他多種惡性腫瘤的治療。cpt-11進入體內(nèi)之后在羧酸酯酶(carboxylesterases,ce)作用下轉(zhuǎn)化為活性形式7-乙基-10-羥基喜樹堿(7-ethyl-l0-hydroxycamptothecin,sn-38)；sn-38是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶i抑制劑，通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶i，阻止dna單鏈斷裂的修復(fù)，從而干擾dna復(fù)制，影響轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，發(fā)揮毒性效應(yīng)。sn-38繼而被肝臟和腸內(nèi)的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(uridinediphosphateglucuronosyltransferase,ugt)滅活為葡萄糖醛酸產(chǎn)物(sn-38g)后，排泄入腸，而腸道內(nèi)的β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)又可將滅活的sn-38g轉(zhuǎn)化為活性產(chǎn)物sn-38，引起遲發(fā)性腹瀉和中性粒細(xì)胞減少等毒性反應(yīng)，之后腸道內(nèi)的ugt酶又可將sn-38醛酸化為sn-38g解毒。因此，ugt酶的表達(dá)及其活性，與cpt-11的療效及不良反應(yīng)均密切相關(guān)。ugt是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里的一種膜結(jié)合酶，主要催化ii相結(jié)合反應(yīng)，它根據(jù)核苷酸序列可以分為兩個家族：ugt1和ugt2，ugt1基因位于2號染色體，包含有多于13個不同的啟動子序列，可分為13個亞型，分別命名為：ugt1a1-ugt1a13，而其中ugt1a1是參與cpt-11代謝最主要的同工酶。在ugt1a1眾多基因多態(tài)性中，基因啟動子區(qū)的ugt1a1*28和ugt1a1*6基因多態(tài)性因與cpt-11化療不良反應(yīng)和療效的關(guān)系尤為引人關(guān)注，是近年來研究的最多的一種變異。研究發(fā)現(xiàn)ugt1a1*28基因多態(tài)性可以增加cpt-11化療時嚴(yán)重腹瀉不良反應(yīng)的發(fā)生率。ugt1a1基因位點的多態(tài)性多達(dá)幾十種，其中ugt1a1*28和ugt1a1*6基因多態(tài)性與伊立替康不良反應(yīng)的關(guān)系尤為隱忍關(guān)注，多項研究已經(jīng)證實ugt1a1*28和ugt1a1*6突變型患者遲發(fā)性腹瀉或中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生率明顯提高，在臨床工作中，聯(lián)合檢測ugt1a1*28和ugt1a1*6基因多態(tài)性更有助于預(yù)測伊立替康不良反應(yīng)。治療前檢測患者ugt1a1基因型有助于預(yù)測不良反應(yīng)，知道臨床用藥，規(guī)避相關(guān)風(fēng)險，對實現(xiàn)腫瘤個體化治療有重要意義。目前對ugt1a1基因多態(tài)性的檢測主要是用測序法，該方法程序繁瑣，成本較高，模板量要求較大。而少數(shù)采用abi毛細(xì)管電泳的方法由于采用第一代的藍(lán)綠光區(qū)的熒光染料，而自然界自發(fā)熒光也在藍(lán)綠光區(qū)，所以易受自然界自發(fā)熒光干擾、影響結(jié)果判讀準(zhǔn)確性。因此，開發(fā)一種檢測ugt1a1基因多態(tài)性的產(chǎn)品，以實現(xiàn)更高靈敏度、更低成本、更方便快捷的ugt1a1基因多態(tài)性檢測是非常有必要的。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有很高的靈敏度，模板量低，且快速、準(zhǔn)確、低成本的ugt1a1基因多態(tài)性檢測試劑盒，以及該試劑盒所用的特異性引物。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種ugt1a1基因多態(tài)性檢測引物肽核酸，包括正向引物ugt1a1-f1、反向引物ugt1a1-r1、正向引物ugt1a1-f2、反向引物ugt1a1-r2和肽核酸；所述正向引物ugt1a1-f1的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述反向引物ugt1a1-r1的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述正向引物ugt1a1-f2的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述反向引物ugt1a1-r2的核苷酸序列如seqidno.4所示；所述肽核酸的核苷酸序列如seqidno.5所示；所述反向引物ugt1a1-r1和反向引物ugt1a1-r2的5'端設(shè)有熒光標(biāo)記。上述熒光標(biāo)記是fam、hex、vic、rox、cy3、或cy5。上述正向引物ugt1a1-f1和反向引物ugt1a1-r1用于檢測ugt1a1*28基因6ta/7ta多態(tài)性，所述正向引物ugt1a1-f2和反向引物ugt1a1-r2用于檢測ugt1a1*6基因g211a多態(tài)性。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的又一種技術(shù)方案是：一種ugt1a1基因多態(tài)性檢測試劑盒，包括引物肽核酸混合液；所述引物肽核酸混合液包括正向引物ugt1a1-f1、反向引物ugt1a1-r1、正向引物ugt1a1-f2、反向引物ugt1a1-r2和肽核酸；所述正向引物ugt1a1-f1的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述反向引物ugt1a1-r1的核苷酸序列如seqidno.2所示；、所述正向引物ugt1a1-f2的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述反向引物ugt1a1-r2的核苷酸序列如seqidno.4所示；所述肽核酸的核苷酸序列如seqidno.5所示；所述反向引物ugt1a1-r1和反向引物ugt1a1-r2的5'端設(shè)有熒光標(biāo)記。上述熒光標(biāo)記是fam、hex、vic、rox、cy3、或cy5。上述正向引物ugt1a1-f1和反向引物ugt1a1-r1用于檢測ugt1a1*28基因6ta/7ta多態(tài)性，所述正向引物ugt1a1-f2和反向引物ugt1a1-r2用于檢測ugt1a1*6基因g211a多態(tài)性。上述ugt1a1基因多態(tài)性檢測試劑盒還包括pcr反應(yīng)液、陽性對照液和陰性對照液；所述陽性對照液中包括ugt1a1*28基因的6ta酶切質(zhì)粒、ugt1a1*28基因的7ta酶切質(zhì)粒和ugt1a1*6基因的211a酶切質(zhì)粒；陰性對照液是雙蒸水。引入ugt1a1*28基因的6ta酶切質(zhì)粒的6ta核苷酸序列如seqidno.6所示；引入ugt1a1*28基因的7ta酶切質(zhì)粒的7ta核苷酸序列如seqidno.7所示；引入ugt1a1*6基因的211a酶切質(zhì)粒的211a核苷酸序列如seqidno.8所示。反應(yīng)體系的體積為10μl或20μl，所述正向引物和反向引物在反應(yīng)體系中的終濃度為1μm，所述肽核酸的終濃度與引物的終濃度比值為30:1。上述pcr反應(yīng)液包括pcr緩沖液、2.5mm的dntps和5u/μl的taqdna聚合酶；所述pcr緩沖液包括100mm的tris-hcl、500mm的kcl和15mm的mgcl2，用于配置所述pcr緩沖液的tris-hcl緩沖液的ph值為8.3；所述dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp。本發(fā)明具有積極的效果：(1)本發(fā)明的ugt1a1基因多態(tài)性檢測試劑盒，采用了特異性引物肽核酸組合，并且優(yōu)化了反應(yīng)體系，結(jié)合快速高效且全自動化的多功能遺傳分析系統(tǒng)采用pcr毛細(xì)管電泳技術(shù)，通過引物上連接的熒光基團對產(chǎn)物片段進行檢測從而判斷ugt1a1的基因型。試劑盒的檢測結(jié)果無雜峰，具有高特異性。試劑盒檢測ugt1a1基因多態(tài)性的通量高，且更加節(jié)省珍貴的模板。該試劑盒經(jīng)過驗證，可檢測低至10ng/μl的基因組樣本，靈敏度極高，可以有效地為腫瘤的臨床個體化用藥提供輔助診斷依據(jù)。(2)本發(fā)明的ugt1a1基因多態(tài)性檢測試劑盒，采用金標(biāo)準(zhǔn)進行對照實驗，基因型符合率≥95％，分子分型準(zhǔn)確度高。(3)本發(fā)明的ugt1a1基因多態(tài)性檢測試劑盒針對點突變和插入設(shè)計引物和肽核酸，能夠根據(jù)檢測結(jié)果直觀判斷ugt1a1基因多態(tài)性，多重檢測的引物和肽核酸相互之間幾乎不干擾，能夠檢測濃度為10-50ng/ul樣本。本發(fā)明的引物最適的退火溫度57℃/60℃，針對實驗失敗原因不明的樣本，可以徐選擇不同的退火溫度進行實驗，提高檢測的成功率。(4)本發(fā)明的ugt1a1基因多態(tài)性檢測試劑盒操作簡便快捷且成本低，檢測時間僅需2.5至3小時，單次反應(yīng)成本小于10元，而測序每反應(yīng)成本約在30元。該試劑盒突破了常規(guī)測序費時費力且花費不菲的應(yīng)用局限，使ugt1a1基因多態(tài)性檢測在批量檢測中有更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，能更迅速地獲得分子檢測結(jié)果，使得個性化醫(yī)療過程更為順暢。(5)本發(fā)明ugt1a1基因試劑盒聯(lián)合檢測ugt1a1*28和ugt1a1*6兩個突變位點，比單個突變位點檢出率(ugt1a1*28突變檢出率21.6％和ugt1a1*6突變檢出率39.2％)分別高出31.2％和13.6％，能夠準(zhǔn)確指導(dǎo)伊立替康在臨床中的應(yīng)用。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例的試劑盒對h2o進行pcr反應(yīng)后利用gexp系統(tǒng)進行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜。圖2是本發(fā)明實施例試劑盒對6ta樣本進行pcr反應(yīng)后利用gexp系統(tǒng)進行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜。圖3是本發(fā)明實施例試劑盒對7ta樣本進行pcr反應(yīng)后利用gexp系統(tǒng)進行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜。圖4是是本發(fā)明實施例試劑盒對211a樣本進行pcr反應(yīng)后利用gexp系統(tǒng)進行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜。圖5是本發(fā)明實施例試劑盒對陽性對照液進行pcr反應(yīng)后利用gexp系統(tǒng)進行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述本
發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。下述實施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。一、試劑盒的組成。本實施例的ugt1a1基因多態(tài)性檢測試劑盒包括：pcr反應(yīng)液、引物肽核酸混合液、陽性對照液和陰性對照液，如表1所示。表1試劑盒組成表上述表1中試劑盒各組分的說明如下：引物肽核酸混合液由正向引物ugt1a1-f1、反向引物ugt1a1-r1、正向引物ugt1a1-f2、反向引物ugt1a1-r2、肽核酸和純水配制而成。正向引物和反向引物在反應(yīng)體系中的終濃度均為1μm。針對有效模板濃度低的dna，肽核酸(pna)的濃度與引物的濃度存在一定比例關(guān)系，本發(fā)明進行濃度梯度實驗，發(fā)現(xiàn)肽核酸的濃度與引物濃度比為30:1至50:1時，反應(yīng)體系野生型模板抑制效果最佳，當(dāng)肽核酸的濃度與引物濃度在30:1至50:1范圍之外，野生型和突變型模板均受到抑制，最后確定肽核酸的濃度與引物的濃度比值為30:1。pcr反應(yīng)液由10×pcr緩沖液、dntps和熱啟動酶配制而成。10×pcr緩沖液包括100mm的tris-hcl、500mm的kcl和15mm的mgcl2。用于配制pcr緩沖液的tris-hcl緩沖液的ph值為8.3。dntps包括濃度均為2.5mm的datp、dgtp、dctp和dttp。熱啟動酶是使用濃度為5u/μl的taqdna聚合酶。10×pcr緩沖液、dntps和熱啟動酶均來自takara公司(貨號：r007a)。陽性對照液是ugt1a1*28基因的6ta酶切質(zhì)粒(簡稱：6ta質(zhì)粒)的溶液、ugt1a1*28基因的7ta酶切質(zhì)粒(簡稱：7ta質(zhì)粒)的溶液、ugt1a1*6基因211a酶切質(zhì)粒(簡稱：211a質(zhì)粒)的溶液按照體積比1:1:1混合而成。陰性對照液是雙蒸水。引物混合液中的正向引物ugt1a1-f1和反向引物ugt1a1-r1、正向引物ugt1a1-f2和反向引物ugt1a1-r2、肽核酸的核苷酸序列如表2所示，由上海生工生物工程有限公司合成，反向引物ugt1a1-r1和ugt1a1-r2的5’端設(shè)有cy5熒光標(biāo)記。正向引物ugt1a1-f1和反向引物ugt1a1-r1檢測的是ugt1a1*28基因多態(tài)性，ugt1a1-f2和反向引物ugt1a1-r2檢測的是ugt1a1*6基因多態(tài)性。肽核酸是一種以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了dna中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與dna相同，pna可以通過堿基配對的形式識別并結(jié)合dna或rna序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，是一種dna類似物。本發(fā)明中的肽核酸是能夠與ugt1a1*6(g211a)野生型穩(wěn)定結(jié)合后而不被聚合酶3’-5’端酶切功能所切割，阻礙ugt1a1*6(g211a)野生型dna模板的pcr擴增，從而實現(xiàn)ugt1a1*6(g211a)突變型的擴增。表2引物序列特征表seqidno.primersequences(5’-3’)1ugt1a1-f1cgtgacacagtcaaacattaactt2ugt1a1-r1cagccagtggctgccatccac3ugt1a1-f2tcgttgtacatcagagacggag4ugt1a1-r2acagccagacaaaagcatag5肽核酸t(yī)cagagacggag陽性對照液中的6ta質(zhì)粒溶液是以臨床樣本dna為模板，以ugt1a1-f1和ugt1a1-r1為引物，先進行pcr擴增，所得的pcr產(chǎn)物進行測序，在測序結(jié)果中挑選出對應(yīng)6ta核苷酸序列的pcr產(chǎn)物，將該pcr產(chǎn)物片段連接入質(zhì)粒，最終配制為0.001ng/μl的質(zhì)粒溶液。陽性對照液中的7ta質(zhì)粒溶液是以臨床樣本dna為模板，以ugt1a1-f1和ugt1a1-r1為引物，先進行pcr擴增，所得的pcr產(chǎn)物進行測序，在測序結(jié)果中挑選出對應(yīng)7ta核苷酸序列的pcr產(chǎn)物，將該pcr產(chǎn)物片段連接入質(zhì)粒，最終配制為0.001ng/μl的質(zhì)粒溶液。陽性對照液中的211a質(zhì)粒溶液是以臨床樣本dna為模板，以ugt1a1-f2和ugt1a1-r2為引物，先進行pcr擴增，所得的pcr產(chǎn)物進行測序，在測序結(jié)果中挑選出對應(yīng)211a核苷酸序列的pcr產(chǎn)物，將該pcr產(chǎn)物片段連接入質(zhì)粒，最終配制為0.001ng/μl的質(zhì)粒溶液。引入質(zhì)粒的211a、6ta核苷酸序列和7ta核苷酸序列如表3所示。表3質(zhì)粒序列表二、試劑盒的使用方法。本實施例的ugt1a1基因多態(tài)性檢測試劑盒的具體檢測步驟如下：1、樣本準(zhǔn)備。樣本dna提?。翰捎迷噭┖?axygenmultisourcegenomicdnaminiprepkit)提取樣本，樣本為從新鮮血樣中提取的人類基因組dna。具體的操作參見試劑盒產(chǎn)品說明書。質(zhì)量控制：獲得樣本dna后，通過測定濃度和od260/od280的比值控制樣本質(zhì)量，最終加入反應(yīng)體系中的樣本，od260/od280的比值在1.8～2.0之間的可獲得最優(yōu)反應(yīng)結(jié)果。推薦濃度：待測樣本的dna推薦濃度為10～50ng/μl。推薦濃度是根據(jù)不同濃度梯度實驗驗證的，使用本發(fā)明的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，可以得到有效實驗結(jié)果的模板濃度的范圍。2、試劑準(zhǔn)備。1)取出引物混合液和pcr反應(yīng)液的試管，室溫融化并振蕩混勻后，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心10s。2)配制各管pcr反應(yīng)體系(反應(yīng)體系的總體積為20μl)：將14μl的引物混合液與4μl的pcr反應(yīng)液混合，然后加入到各個pcr反應(yīng)管中。3、加樣。分別將提取的待測樣本的基因組dna、陰性對照液和陽性對照液加入到各個pcr反應(yīng)管中，加入量為2μl/管。4、pcr擴增。各反應(yīng)體系采用bioertc-xp-d型pcr儀，以及貝克曼公司的gexp遺傳分析系統(tǒng)進行實時熒光pcr反應(yīng)，最優(yōu)反應(yīng)程序如表4所示。表4pcr反應(yīng)程序表隨著退火溫度的升高，引物特異性提高，但是pcr產(chǎn)物量下降，通過對退火溫度梯度的優(yōu)化，確定反應(yīng)程序的最佳退火溫度為57℃和60℃。5、毛細(xì)管電泳。配制上樣緩沖液：在各上樣孔中加入24.7μl的sampleloadingsolution(beckman公司，貨號：m308002)和0.3μldnasizestandardkit-400basepairs(beckman公司，貨號：m308296)。再分別將1μl的pcr產(chǎn)物加入其中，滴入一滴礦物質(zhì)油，然后在貝克曼公司的gexp遺傳分析系統(tǒng)上分別進行毛細(xì)管電泳。6、結(jié)果分析。gexp遺傳分析系統(tǒng)自動進行數(shù)據(jù)分析。三、試劑盒的檢測結(jié)果判定。1、試劑盒有效性判定：同時滿足下列條件，才可進行結(jié)果判定：1)陰性對照：在180～220bp之間未檢測到熒光信號。2)陽性對照：在189bp、215bp和217bp處各檢測到一個熒光信號，三個熒光信號值等于或高于dnasizestandardkit-400basepairs熒光信號，且最大熒光信號與最小熒光信號的比值≤3。2.樣本有效性判定：在180bp和220bp之間：1)若檢測樣本的熒光信號值至少有一個高于150000，則樣本加入過量，建議對pcr產(chǎn)物進行適當(dāng)稀釋后再進行毛細(xì)管電泳檢測。2)若檢測樣本的熒光信號值至少有一個低于dnasizestandardkit-400basepairs熒光信號，則樣本加入量較低，可適當(dāng)增加pcr產(chǎn)物加入量或增加pcr循環(huán)數(shù)；若仍不行，需重新制備樣本。3.結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：3.1ugt1a1*28結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)在210bp和220bp之間：1)樣本檢測到一個215bp熒光信號，則為6ta野生型。2)樣本檢測到一個217bp熒光信號，則為7ta突變型。3)樣本檢測到215bp和217bp兩個熒光信號，若兩個熒光信號值的比值≤3，則為6/7ta雜合突變型；若215bp熒光信號值與217bp熒光信號值的比值>3，則為6ta野生型；若217bp熒光信號值與215bp熒光信號值的比值>3，則為7ta純合突變型。3.2ugt1a1*6結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)在180bp和200bp之間：1)樣本檢測到一個189bp熒光信號，且熒光信號值不低于dnasizestandardkit-400basepairs熒光信號，則為g211a純合突變型或者g211a雜合突變型。2)在樣本檢測不到一個189bp熒光信號，或者熒光信號值低于dnasizestandardkit-400basepairs熒光信號，則該樣本未發(fā)生ugt1a1*6(g211a)突變。四、試劑盒的特性。1、最低檢測限：以104拷貝/反應(yīng)的陽性質(zhì)控品，檢測試劑盒，陽性檢出率≥98％。2、特異性：對至少5例陰性參考品進行檢測，測試結(jié)果100％為陰性。3、準(zhǔn)確度：對至少5例陽性參考品進行檢測，測試結(jié)果100％為陽性。4、精密度：1)批內(nèi)精密度：以同一批試劑盒重復(fù)檢測同一陽性樣本5次，檢測結(jié)果全部為陽性。2)批間精密度：3個不同批次的試劑盒檢測同一陽性樣本3次，檢測結(jié)果全部為陽性。5、穩(wěn)定性及運輸：本實施例的ugt1a1基因多態(tài)性檢測試劑盒根據(jù)穩(wěn)定性實驗，確定本試劑盒應(yīng)保存于-15℃～-35℃(引物混合液應(yīng)避光保存)，避免反復(fù)凍融。運輸時應(yīng)防高溫和日曬，試劑盒應(yīng)冷藏運輸。試劑盒有效期為6個月。本發(fā)明檢測基因型為ugt1a1*28和ugt1a1*6野生純合的患者，伊立替康的毒副反應(yīng)較弱；檢測基因型為ugt1a1突變型(包括ugt1a1單位點突變型和ugt1a1雙位點突變型)的患者，伊立替康的毒副反應(yīng)風(fēng)險較高。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。sequencelisting<110>上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司<120>ugt1a1基因多態(tài)性檢測引物肽核酸及其試劑盒<130>無<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>24<212>dna<213>人工合成<400>1cgtgacacagtcaaacattaactt24<210>2<211>21<212>dna<213>人工合成<400>2cagccagtggctgccatccac21<210>3<211>22<212>dna<213>人工合成<400>3tcgttgtacatcagagacggag22<210>4<211>20<212>dna<213>人工合成<400>4acagccagacaaaagcatag20<210>5<211>12<212>dna<213>人工合成<400>5tcagagacggag12<210>6<211>215<212>dna<213>人工合成<400>6cgtgacacagtcaaacattaacttggtgtatcgattggtttttgccatatatatatatat60aagtaggagagggcgaacctctggcaggagcaaaggcgccatggctgtggagtcccaggg120cggacgcccacttgtcctgggcctgctgctgtgtgtgctgggcccagtggtgtcccatgc180tgggaagatactgttgatcccagtggatggcagcc215<210>7<211>217<212>dna<213>人工合成<400>7cgtgacacagtcaaacattaacttggtgtatcgattggtttttgccatatatatatatat60ataagtaggagagggcgaacctctggcaggagcaaaggcgccatggctgtggagtcccag120ggcggacgcccacttgtcctgggcctgctgctgtgtgtgctgggcccagtggtgtcccat180gctgggaagatactgttgatcccagtggatggcagcc217<210>8<211>189<212>dna<213>人工合成<400>8tcgttgtacatcagagacggagcattttacaccttgaagacgtaccctgtgccattccaa60agggaggatgtgaaagagtcttttgttagtctcgggcataatgtttttgagaatgattct120ttcctgcagcgtgtgatcaaaacatacaagaaaataaaaaaggactctgctatgcttttg180tctggctgt189當(dāng)前第1頁12