本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種水稻胚乳粉質(zhì)相關(guān)基因osmtssb及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著生活水平的提高，人們對(duì)稻米品質(zhì)也提出了越來越高的要求，而改善品質(zhì)也是提高我國稻米國際競爭力的必要手段。但是目前在我國水稻生產(chǎn)中，稻米品質(zhì)不高，因此提高品質(zhì)是當(dāng)前一項(xiàng)十分重要的工作。

水稻種子在成熟過程中積累大量的淀粉，為種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育提供主要的能量，同時(shí)這些數(shù)量可觀的淀粉也成為人類重要的食物來源。水稻種子中淀粉積累的多少往往決定了種子的大小和重量，因此和水稻的產(chǎn)量直接相關(guān)，同時(shí)種子中直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例直接影響著稻米的食味品質(zhì)，因此研究稻米中淀粉的合成過程具有重要的應(yīng)用價(jià)值，開展其發(fā)育和遺傳控制機(jī)理的深入研究，對(duì)改良稻米品質(zhì)和提高產(chǎn)量有重要的意義。

盡管許多參與淀粉合成過程的酶和調(diào)控因子已經(jīng)被鑒定出來，但是人類尚不能利用體外系統(tǒng)合成淀粉，這說明植物中淀粉的合成是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，新的參與淀粉合成的關(guān)鍵因子仍然需要進(jìn)一步鑒定。

水稻淀粉突變體包括糯性(waxy,wx)、糖質(zhì)(sugary,su)、粉質(zhì)(floury,flo)、皺縮(shrunken,sh)、暗色(dull,du)、心白(white-core,wc)等類型。在水稻中，篩選胚乳異常突變體(粉質(zhì)胚乳)是尋找新的淀粉合成關(guān)鍵因子的重要方法。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方法與技術(shù)的快速發(fā)展，多位研究者對(duì)水稻粉質(zhì)胚乳性狀進(jìn)行了基因定位研究。迄今為止，已經(jīng)有一些水稻粉質(zhì)基因被精細(xì)定位和克隆，但是水稻淀粉合成的調(diào)控機(jī)制還不清楚，這就需要我們定位和克隆更多的淀粉合成基因來進(jìn)一步揭示水稻淀粉合成的機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的還提供一種水稻胚乳淀粉合成相關(guān)基因osmtssb編碼的蛋白序列，其氨基酸序列如seqidno.3所示，含有206氨基酸。

本發(fā)明的另一目的是提供一種水稻胚乳淀粉合成相關(guān)基因osmtssb的核苷酸序列。

所述基因osmtssb優(yōu)選為如下1)或2)或3)所述的dna分子：

1)seqidno.1所示的dna分子；

2)seqidno.2所示的dna分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的dna序列雜交且編碼所述蛋白的dna分子；

4)與1)或2)或3)限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼植物淀粉合成相關(guān)蛋白的dna分子。

含有以上任一所述基因的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。

所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。

使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。

為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的報(bào)告基因(gus基因、螢光素酶luc基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

所述重組過表達(dá)載體可為在用限制性內(nèi)切酶kpni和bamhi雙酶切載體pcambia1390的重組位點(diǎn)插入所述基因(osmtssb)得到的重組質(zhì)粒。將含有osmtssb的pcambia1390命名為pcambia1390-osmtssb。

含有以上任一所述基因(osmtssb)的表達(dá)盒及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

擴(kuò)增所述基因(osmtssb)全長或任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述的引物對(duì)優(yōu)選primer1/primer2、primer3/primer4；其中primer1的核苷酸序列如seqidno.4所示，primer2的核苷酸序列如seqidno.5所示，primer3的核苷酸序列如seqidno.6所示，primer4的核苷酸序列如seqidno.7所示。

在精細(xì)定位此基因過程中涉及到的定位引物(見表1)，indel引物為本實(shí)驗(yàn)需要而自行設(shè)計(jì)的引物，這些自行設(shè)計(jì)的引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

有益效果

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)、定位并克隆得到一個(gè)新的植物胚乳粉質(zhì)相關(guān)蛋白的基因osmtssb。本發(fā)明的植物胚乳粉質(zhì)相關(guān)蛋白影響植物的淀粉合成過程。抑制該蛋白編碼基因的表達(dá)可導(dǎo)致植物種子中淀粉合成的障礙，從而可以培育胚乳變異的轉(zhuǎn)基因植物和植物淀粉含量降低的轉(zhuǎn)基因植物。將所述蛋白的編碼基因?qū)氲矸酆拷档偷闹参镏?，可以培育淀粉含量正常的植物。所述蛋白及其編碼基因可以應(yīng)用于植物遺傳改良。

附圖說明

圖1為野生型n22與突變體n68的淀粉含量測(cè)定。

圖2為野生型n22與突變體n68的籽粒外型。

圖3為野生型n22與突變體n68籽粒掃描電鏡觀察。

圖4為突變基因在第5染色體上的精細(xì)定位。

圖5為轉(zhuǎn)pcambia1390-osmtssb的t0代植株的t1籽粒表型。

圖6為轉(zhuǎn)pcambia1390-osmtssb的t0代植株的t1籽粒掃描電鏡觀察。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。

實(shí)施例1、水稻淀粉合成相關(guān)位點(diǎn)及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)

一、水稻胚乳粉質(zhì)突變體n68的淀粉含量分布分析及遺傳分析

在利用mnu化學(xué)誘變產(chǎn)生的n22突變體中，篩選出一個(gè)胚乳粉質(zhì)突變體，命名為n68。與n22比較，n68的主要特征是：種子中淀粉含量下降(圖1)，同時(shí)具有種子不透明的表型(圖2)。圖2顯示n22具有半透明的胚乳，n68胚乳是不透明的。這說明基因突變影響了淀粉的合成，導(dǎo)致淀粉粒的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生了變化，使胚乳在表觀上表現(xiàn)出巨大的差異。

對(duì)野生型和突變體n68種子的橫截面進(jìn)行了掃描電鏡觀察(見圖3)，從放大200倍的照片上，野生型種子的橫截面的淀粉片層結(jié)構(gòu)比較規(guī)則整齊，而突變體比較松散。由此可以推斷，這些淀粉粒結(jié)構(gòu)和排布的改變可能導(dǎo)致中胚乳呈現(xiàn)粉質(zhì)的表型。

二、突變基因位點(diǎn)的圖位克隆

1、突變基因的定位

首先，配制了突變體和正常粳稻品種nipponbare的雜交組合，f1自交一代后獲得了f2種子。將f2種子去殼，以表型透明和不透明為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，調(diào)查分離比例，結(jié)果顯示，在f2分離群體中(共計(jì)1235個(gè)f2個(gè)體)，具有野生型表型個(gè)體(933個(gè))和突變體表型個(gè)體(302個(gè))，符合3:1的分離比例(χ²＝0.1687<χ²0.05,1＝3.84)。由此可見，該突變由一對(duì)隱性基因控制。

然后用10株極端個(gè)體進(jìn)行連鎖，將目的基因確定在水稻第5染色體上，利用實(shí)驗(yàn)室的公用引物，增加極端個(gè)體數(shù)量至130株，縮小定位區(qū)段至570kb內(nèi)，完成初定位。

挑選與突變體表型一致的f2種子發(fā)苗，獲得1013株隱性極端個(gè)體的葉片，利用公用引物與自己設(shè)計(jì)的引物，最終將目的基因確定在標(biāo)記199-2和h199-1之間，區(qū)段大小86kb(圖4)。

上述ssr標(biāo)記分析的方法如下所述：

(1)提取上述選取單株的總dna作為模板，具體方法如下：

①取0.2g左右的水稻幼嫩葉片，置于2.0mleppendorf管中，管中放置一粒鋼珠，把裝好樣品的eppendorf管在液氮中冷凍5min，置于2000型geno/grinder儀器上粉碎樣品1min。

②加入660μl提取液(含100mmtris-hcl(ph8.0)，20mmedta(ph8.0)，1.4mnacl,0.2g/mlctab的溶液)，漩渦器上劇烈渦旋混勻，冰浴30min。

③加入40μl20％sds，65℃溫浴10min，每隔兩分鐘輕輕上下顛倒混勻。

④加入100μl5mnacl，溫和混勻。

⑤加入100μl10×ctab，65℃溫浴10min，間斷輕輕上下顛倒混勻。

⑥加入900μl氯仿，充分混勻，12000rpm離心3min。

⑦轉(zhuǎn)移上清液至1.5mleppendorf管中，加入600μl異丙醇，混勻，12000rpm離心5min。

⑧棄上清液，沉淀用70％(v/v)乙醇漂洗一次，室溫涼干。

⑨加入100μl1×te(121gtris溶于1升水中，用鹽酸調(diào)ph值至8.0)溶解dna。

⑩取2μl電泳檢測(cè)dna質(zhì)量，并用du800分光光度儀測(cè)定濃度(beckmaninstrumentinc.u.s.a)。

(2)將上述提取的dna稀釋成約20ng/μl，作為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

pcr反應(yīng)體系(10μl)：dna(20ng/μl)1μl，上游引物(2pmol/μl)1μl，下游引物(2pmol/μl)1μl，10×buffer(mgcl2free)1μl，dntp(10mm)0.2μl，mgcl2(25mm)0.6μl，rtaq(5u/μl)0.1μl，ddh2o5.1μl，共10μl。

pcr反應(yīng)程序：94.0℃變性5min；94.0℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循環(huán)35次；72℃延伸7min；10℃保存。pcr反應(yīng)在mjresearchptc-225熱循環(huán)儀中進(jìn)行。

(3)ssr標(biāo)記的pcr產(chǎn)物檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。以50bp的dnaladder為對(duì)照比較擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小，銀染顯色。

上述引物開發(fā)過程如下：

(1)ssr標(biāo)記開發(fā)

將公共圖譜的ssr標(biāo)記與水稻基因組序列進(jìn)行整合，下載突變位點(diǎn)附近的bac/pac克隆序列。用ssrhunter(李強(qiáng)等，遺傳，2005，27(5):808-810)或ssrit在線軟件(http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool/)搜索克隆中潛在的ssr序列(重復(fù)次數(shù)≥6)；將這些ssr及其鄰近400～500bp的序列在ncbi通過blast程序在線與相應(yīng)的秈稻序列進(jìn)行比較，如果兩者的ssr重復(fù)次數(shù)有差異，初步推斷該ssr引物的pcr產(chǎn)物在秈、粳間存在多態(tài)性；再利用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)ssr引物，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。將自行設(shè)計(jì)的ssr成對(duì)引物等比例混合，檢測(cè)其在n22和nipponbare之間的多態(tài)性，表現(xiàn)多態(tài)者用作精細(xì)定位的分子標(biāo)記。用于精細(xì)定位的分子標(biāo)記見表1。

表1用于精細(xì)定位的分子標(biāo)記

2、粉質(zhì)基因的獲得

經(jīng)過對(duì)86kb區(qū)間內(nèi)的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了mtssb基因存在一個(gè)單堿基的突變，

根據(jù)網(wǎng)上公布的序列設(shè)計(jì)引物，序列如下所述：

primer1：5'aacgccgccagccgcctc3'(seqidno.4)；

primer2：5'tttgagaggccagcatcat3'(seqidno.5)。

以primer1和primer2為引物，以n22的發(fā)育中胚乳cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得目的基因。擴(kuò)增反應(yīng)在ptc-200(mjresearchinc.)pcr儀上進(jìn)行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃10min，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。將pcr產(chǎn)物回收純化后連接到pmd18-t(takara)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞(北京tiangen公司cb101)，挑選陽性克隆后，進(jìn)行測(cè)序。

序列測(cè)定結(jié)果表明，pcr反應(yīng)獲得的片段具有seqidno.2所示的核苷酸序列，編碼206個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(見序列表的seqidno.3)。將seqidno.3所示的蛋白命名為osmtssb，將seqidno.3所示的蛋白的編碼基因命名osmtssb。

實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定

一、重組表達(dá)載體構(gòu)建

以n22(來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所種質(zhì)資源庫)的基因組dna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得osmtssb基因，pcr引物序列如下：

primer3：

5'tgggcccggcgcgccaagcttaccatgttgccaaatgcc3'(seqidno.6)；

primer4：

5'gaattcccggggatccctagaacaatccttctcct3'(seqidno.7)。

上述引物分別位于seqidno.2所示基因的上游2kb和下游1.5kb，擴(kuò)增產(chǎn)物包含了該基因的啟動(dòng)子部分，將pcr產(chǎn)物回收純化。采用infusion重組試劑盒(takara)將pcr產(chǎn)物克隆到載體pcambia1390中。infusion重組反應(yīng)體系(10μl)：pcr產(chǎn)物1.0μl，pcambia13056.0μl，5×infusionbuffer2.0μl，infusionenzymemix1μl。短暫離心后將混合體系37℃水浴15分鐘，而后50℃水浴15分鐘，取2.5μl反應(yīng)體系用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞(北京tiangen公司；cb101)。將全部轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂布在含50mg/l卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)16h后，挑取克隆陽性克隆，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，得到了含有seqidno.1所示基因的重組表達(dá)載體，將含有osmtssb的pcambia1390命名為pcambia1390-osmtssb，osmtssb基因片段利用infusion重組試劑盒(takara)插入到該載體的hindiii和bamhi酶切位點(diǎn)之間。。

二、重組農(nóng)桿菌的獲得

用電擊法將pcambia1390-osmtssb轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105菌株(購自美國英俊公司)，得到重組菌株，提取質(zhì)粒進(jìn)行pcr及酶切鑒定。將pcr及酶切鑒定正確的重組菌株命名為eh-pcambia1305-osmtssb。

用pcambia1390作為對(duì)照載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105菌株，方法同上，得到轉(zhuǎn)空載體對(duì)照菌株。

三、轉(zhuǎn)基因植物的獲得

分別將eh-pcambia1390-osmtssb和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照菌株轉(zhuǎn)化水稻成熟谷蛋白含量降低突變體n68，具體方法為：

(1)28℃培養(yǎng)eh-pcambia1390-osmtssb(或轉(zhuǎn)空載體對(duì)照菌株)16小時(shí)，收集菌體，并稀釋到n6液體培養(yǎng)基(sigma公司，c1416)中至濃度為od600≈0.5，獲得菌液；

(2)將培養(yǎng)至一個(gè)月的n68水稻成熟胚胚性愈傷組織與步驟(1)的菌液混合侵染30min，濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(n6固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基，sigma公司)中，24℃共培養(yǎng)3天；

(3)將步驟(2)的愈傷接種在含有100mg/l潮霉素的n6固體篩選培養(yǎng)基上第一次篩選(16天)；

(4)挑取健康愈傷轉(zhuǎn)入含有100mg/l潮霉素的n6固體篩選培養(yǎng)基上第二次篩選，每15天繼代一次；

(5)挑取健康愈傷轉(zhuǎn)入含有50mg/l潮霉素的n6固體篩選培養(yǎng)基上第三次篩選，每15天繼代一次；

(6)挑取抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上分化，得到分化成苗的t0代陽性植株。

四、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

1、pcr分子鑒定

本研究中利用潮霉素標(biāo)記鑒定轉(zhuǎn)基因植株。

標(biāo)記分析的pcr反應(yīng)體系：dna(20ng/μl)2μl，primer3(10pmol/μl)2μl，primer4(10pmol/μl)2μl，10×buffer(mgcl2free)2μl，dntp(10mm)0.4μl，mgcl2(25mm)1.2μl，rtaq(5u/μl)0.4μl，ddh2o10μl，總體積20μl。

擴(kuò)增反應(yīng)在ptc-200(mjresearchinc.)pcr儀上進(jìn)行：94℃3min；94℃30sec，55℃(引物不同，有所調(diào)整)45sec，72℃2.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。

pcr產(chǎn)物純化回收，按試劑盒(北京tiangen公司)步驟進(jìn)行。用8％的非變性page膠分離，銀染。確定轉(zhuǎn)基因陽性植株。

2、表型鑒定

分別將t0代轉(zhuǎn)pcambia1390-osmtssb陽性植株、t0代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株、突變體n68和n22種植在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋水稻育種基地轉(zhuǎn)基因田內(nèi)。種子成熟后，收取各材料種子，觀察到pcambia1390-osmtssb植株的種子中出現(xiàn)了透明的種子(圖5)，進(jìn)一步的掃描電鏡分析顯示，轉(zhuǎn)入pcambia1390-osmtssb的n68種子的淀粉顆粒形態(tài)恢復(fù)至正常水平(圖6)。因此證明n68中的突變表型是由osmtssb的突變?cè)斐傻摹cambia1390-osmtssb可以使n68株系的淀粉合成恢復(fù)至正常水平。

<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種水稻胚乳粉質(zhì)基因osmtssb及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用

<160>7

<210>1

<211>4758

<212>dna

<213>稻屬水稻（oryzasativavar.n22）

<220>

<223>胚乳粉質(zhì)基因osmtssb的基因序列

<400>1

ataactcaaccttttgatctcgctacgaagctcctccgctccacccaggcacgagcgccg60

ccgcggccgactccaccggacaccacccaacgccgccagccgcctcctcccatcctccct120

cgatccgtacggatagcctccccgctcgctcggtctgcgcccgtcgtcgtcgtcccgccg180

tcttatccctcccgcgactcggcgacgcgcgaaggcctccggcgcggggctgaaggtacg240

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ggctgggtctgccactgttctatggggtatgcaactgttgtcgacgtcgcgtgaagcccc360

tgaatggccagtgtgcgatgcttgcaaggtgtttgttaaaatgtctcggtagaatatctt420

ggaccgtttgcatattttatccatgcaaagtttagtccagtaggctgttaatttttctgt480

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agagcagcttccttgtcttggccggatgtcgtccctgaggttccaacggaatggagctgc660

tgtagctgaataagaccataagttgtttttgtgcaggaaagaataagcagaactgtcatg720

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<210>2

<211>621

<212>dna

<213>稻屬水稻（oryzasativavar.n22）

<220>

<223>胚乳粉質(zhì)基因osmtssb的cds序列

<400>2

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<210>3

<211>513

<212>prt

<213>稻屬水稻（oryzasativavar.n22）

<220>

<223>胚乳粉質(zhì)基因osmtssb氨基酸序列

<400>3

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151015

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180185190

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195200205

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer1

<400>4

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<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer2

<400>5

tttgagaggccagcatcat18

<210>6

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer3

<400>6

tgggcccggcgcgccaagcttaccatgttgccaaatgcc39

<210>7

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer4

<400>7

gaattcccggggatccctagaacaatccttctcct35