本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種檢測人或者大鼠肝微粒體中五種UGT酶活性的cocktail方法。

背景技術：

尿苷二磷酸葡醛酸轉移酶(UGT)是主要的二相代謝酶(包括尿苷二磷酸葡醛酸轉移酶、N－乙?；D移酶、甲基轉移酶、谷胱甘肽轉移酶、轉硫酶等)，主要位于肝臟中滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其主要功能是將葡萄糖醛酸基結合到底物上，使其極性增大，易于排出體外，從而達到代謝解毒的作用。UGT酶不僅在藥物代謝中扮演著重要的角色，可代謝35％的藥物(經(jīng)過二相代謝)，還在代謝內(nèi)源性物質(zhì)，如膽汁酸、膽紅素、類固醇激素等方面發(fā)揮著至關重要的作用。當UGT酶活性發(fā)生改變，如被抑制時，其代謝轉化外源性物質(zhì)和內(nèi)源性物質(zhì)的能力下降，容易引起藥物間的相互作用，甚至產(chǎn)生嚴重的中毒反應或代謝性紊亂。

所有的UGT酶都含有由29個氨基酸組成的保守的特征序列，有報道稱其與UDP糖的結合相關，UGT酶催化反應的實質(zhì)是將核苷酸糖上的糖基轉移到親脂性的底物上。人類UGT酶可以分為UGT1，UGT2，UGT3和UGT8共4個基因家族，分別位于人類染色體2q37，4q13，5p13.2，4q26上，其中UGT1和UGT2是最重要的藥物代謝酶家族，主要功能是將尿苷二磷酸葡萄糖醛酸作為糖基供體結合到底物上。UGT1家族主要有UGT1A1，UGT1A3，UGT1A4，UGT1A5，UGT1A6，UGT1A7，UGT1A8，UGT1A9和UGT1A10；UGT2家族可以分為UGT2A和UGT2B，其中UGT2A包括UGT2A1，UGT2A2和UGT2A3；UGT2B包括UGT2B4，UGT2B7，UGT2B10，UGT2B11，UGT2B15，UGT2B17，UGT2B28；UGT3家族主要在胸腺、睪丸和腎臟中表達，在肝臟中幾乎檢測不到表達。UGT8A1是UDP半乳糖神經(jīng)酰胺半乳糖轉移酶，即主要利用尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖為供體糖原。UGT1和UGT2家族中UGT1A1，UGT1A3，UGT1A6，UGT1A9和UGT2B7為參與藥物代謝的最重要的幾種亞型，而UGT3和UGT8均很少參與藥物或者其他外源性物質(zhì)的代謝和解毒。另外UGT1A2p,UGT1A11p,UGT1A1p2和UGT1A13p為假基因，不表達功能性蛋白。

大鼠作為人類同源性較高的動物模型，經(jīng)常被用在臨床前的實驗研究中。目前為止，在大鼠中采用cocktail方法檢測UGT酶的活性還未見報道。在大鼠中，功能性的UGT可以分為Ugt1a，Ugt2a，Ugt2b幾個亞家族，具體包括Ugt1a1，Ugt1a2，Ugt1a3，Ugt1a5，Ugt1a6，Ugt1a7，Ugt1a8，Ugt1a10，Ugt2a1，Ugt2a2，Ugt2a3，Ugt2b1，Ugt2b2，Ugt2b3，Ugt2b6，Ugt2b8，Ugt2b12，Ugt2b34和Ugt2b47，其中Ugt1a4，Ugt1a9為假基因。另外，在大鼠肝微粒體中，Ugt1a9雖然被報道為假基因，但是其仍可以催化底物丙泊酚葡萄糖醛酸化，只是其催化活性要遠低于人肝微粒體中UGT1A9。由于在大鼠肝微粒體中，丙泊酚葡萄糖醛酸化的動力學分析顯示為雙相模型，所以可能有超過一個亞型酶參與其代謝，即除了Ugt1a9以外，還有其他亞型酶參與了代謝。在大鼠肝微粒體中，盡管沒有發(fā)現(xiàn)與人UGT2B7相對應的亞型，但是以齊多夫定作為底物，發(fā)現(xiàn)其可以被葡萄糖醛酸化，但是活性遠低于人的UGT2B7酶的活性，一般用3'-疊氮基-3'-脫氧胸苷葡萄糖醛酸化(3'-azido-3'-deoxythymidine glucuronidation，AZTG)表示其反應。人類和大鼠的UGT酶分類和功能存在差別，因此在使用大鼠進行實驗時需要注意區(qū)別。

“Cocktail”方法是近年來興起的一種高通量快速檢測化合物的方法，其概念可追溯到1990年由Breimer等人提出?！癈ocktail”探針藥物法，是指同時將多種相對低劑量的探針藥物(底物)進行共同孵育，測定樣本中每個探針藥物的代謝率，被廣泛應用于藥物對細胞色素P450酶活性影響評估、藥物代謝途徑確認、藥物-藥物相互作用預測等諸多研究方向。傳統(tǒng)的單一探針藥物研究方法，單次實驗只能反映一種酶的活性，很難滿足現(xiàn)代研究快速、準確、方便和經(jīng)濟的要求?！癈ocktail”探針藥物法具有同時測定多種同工酶活性的優(yōu)勢，使得多個酶的活性變化可通過單次實驗獲得，并將有效減小試驗數(shù)據(jù)的波動，此方法可以快速、高效、全面的評價藥物對多種酶活性影響以及藥物的體內(nèi)代謝情況。關于一相代謝酶CYP的cocktail方法已經(jīng)有許多研究，是目前比較常用的快速研究CYP酶活性的方法。二相代謝酶UGT亞型比較繁多，每個亞型單獨研究效率低下，因此本發(fā)明提出采用cocktail方法同時檢測UGT多種主要的亞型(UGT1A1，UGT1A3，UGT1A6，UGT1A9，UGT2B7)的酶活，綜合考慮化合物對多種UGT酶活性的影響。同時輔助以LC-MS/MS方法高效、快速、靈敏的優(yōu)點，同時檢測多個底物及其代謝物，有助于快速、大量篩選對UGT酶活性有抑制作用的化合物。

Cocktail方法中底物之間的相互作用是影響實驗準確性的重要影響因素，因此選擇合適的底物，如何組合底物及確定合適的底物濃度至關重要。由于UGT酶許多亞型之間的氨基酸同源性很高，催化的底物具有廣泛的交叉性，因而本發(fā)明在選擇專一性高的底物基礎上，充分考察了底物之間相互作用，發(fā)現(xiàn)了合適的底物組合及其濃度，首次建立了在大鼠中檢測五種UGT酶活的cocktail方法。此外，文獻報道的人肝微粒體中UGT酶活檢測的cocktail方法存在明顯缺陷，不同亞型酶之間相互作用影響明顯例如UGT1A3，并且陽性抑制劑在cocktail方法中抑制程度和單獨孵育時存在較大差距，因此本發(fā)明對人肝微粒體中cocktail方法進行了完善和優(yōu)化，顯著降低了底物相互影響的程度。本發(fā)明建立了大鼠和人肝微粒體中五種UGT酶底物的cocktail方法，可用于快速篩選對UGT酶活性有影響的化合物，可以幫助研究大鼠和人中各種UGT酶的功能。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、高效、方便和經(jīng)濟的測定UGT酶活性的cocktail方法，可用于檢測大鼠和人肝微粒體中五種UGT亞型酶(UGT1A1/Ugt1a1，UGT1A3/Ugt1a3，UGT1A6/Ugt1a6，UGT1A9/Ugt1a9和UGT2B7/AZTG)的活性。

本發(fā)明提供了一種測定UGT酶活性的cocktail方法，包括：在含有Tris-HCl和氯化鎂的孵育體系中，加入UGT酶、UDPGA和UGT酶的底物，在35-40℃下反應60-90分鐘，液相色譜法測定UGT酶的活性。

其中，所述UGT酶為人肝微粒體中UGT酶或大鼠肝微粒體中UGT酶；所述UGT酶包括UGT1A1/Ugt1a1、UGT1A3/Ugt1a3、UGT1A6/Ugt1a6、UGT1A9/Ugt1a9、UGT2B7/AZTG。即，當所述UGT酶為人UGT酶時，所述UGT酶包括UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7中的一種或多種；當所述UGT酶為大鼠UGT酶時，所述UGT酶包括Ugt1a1、Ugt1a3、Ugt1a6、Ugt1a9、AZTG中的一種或多種。

其中，所述UGT酶的底物包括雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚、齊多夫定中的一種或多種。即，UGT1A1/Ugt1a1的底物為雌二醇，UGT1A3/Ugt1a3的底物為鵝去氧膽酸，UGT1A6/Ugt1a6的底物為血清素，UGT1A9/Ugt1a9的底物為丙泊酚，UGT2B7/AZTG的底物為齊多夫定。

其中，所采用的底物與所要測定的UGT酶一一對應，即當所要測定的UGT酶中不包含某一亞型時，所采用的底物中相應地不包含該所述亞型的UGT酶的底物。例如，當所要測定的UGT酶中不包含UGT1A1/Ugt1a1時，所采用的底物中相應地不包含雌二醇。

其中，所述孵育體系由Tris-HCl和氯化鎂組成，其中，所述孵育體系的pH值為7-8；優(yōu)選地為7.4或7.5。

優(yōu)選地，所述孵育的溫度為37℃。

優(yōu)選地，所述孵育的時間為60分鐘(人肝微粒體中)或90分鐘(大鼠肝微粒體中)。

優(yōu)選地，將包含雌二醇和血清素的組合一單獨和UGT酶孵育，將包含鵝去氧膽酸、丙泊酚和齊多夫定的組合二單獨和UGT酶孵育，反應終止后，利用LC-MS/MS對UGT酶代謝物進行測定。

優(yōu)選地，加入UGT酶后，可進行預孵育，預孵育的時間可選5min。

其中，所述UDPGA是指uridine diphosphate glucuronic acid(尿苷二磷酸葡萄糖醛酸)，可選濃度為5mM；反應過程中，所述UDPGA用于啟動反應，具體作用為提供葡萄糖醛酸基，在生物體內(nèi)，UGT酶將其結合到底物上，底物包括一些內(nèi)源性物質(zhì)和一些藥物、環(huán)境污染物等外源性物質(zhì)，形成水溶性比較高的結合物，有利于系統(tǒng)循環(huán)物質(zhì)的清除代謝。

優(yōu)選地，可加入終止劑終止反應。所述終止劑為含有內(nèi)標的冰乙腈、冰甲醇、高氯酸等，其中，所述內(nèi)標包括100ng/ml的茶堿和100ng/ml的氯磺丙脲(反應體系的終濃度)；優(yōu)選地，為含有內(nèi)標的冰乙腈。

其中，當所述的UGT酶的底物包括雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚和齊多夫定時，所述UGT酶的底物范圍分別為分別為1.5-3.5μΜ、4-10μΜ、300-600μΜ、2-5μΜ、200-400μΜ(人肝微粒體中)，優(yōu)選地，為2μΜ，5μΜ，500μΜ，2μΜ，300μΜ；當所述UGT酶為大鼠UGT酶時，所述UGT酶的底物雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚、齊多夫定的摩爾濃度為1.5-4μΜ、2-5μΜ、20-50μΜ、2-5μΜ、150-300μΜ，優(yōu)選地，為2μΜ，2μΜ，20μΜ，2μΜ，200μΜ。

本發(fā)明中，測定UGT酶的方法可以采用LC-MS/MS進行測定，UGT代謝物的質(zhì)譜條件如表1所示。

表1：

本發(fā)明還提供了所述測定UGT酶活性的cocktail方法在評價化合物對UGT酶活性的影響中的應用。

本發(fā)明還提供了一種直接利用大鼠或人肝微粒體測定UGT酶活性的cocktail方法，包括以下步驟：在含有Tris-HCl和氯化鎂的孵育體系中，加入大鼠肝微粒體、丙甲菌素、UDPGA和UGT酶的底物，在35-40℃下反應60-90分鐘，測定UGT酶的活性。

其中，所述UGT酶為人UGT酶或大鼠UGT酶；所述UGT酶包括UGT1A1/Ugt1a1、UGT1A3/Ugt1a3、UGT1A6/Ugt1a6、UGT1A9/Ugt1a9、UGT2B7/AZTG。即，當所述UGT酶為人UGT酶時，所述UGT酶包括UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7中的一種或多種；當所述UGT酶為鼠UGT酶時，所述UGT酶包括Ugt1a1、Ugt1a3、Ugt1a6、Ugt1a9、AZTG中的一種或多種。

其中，所述UGT酶的底物包括雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚、齊多夫定中的一種或多種。即，UGT1A1/Ugt1a1的底物為雌二醇，UGT1A3/Ugt1a3的底物為鵝去氧膽酸，UGT1A6/Ugt1a6的底物為血清素，UGT1A9/Ugt1a9的底物為丙泊酚，UGT2B7/AZTG的底物為齊多夫定。

其中，所采用的底物與所要測定的UGT酶一一對應，即，當所要測定的UGT酶中不包含某一亞型時，所采用的底物中相應地不包含該所述亞型的UGT酶的底物。如，當所要測定的UGT酶中不包含UGT1A1/Ugt1a1時，所采用的底物中相應地不包含雌二醇。

其中，所述孵育體系由Tris-HCl和氯化鎂組成，其中，所述孵育體系的pH值為7-8；優(yōu)選地，為7.4或7.5。

優(yōu)選地，所述孵育的溫度為37℃。

優(yōu)選地，所述孵育的時間為60分鐘(人肝微粒體中)-90分鐘(大鼠肝微粒體中)。

優(yōu)選地，將包含雌二醇和血清素作為組合一單獨和UGT酶孵育，將包含鵝去氧膽酸、丙泊酚和齊多夫定作為組合二單獨和UGT酶孵育，反應終止后，對UGT酶活性進行測定。

優(yōu)選地，加入UGT酶后，可進行預孵育，預孵育的時間可選5min。

優(yōu)選地，加入UGT酶后，可加入UDPGA啟動反應。其中，所述UDPGA是指uridine diphosphate glucuronic acid(尿苷二磷酸葡萄糖醛酸)，可選濃度為4-5mM；優(yōu)選地，為5mM。

優(yōu)選地，可加入終止劑終止反應。所述終止劑為含有內(nèi)標的冰乙腈、冰甲醇、高氯酸等；優(yōu)選地，為含有內(nèi)標的冰乙腈，其中內(nèi)標包括茶堿和氯磺丙脲各100ng/ml(終濃度)。

優(yōu)選地，可加入終止劑終止反應后，徹底渦旋混勻3分鐘后，以14,000g轉速在4℃離心10分鐘，取60μl上清進行LC-MS/MS分析。

其中，當所述的UGT酶的底物包括雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚和齊多夫定時，所述UGT酶的底物范圍分別為1.5-3.5μΜ、4-10μΜ、300-600μΜ、2-5μΜ、200-400μΜ(人肝微粒體中)，優(yōu)選地，為2μΜ，5μΜ，500μΜ，2μΜ，300μΜ；當所述UGT酶為大鼠UGT酶時，所述UGT酶的底物雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚、齊多夫定的摩爾濃度為1.5-4μΜ、2-5μΜ、20-50μΜ、2-5μΜ、150-300μΜ，優(yōu)選地，為2μΜ，2μΜ，20μΜ，2μΜ，200μΜ。

當測定人肝微粒體時，所述人肝微粒體、丙甲菌素、Tris-HCl、氯化鎂、UDPGA、雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚、齊多夫定的終濃度分別為：0.2-1mg/ml，25μg/ml，50mM，5mM，4-5mM，1.5-3.5μΜ、4-10μΜ、300-600μΜ、2-5μΜ、200-400μΜ；優(yōu)選地，為0.25mg/ml、25μg/ml、50mM、5mM、5mM、2μΜ、5μΜ、500μΜ、2μΜ、300μΜ；所用終止劑和孵育體系中其它物質(zhì)的體積比為1：1，具體為100μl。

當測定大鼠肝微粒體時，所述大鼠肝微粒體中蛋白濃度為0.2-1mg/ml；優(yōu)選地為，0.5mg/ml(蛋白濃度)。

所述大鼠肝微粒體、丙甲菌素、Tris-HCl、氯化鎂、UDPGA、雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚、齊多夫定的終濃度分別為：0.2-1mg/ml(蛋白濃度)，25μg/ml，50mM，5mM，4-5mM，1.5-4μΜ，2-5μΜ，20-50μΜ，2-5μΜ，150-300μΜ；優(yōu)選地，所述大鼠肝微粒體、丙甲菌素、Tris-HCl、氯化鎂、UDPGA、雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚、齊多夫定的用量分別為0.5mg/ml(蛋白濃度)、25μg/ml、50mM、5mM、5mM、2μM、2μM：20μM、2μM、200μM。所用的終止劑和孵育體系的體積比為1：1，具體為100μl。

所述丙甲菌素的作用是促進人肝微粒體或大鼠肝微粒體中UGT酶的釋放。所述丙甲菌素可由TritonX-100替代。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述直接利用大鼠肝微粒體測定UGT酶活性的方法，包括以下步驟：由0.5mg/ml(蛋白濃度)的大鼠肝微粒體、25μg/ml的丙甲菌素、50mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM的氯化鎂以及各種酶的底物組成。先將大鼠肝微粒體、丙甲菌素、Tris-HCl、氯化鎂和各種UGT酶的底物放置冰上15min，使丙甲菌素發(fā)揮作用，將UGT酶從大鼠肝微粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上釋放出來，之后放置孵育儀上預孵育5min，再用5mM的UDPGA啟動反應，放在孵育儀上37℃反應90分鐘。用含有內(nèi)標的冰乙腈加入孵育體系中終止反應，徹底渦旋混勻3分鐘后，以14,000g轉速在4℃離心10分鐘，取60μl上清進行LC-MS/MS分析。

本發(fā)明還提供了所述直接利用大鼠肝微粒體測定UGT酶活性的方法在評價化合物對UGT酶活性的影響中的應用。

本發(fā)明還提出了一種組合物，所述組合物包括雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚、齊多夫定中的一種或多種。

本發(fā)明還提出了一種測定人肝微粒體中UGT酶的組合物，所述組合物包括含有雌二醇和血清素的組合一，以及含有鵝去氧膽酸、丙泊酚和齊多夫定的組合二；所述雌二醇、血清素的摩爾濃度分別為1.5-3.5μΜ、300-600μΜ；所述UGT酶的底物鵝去氧膽酸、丙泊酚、齊多夫定的摩爾濃度分別為4-10μΜ、2-5μΜ、200-400μΜ；優(yōu)選地，所述雌二醇、血清素的摩爾濃度分別為2μΜ、500μΜ；所述UGT酶的底物鵝去氧膽酸、丙泊酚、齊多夫定的摩爾濃度分別為5μΜ、2μΜ、300μΜ。

本發(fā)明還提出了所述測定人肝微粒體中UGT酶活性的組合物在測定人肝微粒體中UGT酶活中的應用。

本發(fā)明還提供了所述測定人肝微粒體中UGT酶活性的組合物在評價化合物對UGT酶活性的影響中的應用。

本發(fā)明還提供了所述測定人肝微粒體中UGT酶活性的組合物在篩選UGT酶的抑制劑中的應用。

其中，所述人肝微粒體中UGT酶包括UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7中的一種或多種。

本發(fā)明還提出了一種測定大鼠肝微粒體中UGT酶活性的組合物，所述組合物包括含有雌二醇和血清素的組合一，以及含有鵝去氧膽酸、丙泊酚和齊多夫定的組合二；所述雌二醇、血清素的摩爾濃度分別為1.5-4μΜ、20-50μΜ、所述UGT酶的底物鵝去氧膽酸、丙泊酚、齊多夫定的摩爾濃度分別為2-5μΜ、2-5μΜ、150-300μΜ；優(yōu)選地，所述雌二醇、血清素的摩爾濃度分別為2μΜ、20μΜ；所述UGT酶的底物鵝去氧膽酸、丙泊酚、齊多夫定的摩爾濃度分別為2μΜ、2μΜ、200μΜ。本發(fā)明還提出了所述組合物在測定大鼠肝微粒體中UGT酶活性中的應用。

本發(fā)明還提供了所述測定大鼠肝微粒體中UGT酶活性的組合物在評價化合物對UGT酶活性的影響中的應用。

本發(fā)明還提供了所述測定大鼠肝微粒體中UGT酶活性的組合物在篩選UGT酶的抑制劑中的應用。

其中，所述大鼠肝微粒體中UGT酶包括Ugt1a1、Ugt1a3、Ugt1a6、Ugt1a9、AZTG中的一種或多種。

本發(fā)明中，可根據(jù)所要測定的UGT酶的組分，相應地調(diào)整組合物中UGT酶的底物，例如，當所要測定的UGT酶中不包含UGT1A1/Ugt1a1時，所述組合物中相應地不包含雌二醇。

本發(fā)明提供了選擇專屬性很高的雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚、齊多夫定作為UGT1A1/Ugt1a1，UGT1A3/Ugt1a3，UGT1A6/Ugt1a6，UGT1A9/Ugt1a9和UGT2B7/AZTG的底物，并且提供了特定的底物濃度，如人肝微粒體中，雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚、齊多夫定濃度分別為1.5-3.5μΜ、4-10μΜ、300-600μΜ、2-5μΜ、200-400μΜ；大鼠肝微粒體中，雌二醇、鵝去氧膽酸、血清素、丙泊酚、齊多夫定濃度1.5-4μΜ、2-5μΜ、20-50μΜ、2-5μΜ、150-300μΜ。

本發(fā)明提供了底物相互作用影響程度測定方法，首先將底物單獨進行孵育，與cocktail方法比較，如將UGT1A1底物單獨孵育與cocktail(五種底物)方法孵育結果比較，即可以考察其它底物對UGT1A1酶活性的影響程度，從而判斷每種酶活性受到其它四種底物的影響大??；其次將cocktail中五種底物取出一種，如從五種底物中取出UGT1A1底物可以用cocktail-1A1表示，將剩余的4種底物孵育，然后將實驗結果與五種底物共孵育進行比較，考察UGT1A1底物對剩余四種底物的影響，從而反映UGT1A1底物對其它酶活性的影響。

本發(fā)明提供了大鼠肝微粒體中五種UGT底物的cocktail方法，將底物之間相互作用比較大的分開，相互作用小的一起孵育，即將UGT1a1，UGT1a6底物作為一個組合共同孵育，將UGT1a3，UGT1a9，AZTG底物作為一個組合(人肝微粒體中對應UGT2B7)共同孵育，以達到使底物之間相互作用最小的結果。

本發(fā)明首次建立了測定大鼠肝微粒體中5種Ugt亞型的cocktail方法，對于快速評價大鼠肝微粒體中UGT酶的活性具有重要意義。并且本發(fā)明在之前文獻已報道的UGT酶在人肝微粒體中cocktail方法基礎上，選擇了更專屬的底物和更合適的底物濃度，進一步發(fā)展了UGT酶在人肝微粒體中的cocktail方法，使得底物之間相互作用更小。

本發(fā)明通過建立大鼠和人肝微粒體中UGT酶活性的cocktail方法也能幫助了解UGT酶的種屬差異，為利用大鼠模型進行藥代動力學和毒代動力學的實驗評估提供了參考。

本發(fā)明測定UGT酶活的方法為：LC-MS/MS分析法。LC-MS/MS具有高效、快速、靈敏的優(yōu)點，能同時檢測多個化合物，有助于快速、大量篩選對UGT酶活性有抑制作用的化合物，被頻繁的應用在檢測多種UGT底物和代謝物的實驗中。本實驗所用LC-MS/MS為安捷倫1290液相色譜-6460三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜柱為Phenomenex Kinetex XB-C18柱(100×4.6mm,2.6μM)，流動相選擇為A：水(0.01％乙酸)和B：乙腈，流速為0.4ml/min。流動相梯度為0-1分鐘，20％B；1-2.5分鐘，20-30％B；2.5-5分鐘，30-80％B；5-6分鐘，80％B；6-6.5分鐘，80-30％B；6.5-7分鐘，30-20％B；7-9分鐘，20％B。質(zhì)譜條件為：正/負離子電噴霧離子化(ESI)模式下，選擇多反映監(jiān)測(MRM)模式監(jiān)控母離子子離子，具體離子對信息如下表1所示。其他條件，干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：10L/min；霧化氣壓力：35psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11L/min；碰撞氣壓力，1.6Mpa。

本發(fā)明測定UGT酶活的cocktail法的有益效果在于：

(1)高效性：本發(fā)明通過選擇專一性高的底物，利用cocktail底物同時測定UGT的多種同工酶活性的優(yōu)勢，使得多個酶的活性變化可通過單次實驗獲得；可以考察如大鼠和人肝微粒體中五種UGT酶活性的變化，達到快速檢測酶活性的目的。

(2)全面性：傳統(tǒng)的單一探針藥物研究方法，單次實驗只能反映一種酶的活性，很難滿足現(xiàn)代研究快速、準確、方便和經(jīng)濟的要求，而cocktail方法能同時反映化合物對多種酶的活性影響，并將有效減小實驗數(shù)據(jù)的波動，具有全面的特點。

(3)高專屬性：本發(fā)明通過考察底物之間相互作用選擇合適的底物共同孵育，將底物之間有相互作用的分開來孵育，因此底物之間的相互作用幾乎可以忽略不計，從而使得反應的專屬性強，達到不影響其反應的目的。

本發(fā)明中，3'-Azido-3'-deoxythymidine(AZT,zidovudine)glucuronidation縮寫為AZTG。

本發(fā)明中，cocktail-1A1表示cocktail(5種底物)方法中去掉UGT1A1的底物進行孵育的結果，即只含有UGT1A3，UGT1A6，UGT1A9和UGT2B7四種酶的底物共同孵育與完整的cocktail(5種底物)進行比較，其他同上。

附圖說明

圖1為五種UGT酶底物相互作用的關系；其中，圖1A為大鼠肝微粒體中的測定結果，圖1B為人肝微粒體中的測定結果。

圖2為各種UGT酶的底物對其余四種底物的影響；其中，圖2A為大鼠肝微粒體中的測定結果，圖2B為人肝微粒體中的測定結果。

圖3為本發(fā)明建立的cocktail方法實驗結果；其中，圖3A為大鼠肝微粒體中的測定結果，圖3B為人肝微粒體中的測定結果。

圖4為陽性抑制劑驗證實驗；其中，圖4A為大鼠肝微粒體中陽性抑制劑的作用結果，圖4B為人肝微粒體中陽性抑制劑的作用結果。

圖5為不同底物濃度對五種Ugt酶的底物之間相互作用；其中，圖5A為大鼠肝微粒體中底物相互作用的關系，圖5B為大鼠肝微粒體中各種Ugt酶的底物對其余四種底物的影響結果。

具體實施方式

結合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施本發(fā)明的過程、條件、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實施例1：在大鼠肝微粒體中建立檢測五種Ugt亞型酶活性的cocktail方法

(1)五種Ugt亞型酶的底物選擇

Ugt1a1的底物選擇為雌二醇，UGT1a3的底物選擇為鵝去氧膽酸，UGT1a6的底物選擇為血清素，UGT1a9的底物選擇為丙泊酚，AZTG(具體對應亞型仍處于研究中)的底物選擇為齊多夫定，選擇各自底物濃度的1/5Km-1/2Km或者更低處進行孵育。

(2)孵育條件

孵育體系主要由0.5mg/ml(蛋白濃度)的大鼠肝微粒體、25μg/ml的丙甲菌素、50mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM的氯化鎂以及各種探針底物(UGT底物)組成。先將大鼠肝微粒體、丙甲菌素、Tris-HCl和氯化鎂以及探針底物(酶的底物)放置冰上15min，使丙甲菌素發(fā)揮作用，將UGT酶從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上釋放出來，之后放置孵育儀上預孵育5min，再用5mM的UDPGA啟動反應，放在孵育儀上37℃反應90分鐘。用含有內(nèi)標的冰乙腈加入孵育體系中終止反應，徹底渦旋混勻3分鐘后，以14,000g轉速在4℃離心10分鐘，取60μl上清進行LC-MS/MS分析。

實施例2在人肝微粒體中建立檢測五種UGT亞型酶活性的cocktail方法

底物選擇、孵育條件和操作流程與實施例1相同，只是將蛋白濃度改為0.25mg/ml，孵育時間為60min。底物濃度分別為雌二醇，2μM；鵝去氧膽酸，5μM；血清素，500μM；丙泊酚，2μM；齊多夫定，300μM。

實施例3五種底物共同孵育時的相互作用

在大鼠肝微粒體中，將五種底物混合到一起(底物最終濃度為：雌二醇，2μM；鵝去氧膽酸，2μM；血清素，20μM；丙泊酚，2μM；齊多夫定，200μM)，將其共同孵育，得到5個底物共同孵育的cocktail結果，與每個底物單獨孵育所測定的酶活性進行比較，直觀的得出cocktail方法與單獨孵育的差異，如圖1A所示，Ugt1a1在cocktail方法孵育中與單獨孵育中比值接近250％，即受到底物之間相互作用影響較大，其他底物共同孵育和單獨進行孵育比較都接近100％，即受到底物之間的相互作用影響較小。

在人肝微粒體中，將五種底物混合到一起(底物最終濃度為：雌二醇，2μM；鵝去氧膽酸，5μM；血清素，500μM；丙泊酚，2μM；齊多夫定，300μM)，將其共同孵育，得到5個底物共同孵育的cocktail結果，與每個底物單獨孵育所測定的酶活性進行比較，直觀的得出cocktail方法與單獨孵育的差異，如圖1B所示：UGT1A1，UGT1A9和UGT2B7受到相互作用的影響比較大，尤其是UGT1A9，從圖中可知其cocktail方法孵育與單獨孵育比值只有40％左右。即，五種底物共同孵育時，可能有其他酶的底物對其產(chǎn)生了較強烈的抑制。

實施例4每種底物對其他各種底物的作用

(1)在大鼠肝微粒體中，其他條件同實施例1，從五種底物中取出一種底物，將剩余的四種底物進行孵育，與五種底物共同孵育進行比較(底物最終濃度為：雌二醇，2μM；鵝去氧膽酸，2μM；血清素，20μM；丙泊酚，2μM；齊多夫定，200μM)，得出其中一種底物對剩下的4種底物的影響。如從五種底物中取出Ugt1a1，將剩余的4種底物孵育，然后與五種底物共孵育進行比較，考察Ugt1a1底物對剩余四種底物的影響。如圖2A所示，在cocktail-1a1中，AZTG的反應與完整的cocktail(含有5種底物)比較，代謝物只有30％左右，說明在去掉Ugt1a1底物后，AZTG的反應活性下降了70％，即Ugt1a1和AZTG是有可能發(fā)生底物之間比較強烈的相互作用。而從圖cocktail-1a6中發(fā)現(xiàn)，在去掉Ugt1a6底物后，對剩余底物的影響比較小，因此總結圖2A，Ugt1a1底物容易受到影響，考慮到Ugt1a1底物容易與其他底物發(fā)生相互作用，而Ugt1a6底物與其他底物發(fā)生相互作用的可能性最小，本發(fā)明設計將Ugt1a1和Ugt1a6底物共同孵育，Ugt1a3，Ugt1a9和AZTG底物共同孵育，以降低底物之間相互作用的影響。

(2)在人肝微粒體中，實驗方法同上，底物最終濃度不同，具體為：雌二醇，2μM；鵝去氧膽酸，5μM；血清素，500μM；丙泊酚，2μM；齊多夫定，300μM。結果如圖2B所示，在cocktail-1A1中，UGT1A9與完整的cocktail(含有5種底物)比較，代謝物高達250％，表明，在去掉UGT1A1底物的情況下，UGT1A9的反應活性升高了許多，即UGT1A1底物和UGT1A9底物之間是可能有底物之間的相互作用的，而UGT2B7則下降了一些，表明UGT1A1底物和UGT2B7底物之間也有可能存在底物之間的相互作用。同理，在圖cocktail-1A6中，可知UGT1A6底物和UGT2B7底物之間可能存在相互作用，而UGT1A6底物與其他底物之間相互作用較小，因此，我們嘗試將UGT1A1和UGT1A6底物作為組合一共同孵育，而將UGT1A3，UGT1A9和UGT2B7底物作為組合二共同孵育，從而達到降低底物之間相互作用的目的。

實施例5 cocktail方法

(1)在大鼠肝微粒體中，由于Ugt底物之間的相互作用，Ugt1a1底物和AZTG底物相互作用比較明顯，而Ugt1a6底物與其他底物之間相互作用均較小，因此本發(fā)明將底物分開進行孵育，其他條件同實施例1，具體為將UGT1a1和Ugt1a6底物放在一起孵育，將Ugt1a3，Ugt1a9和AZTG底物放在一起孵育，減少底物之間的相互作用。如圖3A所示，當將Ugt1a1和Ugt1a6底物共同孵育時，與單獨孵育相比Ugt1a1和Ugt1a6活性幾乎沒有變化，Ugt1a3，Ugt1a9和AZTG底物也是同樣的情況。

(2)在人肝微粒體中，由于底物之間相互作用，同樣將底物分開進行孵育，具體分組方法同大鼠肝微粒體中，具體為將UGT1A1和UGT1A6底物放在一起孵育，將UGT1A3，UGTA9和UGT2B7底物放在一起孵育，減少底物之間的相互作用。從圖3B中，也可以發(fā)現(xiàn)該分組有效減少了底物之間的相互作用。

實施例6驗證方法的可靠性

(1)在大鼠肝微粒體中，選擇各種酶的陽性抑制劑：Ugt1a1的陽性抑制劑為膽紅素(100μΜ)，Ugt1a3的陽性抑制劑為石膽酸(50μΜ)，Ugt1a6的陽性抑制劑為曲格列酮(250μΜ)，Ugt1a9的陽性抑制劑為尼氟酸(200μΜ)，AZTG的陽性抑制劑為酮康唑(500μΜ)，分別將陽性抑制劑對各酶的底物單獨孵育的抑制效果與cocktail方法(五種酶的底物共同孵育)孵育的抑制效果進行比較。如圖4A所示，cocktail方法加入陽性抑制劑孵育的結果與單獨孵育加入陽性抑制劑的結果也是幾乎相同的，說明抑制劑的抑制效果在兩種孵育方法中并無本質(zhì)的不同。

(2)在人肝微粒體中，抑制劑的濃度分別為：UGT1A1的陽性抑制劑膽紅素，50μΜ；UGT1A3的陽性抑制劑石膽酸，10μΜ；UGT1A6的陽性抑制劑曲格列酮，50μΜ；UGT1A9的陽性抑制劑尼氟酸，5μΜ；UGT2B7的陽性抑制劑酮康唑50μΜ；實驗結果如圖4B所示，cocktail方法(五種酶的底物共同孵育)加入陽性抑制劑的抑制效果與單獨孵育各酶的底物加入陽性抑制劑的結果幾乎是相同的，說明抑制劑的抑制效果在兩種孵育方法中并無本質(zhì)不同，本發(fā)明的cocktail方法可以用于篩選UGT酶的抑制劑。

實施例7不同肝微粒體中蛋白濃度對UGT酶活性測定的影響

其他條件同實施例1，如當大鼠肝微粒體為0.05-0.5mg/ml之間時，即，具體蛋白濃度為0.05，0.1，0.2，0.5(mg/ml)，結果發(fā)現(xiàn)隨著蛋白濃度的增高，代謝物的生成量增加，而反應速度卻降低，同時AZTG代謝物生成量比較少，因此綜上所述，本發(fā)明選擇0.5mg/ml作為優(yōu)選的最終的蛋白濃度。

實施例8不同反應時間對UGT酶活性測定的影響

其他條件同實施例1，如在大鼠肝微粒體中，當反應時間分別為15分鐘，30分鐘，60分鐘和90分鐘，結果發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，代謝物的量增加，反應速度降低，考慮到AZTG反應比較慢，同時生成代謝物量比較少，因此本發(fā)明選擇90分鐘作為最終的反應時間。

實施例9不同底物濃度對UGT酶活性測定的影響

其他條件同實施例1，如在大鼠肝微粒體中，當?shù)孜餄舛确謩e為：雌二醇，5μM；鵝去氧膽酸，10μM；血清素，50μM；丙泊酚，20μM；齊多夫定，200μM。本發(fā)明測定了底物之間相互作用程度，如圖5A所示，發(fā)現(xiàn)在五種酶的底物單獨孵育與cocktail孵育(五種酶的底物共同孵育)比較中，Ugt1a1和AZTG反應均受到較大影響，具體表現(xiàn)為Ugt1a1代謝物增加，而AZTG減少；如圖5B所示，在減少一種底物與完整的cocktail方法比較中發(fā)現(xiàn)，如cocktail-1a1和cocktail-1a3中，AZTG受到較大的影響，在cocktail-1a6中，Ugt1a1和Ugt1a9均受到較大影響，在cocktail-1a9中，Ugt1a1和AZTG也受到影響，cocktail-AZTG中，Ugt1a1受到較大的影響，即彼此之間相互作用是比較明顯的，因此底物濃度分別為：雌二醇，5μM；鵝去氧膽酸，10μM；血清素，50μM；丙泊酚，20μM；齊多夫定，200μM時，不適用于本發(fā)明的方法。

本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以上實施例。在不背離發(fā)明構思的精神和范圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權利要求書為保護范圍。