本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用微生物生產(chǎn)對羥基苯甲醛的方法。

背景技術(shù)：

對羥基苯甲醛，分子式為c7h6o2，分子量為122.12，一種淺黃色或類白色結(jié)晶體，微有芳香氣味。主要用途是用于醫(yī)藥工業(yè)和香料工業(yè)的重要中間體，

一、物理性質(zhì)

對羥基苯甲醛是一種淺黃色或類白色結(jié)晶體，微有芳香氣味，熔點(diǎn)：112～116℃，相對密度1.129，沸點(diǎn)：246.6℃

易溶于乙醇；乙醚；丙酮；乙酸乙酯，dmf；稍溶于水(在30.5℃水中溶解度為1.388g/100ml)，溶于苯(在65℃苯中溶解度為3.68g/ml)。

二、用途

對羥基苯甲醛是醫(yī)藥工業(yè)和香料工業(yè)的重要中間體。在醫(yī)藥工業(yè)中可用于合成羥氨芐青霉素(阿莫西林)、抗菌增效劑甲氧芐胺嘧啶(tmp)、3,4,5-三甲氧基苯甲醛、對羥基甘氨酸、羥氨芐頭孢霉素、人造天麻、杜鵑素、艾思洛兒等；在香料工業(yè)中用于合成香蘭素、乙基香蘭素、洋茉莉醛、丁香醛、茴香醛和復(fù)盆子酮等香料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要目的在于提供一種具有對羥基苯甲醛生產(chǎn)能力的菌株bacillusmegatheriumomk-11，該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為cctccno：m2016658。保存地點(diǎn)為湖北省武漢市，武漢大學(xué)：保存時(shí)間2016年11月20日。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述的菌株在生產(chǎn)對羥基苯甲醛的用途。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種對羥基苯甲醛的生產(chǎn)方法，其采用前述的菌株。

本發(fā)明提供了一種具有對羥基苯甲醛生產(chǎn)能力的菌株，且利用該菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)對羥基苯甲醛，發(fā)酵法生產(chǎn)對羥基苯甲醛是用天然原料糖質(zhì)、氨基酸等，經(jīng)過微生物代謝生成目標(biāo)產(chǎn)物的一種方法，該方法屬于低溫低壓，比較安全，操作簡單，污染少，是一個安全環(huán)保的生產(chǎn)方法。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中l(wèi)-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相檢測圖譜；

圖2為實(shí)施例1中對羥基苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)品的液相檢測圖譜；

圖3為實(shí)施例1中對羥基苯甲醛發(fā)酵液的液相檢測圖譜。

具體實(shí)施方式

菌種

從生姜種植地土壤中分離出一株具有對羥基苯甲醛生產(chǎn)能力的菌株bacillusmegatheriumomk-11，該菌已于2016年11月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctccno：m2016658。

該菌株：可利用葡萄糖、蔗糖、核糖和阿拉伯糖等，該菌株的18srrna和26srrna序列與芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的18srrna和26srrna序列有99％的相似性，該菌鑒定為芽孢桿菌屬。桿狀，末端圓。單個或呈短鏈排列。革蘭氏陽性。

該菌株的菌種活化、種子培養(yǎng)和發(fā)酵可采用如下方法：

1)菌種活化：在無菌條件下從甘油管中劃一滿環(huán)菌液均勻涂布固體斜面培養(yǎng)基上，在生化培養(yǎng)箱中于20-37℃培養(yǎng)24-48h；

2)種子培養(yǎng)

在無菌條件下從培養(yǎng)好的固體斜面上用接種鏟劃一滿環(huán)長勢良好的菌株接入無菌種子培養(yǎng)基中，該種子培養(yǎng)基初始ph5-8，在培養(yǎng)溫度28-35℃，轉(zhuǎn)速150-500rpm的條件下培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期；

種子培養(yǎng)基配方如下，按質(zhì)量比包括：糖質(zhì)原料1.0-3.5％；無機(jī)鹽0.1-1.0％；酵母浸粉0.1-1.0％；

3)發(fā)酵：將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的種子液在無菌條件下以5-20％的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基；

發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph3.0-10.0，在溫度30-40℃，攪拌轉(zhuǎn)速200-500rpm，通氣條件下發(fā)酵7-20h；然后減小通風(fēng)，繼續(xù)發(fā)酵至70-80h；

發(fā)酵培養(yǎng)基，按質(zhì)量比包括：糖質(zhì)原料2.0-5.0％；無機(jī)鹽；酵母浸粉1.0-2.5％；苯丙氨酸1.0-3.0％。

所述的固體斜面培養(yǎng)基優(yōu)選為肉湯培養(yǎng)基。

所述的糖質(zhì)原料，包括葡萄糖，蔗糖，淀粉中的至少一種。

所述的無機(jī)鹽包括鉀鹽或鈉鹽。

所述的步驟3)發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph優(yōu)選為5.0-9.0。

實(shí)施例1

種子培養(yǎng)

在無菌條件下從培養(yǎng)好的固體斜面上用接種鏟劃一滿環(huán)長勢良好的菌株接入無菌種子培養(yǎng)基中，該種子培養(yǎng)基初始ph5，在培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期。

種子培養(yǎng)基配方如下，按質(zhì)量比(％)：葡萄糖1.0；nacl0.5；酵母浸粉0.1。

發(fā)酵工藝

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的種子液在無菌條件下以10％的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph5.0，在溫度40℃，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量1:0.1的條件下發(fā)酵15h；然后降低通風(fēng)至1:0.01，繼續(xù)發(fā)酵55h。

發(fā)酵配方如下(％)：葡萄糖1.0；nacl0.5；酵母浸粉1.0；酪氨酸2.0；微量元素。

發(fā)酵液檢測方法:高效液相色譜法(hplc法)

柱型：cosmosil；5c18-ar-ⅱ；4.6id*250mm

柱溫：30℃

流動相：甲醇與水(0.1％磷酸)比例為55：45

流速：0.8ml/min，uv:216nm。

檢測結(jié)果見圖1至圖3，圖1至圖3結(jié)果表明，發(fā)酵液中含有對羥基苯甲醛。

實(shí)施例2

種子培養(yǎng)

在無菌條件下從培養(yǎng)好的固體斜面上用接種鏟劃一滿環(huán)長勢良好的菌株接入無菌種子培養(yǎng)基中，該種子培養(yǎng)基初始ph6，在培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速250rpm的條件下培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期。

種子培養(yǎng)基配方如下(％)：蔗糖3.5；kcl0.5；酵母浸粉1.0。

發(fā)酵

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的種子液在無菌條件下以10％的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph9.0，在溫度35℃，攪拌轉(zhuǎn)速350rpm，通氣量1:0.2的條件下發(fā)酵7h；然后減小通風(fēng)至1:0.02，繼續(xù)發(fā)酵73h。

發(fā)酵配方如下(％)：蔗糖4.0；kcl0.5；酵母浸粉1.0-2.5；酪氨酸1.0-3.0；微量元素。

實(shí)施例3

種子培養(yǎng)

在無菌條件下從培養(yǎng)好的固體斜面上用接種鏟劃一滿環(huán)長勢良好的菌株接入無菌種子培養(yǎng)基中，該種子培養(yǎng)基初始ph8，在培養(yǎng)溫度35℃，轉(zhuǎn)速150rpm的條件下培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期。

種子培養(yǎng)基配方如下(％)：淀粉3.5；nacl0.5；酵母浸粉1.0。

發(fā)酵

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的種子液在無菌條件下以15％的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph7.0，在溫度35℃，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，通氣量1:0.1的條件下發(fā)酵10h；然后降低通風(fēng)至1:0.01，繼續(xù)發(fā)酵65h。發(fā)酵配方如下(％)：

淀粉4.0；kcl1.0；酵母浸粉2.5；酪氨酸3.0；微量元素。

實(shí)施例4

天然對羥基苯甲醛的生產(chǎn)(三角瓶震蕩發(fā)酵)

配制種子培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組成如下(g/l)：葡萄糖10，磷酸二氫鉀7，氯化鈉2.5，酵母浸粉10.0，溶劑為水，初始ph7.0。121℃滅菌30min。

配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組成如下(g/l)：葡萄糖20，磷酸氫二鉀4，酵母浸粉1.0，酪氨酸10.0，微量元素100微升，溶劑為水，初始ph7.5。121℃滅菌30min。

種子的制備：無菌轉(zhuǎn)移低溫甘油管omk-11菌株于新鮮、無菌固體平板上，28℃活化2天，挑取菌落接種于500ml三角瓶做種子培養(yǎng)，瓶中種子培養(yǎng)基的體積為50ml，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，30℃培養(yǎng)24h，得到種子液。

天然對羥基苯甲醛的發(fā)酵：取配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基50ml倒入500ml的無菌三角瓶中，然后接入培養(yǎng)好的種子液7.5ml進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。搖瓶發(fā)酵20h把搖床轉(zhuǎn)速降至80rpm，然后繼續(xù)發(fā)酵80h后用hplc法測定發(fā)酵液中天然對羥基苯甲醛的濃度為2.0g/l。

實(shí)施例5：天然對羥基苯甲醛的生產(chǎn)(生物反應(yīng)器發(fā)酵)

種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基配制同實(shí)施例4。

種子的制備：無菌轉(zhuǎn)移低溫甘油管omk-11菌株于新鮮、無菌固體平板上，28℃活化2天，挑取菌落接種于裝有1.8l種子培養(yǎng)基的3l種子罐進(jìn)行種子培養(yǎng)，通風(fēng)攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，30℃培養(yǎng)24h，得到種子液。

天然對羥基苯甲醛的發(fā)酵：將配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基10.2l裝入20l發(fā)酵罐中，121℃滅菌30min，然后將培養(yǎng)好的1.8l種子液接入20l發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度30℃，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，通氣比1：0.1。發(fā)酵6h降低通風(fēng)至1：0.01，繼續(xù)發(fā)酵54h。發(fā)酵結(jié)束用hplc法測定發(fā)酵液中天然對羥基苯甲醛的濃度為3g/l。