本發(fā)明涉及蛋白酶提取技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種菠蘿蛋白酶的提取方法。

背景技術(shù)：

菠蘿蛋白酶(bromelain，EC3.4.22.33)是存在于菠蘿植株（包括果、莖、柄和葉片）中的蛋白水解酶，有多個同工酶，其活性中心含有巰基（－SH），所以屬巰基蛋白酶。菠蘿蛋白酶廣泛用于醫(yī)藥、食品、化妝品、紡織、飼料、皮革等行業(yè)。它能分解纖維蛋白、血紅蛋白等蛋白質(zhì)，能在副作用較小的情況下使纖維蛋白和血凝塊溶解，進而改善體液循環(huán)，增加組織通透性，導(dǎo)致炎癥、水腫消退 ；與抗生素、化療藥物合用可促進藥物對病灶的滲透和擴散，從而增強療效。

蛋白質(zhì)的提取純化方法主要有鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、單寧 ( 鞣酸 ) 沉淀、離子交換層析、親和層析、超濾濃縮等方法。菠蘿蛋白酶的生產(chǎn)工藝主要有硫酸銨沉淀法、單寧沉淀法、超濾法等，這些方法都有其缺點 ：硫酸銨沉淀法需要使用大量的硫酸銨，環(huán)境污染嚴重；單寧沉淀法所得的酶制劑難溶于水，酶活力低；超濾法所需設(shè)備投資大，菠蘿汁超濾濃縮過程中黏度逐漸加大，超濾膜極易堵塞，因此生產(chǎn)周期長，提取收率低。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為CN103305492B的中國發(fā)明專利，公開了一種菠蘿蛋白酶的制造方法，特別是一種高純度醫(yī)藥級菠蘿蛋白酶的提取方法。它包括以下步驟 ：菠蘿預(yù)處理、粗粉碎、酶解、榨汁、過濾、添加輔料、精過濾、添加穩(wěn)定劑、吸附劑吸附、洗脫、超濾、冷凍干燥獲得成品。該方法的優(yōu)點在于：利用纖維素吸附法替換傳統(tǒng)菠蘿蛋白酶提取中高嶺土吸附法、單寧沉淀法、有機溶劑萃取法，產(chǎn)率高、工藝簡單、能耗低，所生產(chǎn)的菠蘿蛋白酶酶活力、細菌含量、重金屬含量、外觀等指標達到或超過醫(yī)藥級標準。此外，吸附纖維素經(jīng)洗脫再生后可以重復(fù)使用，能夠極大的降低生產(chǎn)成本。但采用纖維素吸附，菠蘿蛋白酶的提取率低，損失率高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提取率高、不采用有機溶劑，綠色環(huán)保，提取的菠蘿蛋白酶純度高，酶活力強，細菌和重金屬含量很少的菠蘿蛋白酶的提取方法。

本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：

一種菠蘿蛋白酶的提取方法，具體步驟為：

1）預(yù)處理：將新鮮菠蘿或菠蘿莖清洗，預(yù)冷處理，預(yù)冷處理的溫度為0~2℃，預(yù)冷時間為21~25h。粉碎，榨汁。將菠蘿或菠蘿莖先進行預(yù)冷處理，能減少菠蘿蛋白酶酶活力損失；

2）酶解：在帶有果肉的菠蘿汁中加入蒸餾水、木質(zhì)素酶和穩(wěn)定劑，帶有果肉的菠蘿汁：蒸餾水質(zhì)量比為1:6~10。木質(zhì)素酶加入量為0.2~0.4%，穩(wěn)定劑的加入量為0.004~0.007%，pH為3.5~4.2，溫度為38~43℃，酶解時間為3~3.4h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，調(diào)節(jié)pH，加入0.3~0.5%纖維素酶和0.1~0.2%果膠酶，酶解溫度為53~56℃，pH為2.7~3.2，酶解時間為2.0~2.3h。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，過濾。木質(zhì)素酶將木質(zhì)素水解，菠蘿細胞失去支持，分散開來，增大與酶液的接觸面積；纖維素酶破壞菠蘿細胞的細胞壁，使菠蘿細胞質(zhì)流出；果膠酶繼續(xù)酶解細胞質(zhì)，使菠蘿蛋白酶分散在水溶液中，增大菠蘿蛋白酶的提取率；

3）等電點沉淀：調(diào)節(jié)濾液pH值為9.5~9.6，攪拌，靜置，過濾。pH為9.5~9.6時菠蘿蛋白酶呈電中性，在水中的溶解度急劇下降，對菠蘿蛋白酶作初步分離純化；

4）超濾：沉淀中加入蒸餾水，超濾，先用6~8kDa的超濾膜超濾，取濾過液，再用0.9~1.2kDa的超濾膜超濾，取滯留液。先后去除分子量大于6~8kDa、分子量小于0.9~1.2kDa的雜質(zhì)；對菠蘿蛋白酶溶液去鹽濃縮，減短干燥時間，節(jié)省能源；

5）干燥保存：將滯留液旋蒸濃縮，于-40~-50℃冷凍干燥，研磨，加入穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑：菠蘿蛋白酶粉末體積比為1:300~400，攪拌，得到菠蘿蛋白酶。最后得到的菠蘿蛋白酶的酶活力、細菌含量、重金屬含量、外觀等指標達到或超過醫(yī)藥級標準。

優(yōu)選的，穩(wěn)定劑成份及其重量份為：110~20份B-1穩(wěn)定劑、0.004~0.005份茄紅素、2~5份EDTA、0.002~0.005份偏亞硫酸和0.001~0.003份葉酸。巰基、氨基、色氨酸殘基和組氨酸殘基是菠蘿蛋白酶催化活性必需基團。酶分子的構(gòu)象和催化部位的微環(huán)境的變化均影響酶的催化活力。上述穩(wěn)定劑對菠蘿蛋白酶有包埋作用，隔離氧和水，同時和蛋白質(zhì)形成氫鍵。由于隔離了氧，能防止巰基被氧化，形成的氫鍵增強了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性；蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域隔離了水，降低了自由能，使酶的貯藏穩(wěn)定性得到了顯著的提高；具有較好的抗氧化性，清除自由基，保護巰基；葉酸和茄紅素通過偏亞硫酸、EDTA起到促進對重金屬的絡(luò)合作用，防止重金屬抑制菠蘿蛋白酶的活性。

優(yōu)選的，用氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀中的一種或多種調(diào)節(jié)溶液pH。不會引入重金屬或其他會抑制菠蘿蛋白酶活性的物質(zhì)，調(diào)節(jié)pH效果好。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：將菠蘿或菠蘿莖先進行預(yù)冷處理，能減少菠蘿蛋白酶酶活力損失；木質(zhì)素酶將木質(zhì)素水解，菠蘿細胞失去支持，分散開來，增大與酶液的接觸面積；纖維素酶破壞菠蘿細胞的細胞壁，使菠蘿細胞質(zhì)流出；果膠酶繼續(xù)酶解細胞質(zhì)，使菠蘿蛋白酶分散在水溶液中，增大菠蘿蛋白酶的提取率；采用的穩(wěn)定劑對菠蘿蛋白酶有包埋作用，隔離氧和水，同時和蛋白質(zhì)形成氫鍵。由于隔離了氧，能防止巰基被氧化，形成的氫鍵增強了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性；蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域隔離了水，降低了自由能，使酶的貯藏穩(wěn)定性得到了顯著的提高；具有較好的抗氧化性，清除自由基，保護巰基；對重金屬具有絡(luò)合作用，防止重金屬抑制菠蘿蛋白酶的活性；最后得到的菠蘿蛋白酶的酶活力、細菌含量、重金屬含量、外觀等指標達到或超過醫(yī)藥級標準；操作步驟簡單，成本低廉，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

具體實施例

下面通過實施例對本發(fā)明方案作進一步說明：

實施例1：

一種菠蘿蛋白酶的提取方法，具體步驟為：

1）預(yù)處理：將新鮮菠蘿或菠蘿莖清洗，預(yù)冷處理，預(yù)冷處理的溫度為0~2℃，預(yù)冷時間為21~25h。粉碎，榨汁。將菠蘿或菠蘿莖先進行預(yù)冷處理，能減少菠蘿蛋白酶酶活力損失；

2）酶解：在帶有果肉的菠蘿汁中加入蒸餾水、木質(zhì)素酶和穩(wěn)定劑，帶有果肉的菠蘿汁：蒸餾水質(zhì)量比為1:6~10。木質(zhì)素酶加入量為0.2~0.4%，穩(wěn)定劑的加入量為0.004~0.007%，pH為3.5~4.2，溫度為38~43℃，酶解時間為3~3.4h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，調(diào)節(jié)pH，加入0.3~0.5%纖維素酶和0.1~0.2%果膠酶，酶解溫度為53~56℃，pH為2.7~3.2，酶解時間為2.0~2.3h。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，過濾。木質(zhì)素酶將木質(zhì)素水解，菠蘿細胞失去支持，分散開來，增大與酶液的接觸面積；纖維素酶破壞菠蘿細胞的細胞壁，使菠蘿細胞質(zhì)流出；果膠酶繼續(xù)酶解細胞質(zhì)，使菠蘿蛋白酶分散在水溶液中，增大菠蘿蛋白酶的提取率；

3）等電點沉淀：調(diào)節(jié)濾液pH值為9.5~9.6，攪拌，靜置，過濾。pH為9.5~9.6時菠蘿蛋白酶呈電中性，在水中的溶解度急劇下降，對菠蘿蛋白酶作初步分離純化；

4）超濾：沉淀中加入蒸餾水，超濾，先用6~8kDa的超濾膜超濾，取濾過液，再用0.9~1.2kDa的超濾膜超濾，取滯留液。先后去除分子量大于6~8kDa、分子量小于0.9~1.2kDa的雜質(zhì)；對菠蘿蛋白酶溶液去鹽濃縮，減短干燥時間，節(jié)省能源；

5）干燥保存：將滯留液旋蒸濃縮，于-40~-50℃冷凍干燥，研磨，加入穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑：菠蘿蛋白酶粉末體積比為1:300~400，攪拌，得到菠蘿蛋白酶。最后得到的菠蘿蛋白酶的酶活力、細菌含量、重金屬含量、外觀等指標達到或超過醫(yī)藥級標準。

穩(wěn)定劑成份及其重量份為：10~20份B-1穩(wěn)定劑、0.004~00005份茄紅素、2~5份EDTA、0.002~0.005份偏亞硫酸和0.001~0.003份葉酸。巰基、氨基、色氨酸殘基和組氨酸殘基是菠蘿蛋白酶催化活性必需基團。酶分子的構(gòu)象和催化部位的微環(huán)境的變化均影響酶的催化活力。上述穩(wěn)定劑對菠蘿蛋白酶有包埋作用，隔離氧和水，同時和蛋白質(zhì)形成氫鍵。由于隔離了氧，能防止巰基被氧化，形成的氫鍵增強了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性；蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域隔離了水，降低了自由能，使酶的貯藏穩(wěn)定性得到了顯著的提高；具有較好的抗氧化性，清除自由基，保護巰基；對重金屬具有絡(luò)合作用，防止重金屬抑制菠蘿蛋白酶的活性，以上實驗數(shù)據(jù)呈非線性，所產(chǎn)生的優(yōu)異效果其結(jié)果有待驗證。

用氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀中的一種或多種調(diào)節(jié)溶液pH。不會引入重金屬或其他會抑制菠蘿蛋白酶活性的物質(zhì)，調(diào)節(jié)pH效果好。

實施例2：

一種菠蘿蛋白酶的提取方法，最優(yōu)選步驟為：

1）預(yù)處理：將10kg新鮮菠蘿或菠蘿莖清洗，預(yù)冷處理，預(yù)冷處理的溫度為1℃，預(yù)冷時間為22h。粉碎，榨汁。將菠蘿或菠蘿莖先進行預(yù)冷處理，能減少菠蘿蛋白酶酶活力損失；

2）酶解：在帶有果肉的菠蘿汁中加入蒸餾水、木質(zhì)素酶和穩(wěn)定劑，帶有果肉的菠蘿汁：蒸餾水質(zhì)量比為1:7。木質(zhì)素酶加入量為0.4%，穩(wěn)定劑的加入量為0.006%，pH為4.0，溫度為40℃，酶解時間為3.4h，酶解結(jié)束后沸水浴8min滅酶，調(diào)節(jié)pH，加入0.5%纖維素酶和0.1%果膠酶，酶解溫度為55℃，pH為3.0，酶解時間為2.2h。酶解結(jié)束后沸水浴8min滅酶，過濾。木質(zhì)素酶將木質(zhì)素水解，菠蘿細胞失去支持，分散開來，增大與酶液的接觸面積；纖維素酶破壞菠蘿細胞的細胞壁，使菠蘿細胞質(zhì)流出；果膠酶繼續(xù)酶解細胞質(zhì)，使菠蘿蛋白酶分散在水溶液中，增大菠蘿蛋白酶的提取率；

3）等電點沉淀：用1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)濾液pH值為9.55，攪拌，靜置，過濾。pH為9.55時菠蘿蛋白酶呈電中性，在水中的溶解度急劇下降，對菠蘿蛋白酶作初步分離純化；

4）超濾：沉淀中加入蒸餾水，超濾，先用7kDa的超濾膜超濾，取濾過液，再用1kDa的超濾膜超濾，取滯留液。先后去除分子量大于7kDa、分子量小于1kDa的雜質(zhì)；對菠蘿蛋白酶溶液去鹽濃縮，減短干燥時間，節(jié)省能源；

5）干燥保存：將滯留液旋蒸濃縮，于-46℃冷凍干燥，研磨，加入穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑：菠蘿蛋白酶粉末體積比為1:320，攪拌，得到菠蘿蛋白酶。最后得到的菠蘿蛋白酶的酶活力、細菌含量、重金屬含量、外觀等指標達到或超過醫(yī)藥級標準。

穩(wěn)定劑成份及其最優(yōu)選重量份為：12份B-1穩(wěn)定劑、0.004份茄紅素、3份EDTA、0.003份偏亞硫酸和0.002份葉酸。巰基、氨基、色氨酸殘基和組氨酸殘基是菠蘿蛋白酶催化活性必需基團。酶分子的構(gòu)象和催化部位的微環(huán)境的變化均影響酶的催化活力。上述穩(wěn)定劑對菠蘿蛋白酶有包埋作用，隔離氧和水，同時和蛋白質(zhì)形成氫鍵。由于隔離了氧，能防止巰基被氧化，形成的氫鍵增強了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性；蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域隔離了水，降低了自由能，使酶的貯藏穩(wěn)定性得到了顯著的提高；具有較好的抗氧化性，清除自由基，保護巰基；對重金屬具有絡(luò)合作用，防止重金屬抑制菠蘿蛋白酶的活性。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進行贅述。

以上所述的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行了詳細說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。