本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種車前子多糖提取物的制備方法。

背景技術(shù)：

天然藥物中廣泛存在具有抗補體作用的活性成分，國內(nèi)外已完成部分天然藥物如麻黃、人參、杜仲等的篩選，發(fā)現(xiàn)自然界中廣泛存在的某些多糖、蛋白質(zhì)、多肽、甾類、萜類和生物堿等化學(xué)物具有顯著的抗補體活性，其中以糖基化蛋白和多聚糖化合物為多，肝素是有糖醛酸和氨基葡萄糖聚合而成的一個硫酸化多糖，是研究較早、較成熟的補體抑制劑，但由于肝素具有抗凝血作用，在生物體內(nèi)需較高濃度才能發(fā)揮藥效，且副作用大，限制了其臨床用途。

車前子是我國廣泛使用的正品藥材之一，車前子的化學(xué)成分中主要含有黃酮類和多糖等成份，車前子臨床應(yīng)用廣泛，在國內(nèi)多用于治療泌尿系統(tǒng)感染、高血壓等疾病，環(huán)烯醚萜類和黃酮類被認為車前子的主要活性成分。

現(xiàn)有技術(shù)如，中國發(fā)明授權(quán)專利文獻，授權(quán)公告號CN 102138981 B該發(fā)明涉及一種免疫抑制活性車前子提取物的制備方法和醫(yī)藥用途，制備方法包括原料脫脂后，再經(jīng)過水提取、醇沉淀得到粗提取物，粗提取物經(jīng)過透析、離子交換層析脫去蛋白、色素，除去小分子化學(xué)成分，制成較高純度的車前子提取物，該發(fā)明中的免疫抑制活性車前子提取物，其中總多糖的含量占提取物重量百分比的 72％以上，該發(fā)明通過大量的藥理學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，車前子提取物具有免疫抑制活性，可以用作制備各種劑型的免疫抑制劑或作為制備其他免疫抑制藥物的原料藥，用于治療與免疫炎性損傷相關(guān)的疾病 ：腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水腫、以及眼葡萄膜炎、角膜基質(zhì)炎、角膜移植排異反應(yīng)等眼部疾病的醫(yī)藥用途，但是該發(fā)明在藥材前期處理有所欠缺，例如未進行破殼處理可能會影響提取率，在提取車前子多糖方面還具有提升空間。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述技術(shù)問題提供一種提取率高，純度高的一種車前子多糖提取物的制備方法，通過對藥材前期預(yù)處理，再配合助溶劑、超聲波助溶提高多糖在蒸餾水中的熔解率進而提高多糖的提取率及在提取物中的含量，改進并完善了現(xiàn)有技術(shù)中車前子多糖的提取工藝，本發(fā)明提取方法簡單，可操作性強。

本發(fā)明針對上述技術(shù)問題所采取的方案為：車前子多糖提取物的制備方法，制備方法包括以下步驟：

1）原料處理：將車前子烘干，除雜、粉碎破殼，加入石油醚回流脫脂，得殘渣；

2）粗提?。杭尤霘堅亓?~12倍的蒸餾水和0.1~0.2倍助溶劑，超聲波助溶，濃縮，加入乙醇醇沉，離心得沉淀物，沉淀物依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌，用蒸餾水溶解沉淀物，透析，濃縮，冷凍干燥得沉淀物A；

3）提取：沉淀物A依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌，用蒸餾水加熱溶解，離心，取上清液，脫色素和蛋白質(zhì)，減壓濃縮，得車前子提取物；本發(fā)明對車前子進行破殼預(yù)處理后脫脂，再配合助溶劑、超聲波助溶，進行二次提取，制得的提取物中的多糖含量高，提取工藝簡單。

作為優(yōu)選，步驟1中將車前子在40~55℃下烘干3~5h，除雜質(zhì)后粉碎2~6min，利于多糖提取，加入車前子體積1/3~1/2的石油醚回流脫脂，去除脂類對提取的影響。

作為優(yōu)選，步驟2中超聲波助溶功率為100~350w，時間為10~40min，使多糖在助溶劑的配合下充分在蒸餾水中溶解，利于多糖提取，濃縮至車前子原體積的0.1~1倍，去除水分提升乙醇醇沉的效果。

作為優(yōu)選，步驟2中加入85~90%乙醇醇沉，離心得沉淀物，將多糖沉淀，依次用沉淀物重量1~5倍的無水乙醇，丙酮分別洗滌，脫水。

作為優(yōu)選，步驟2中所述助溶劑由復(fù)合表面活性劑2~3重量份、混合溶液2~3重量份與蒸餾水0.8~1.2重量份組成，復(fù)合表面活性劑是由二己基琥珀酸磺酸鈉、聚氧乙烯壬烷基酚醚、乙基乙基一甲氧基肉桂酸鹽、阿魏酸，按物質(zhì)的量比mol 5∶3：0.2：0.1 配比制成，混合溶液是由分析純AR 的正丁醇、分析純AR 的95%乙醇和乙酸乙酯，按體積比ml為3∶4：0.25配比制成，將復(fù)合表面活性劑與混合溶液混合后，與蒸餾水按體積比ml為4~6∶1 配比制成助溶劑，乙基乙基一甲氧基肉桂酸鹽、阿魏酸與上述復(fù)合表面活性劑其他成份組合，可能是疊加產(chǎn)生了意想不到的有益成分或協(xié)同交互作用，具有促進車前子多糖溶解的作用，使車前子多糖充分溶解到蒸餾水中，再配合超聲波助溶，充分溶解多糖進而提高提取率。

作為優(yōu)選，步驟2中用分子截留量4000~11000Da的透析袋透析20~23h，獲得不同分子量的多糖，不同分子量的多糖的效果也有所不同，擴大提取到的多糖作用。

作為優(yōu)選，步驟3中依次用沉淀物A重量1~6倍的無水乙醇，丙酮分別洗滌，將沉淀物中的水分去除，獲得較高含量多糖的沉淀物。

作為優(yōu)選，步驟3中在沉淀物A加熱溶解后靜置2~4min，3000~3800r/min離心3~5min后再以3900~5500r/min離心5~8min，取上清液，更利于分離出多糖沉淀物且離心效率提高，離心時間減少，減少了提取時間。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明對車前子進行破殼預(yù)處理后脫脂，再配合助溶劑、超聲波助溶，進行二次提取，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明使用助溶劑和超聲波助溶使多糖充分在蒸餾水中溶解，利于多糖的提取，制得的提取物中的多糖含量高，多糖含量在98.5%以上，雜質(zhì)含量低，提取工藝簡單。

具體實施例

以下結(jié)合實施例作進一步詳細描述：

實施例1

車前子多糖提取物的制備方法，制備方法包括以下步驟：

1）原料處理：將車前子烘干，除雜、粉碎破殼，加入石油醚回流脫脂，得殘渣；

2）粗提?。杭尤霘堅亓?~12倍的蒸餾水和0.1~0.2倍助溶劑，超聲波助溶，濃縮，加入乙醇醇沉，離心得沉淀物，沉淀物依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌，用蒸餾水溶解沉淀物，透析，濃縮，冷凍干燥得沉淀物A；

3）提?。撼恋砦顰依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌，用蒸餾水加熱溶解，離心，取上清液，脫色素和蛋白質(zhì)，減壓濃縮，得車前子提取物；本發(fā)明對車前子進行破殼預(yù)處理后脫脂，再配合助溶劑、超聲波助溶，進行二次提取，制得的提取物中的多糖含量高，提取工藝簡單。

步驟1中將車前子在40~55℃下烘干3~5h，除雜質(zhì)后粉碎2~6min，利于多糖提取，加入車前子體積1/3~1/2的石油醚回流脫脂，去除脂類對提取的影響。

步驟2中超聲波助溶功率為100~350w，時間為10~40min，使多糖在助溶劑的配合下充分在蒸餾水中溶解，利于多糖提取，濃縮至車前子原體積的0.1~1倍，去除水分提升乙醇醇沉的效果。

步驟2中加入85~90%乙醇醇沉，離心得沉淀物，將多糖沉淀，依次用沉淀物重量1~5倍的無水乙醇，丙酮分別洗滌，脫水。

步驟2中所述助溶劑由復(fù)合表面活性劑2~3重量份、混合溶液2~3重量份與蒸餾水0.8~1.2重量份組成，復(fù)合表面活性劑是由二己基琥珀酸磺酸鈉、聚氧乙烯壬烷基酚醚、乙基乙基一甲氧基肉桂酸鹽、阿魏酸，按物質(zhì)的量比mol 5∶3：0.2：0.1 配比制成，混合溶液是由分析純AR 的正丁醇、分析純AR 的95%乙醇和乙酸乙酯，按體積比ml為3∶4：0.25配比制成，將復(fù)合表面活性劑與混合溶液混合后，與蒸餾水按體積比ml為4~6∶1 配比制成助溶劑，利于車前子多糖溶解到蒸餾水中，再配合超聲波助溶，充分溶解多糖進而提高提取率。

步驟2中用分子截留量4000~11000Da的透析袋透析20~23h，獲得不同分子量的多糖，不同分子量的多糖的效果也有所不同，擴大提取到的多糖作用。

步驟3中依次用沉淀物A重量1~6倍的無水乙醇，丙酮分別洗滌，將沉淀物中的水分去除，獲得較高含量多糖的沉淀物。

步驟3中在沉淀物A加熱溶解后靜置2~4min，3000~3800r/min離心3~5min后再以3900~5500r/min離心5~8min，取上清液，更利于分離出多糖沉淀物且離心效率提高，離心時間減少，減少了提取時間。

實施例2

車前子多糖提取物的制備方法，制備方法包括以下優(yōu)選的步驟：

1）原料處理：將車前子在優(yōu)選的45℃下烘干4h，除雜質(zhì)后粉碎5min，優(yōu)選加入車前子體積1/5的石油醚回流脫脂，得殘渣；

2）粗提取：優(yōu)選加入殘渣重量8倍的蒸餾水和0.15倍助溶劑，超聲波助溶，超聲波助溶功率優(yōu)選為230w，時間優(yōu)選為30min，濃縮，優(yōu)選加入88%乙醇醇沉，離心得沉淀物，依次用優(yōu)選的沉淀物重量5倍的無水乙醇，丙酮分別洗滌，用蒸餾水溶解沉淀物，用分子截留量4000~11000Da的透析袋透析20~23h，根據(jù)所需多糖功效選擇分子截留量的透析袋和透析時間，濃縮，冷凍干燥得沉淀物A；

3）提取：依次用優(yōu)選的沉淀物A重量4倍的無水乙醇，丙酮分別洗滌，用蒸餾水加熱溶解，優(yōu)選靜置3min，3500r/min離心4min后再以4500r/min離心6min，取上清液，脫色素和蛋白質(zhì)，減壓濃縮，得車前子提取物；

上述步驟1~3中的透析、冷凍干燥、脫色素和蛋白質(zhì)等常規(guī)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的現(xiàn)有技術(shù)，在此不作詳細描述，本發(fā)明對車前子進行破殼預(yù)處理后脫脂，再配合助溶劑、超聲波助溶，進行二次提取，制得的提取物中的多糖含量高，提取工藝簡單。

步驟2中所述助溶劑由優(yōu)選的復(fù)合表面活性劑2.4重量份、混合溶液2.3重量份與蒸餾水1.1重量份組成，復(fù)合表面活性劑是由二己基琥珀酸磺酸鈉、聚氧乙烯壬烷基酚醚、乙基乙基一甲氧基肉桂酸鹽、阿魏酸，按物質(zhì)的量比mol 5∶3：0.2：0.1 配比制成，混合溶液是由分析純AR 的正丁醇、分析純AR 的95%乙醇和乙酸乙酯，按體積比ml為3∶4：0.25配比制成，將復(fù)合表面活性劑與混合溶液混合后，與蒸餾水按體積比ml優(yōu)選為5∶1 配比制成助溶劑，利于車前子多糖溶解到蒸餾水中，再配合超聲波助溶，充分溶解多糖進而提高提取率。

復(fù)合表面活性劑與混合溶液混合后，與蒸餾水按體積比ml不僅限于4~6∶1，還應(yīng)包括4：1、4.1：1、4.2：1、4.3：1、4.4：1……5.9：1、6：1。

步驟1中不僅限于加入車前子體積1/3~1/2的石油醚回流脫脂，還應(yīng)包括20/60、21/60、22/60、23/60……29/60、30/60的石油醚。

本發(fā)明所制備的多糖提取物在制備治療免疫炎性損傷相關(guān)疾病的藥物中使用，免疫炎性損傷相關(guān)疾病是腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水腫、眼葡萄膜炎、角膜基質(zhì)炎及角膜移植排異反應(yīng)。

以上實施方式僅用于說明本發(fā)明，而并非對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以做出各種變化和變型。因此，所有等同的技術(shù)方案也屬于本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的專利保護范圍應(yīng)由權(quán)利要求限定。