本發(fā)明涉及一種可以調(diào)控玉米生長的基因及其在轉(zhuǎn)基因玉米改良中的應(yīng)用。這種基因可以用來在玉米中表達(dá)而調(diào)控玉米的株高、生物量、生長勢、粒重和灌漿等產(chǎn)量相關(guān)性狀，進(jìn)而提高玉米產(chǎn)量。(二)
背景技術(shù)：
：通過轉(zhuǎn)基因可以改良農(nóng)作物的性狀，如獲得抗蟲能力、抗除草劑能力，提高產(chǎn)量、增強(qiáng)抗干旱、抗病能力等。在農(nóng)作物生產(chǎn)中，改良農(nóng)作物的性狀仍然是農(nóng)作物新品種培育中的重要內(nèi)容，具有重要的價(jià)值。而通過基因工程方法改良農(nóng)作物是目前農(nóng)作物改良的一種重要手段。除了抗蟲、抗除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物以外，高產(chǎn)也是轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物改良的重要內(nèi)容。例如，利用轉(zhuǎn)基因表達(dá)一種植物的轉(zhuǎn)錄因子(Transcriptionfactor)可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量(美國專利7,598,529,4)。但是利用其他基因和途徑提高農(nóng)作物產(chǎn)量仍然十分需要。Mei2蛋白質(zhì)是酵母(Schizoacccharomycespombe)從有絲分裂到減數(shù)分裂轉(zhuǎn)變的必要基因(WatanabeandYamamoto1994，Cell,78:487-498)。Mei2的主要特征是包含三個(gè)RNA的識(shí)別區(qū)域，并且能夠和RNA結(jié)合。在植物中普遍發(fā)現(xiàn)Mei2的相似基因，它們保留了這些RNA識(shí)別區(qū)域，但是它們的功能可能和酵母可能有所不同。通過基因的進(jìn)化分析，Jeffares等將植物中的Mei2類基因可以分成2種類型(Jeffareset.al,DevGenesEvol,2004,214:149-158)。一種是AML型(AML1-like)，類似擬南芥(Arabidopsisthaliana)的AML基因(Hirayamaetal.1997，F(xiàn)EBSLett413:16–20)；另外一種是TEL型(TEL-like)，類似玉米(Zeamays)的“terminalear1”基因(Veitetal.,Nature393:166–168)。玉米的Mei2的同源基因“terminalear1”(TEL-1)在植物的芽和根的分生組織中表達(dá)，失去TE1”基因功能的特變體玉米的葉片形態(tài)和葉片生長的位置不正常，說明其可能參與決定植株空間結(jié)構(gòu)形態(tài)的形成(Veitetal.,Nature393:166–168)。水稻中的Mei2的同源基因“PLASTOCHRON2”的功能和玉米TEL-1相似。Taiji等發(fā)現(xiàn)失去“PLASTOCHRON2”基因功能的水稻特變體的葉片生長位置不正常，同時(shí)植株矮小，說明其功能是調(diào)控葉片的生長位置和葉片的成熟(Taiji等，ThePlantCell,18：612–625)。YvesHatzfeld等發(fā)現(xiàn)利用組成型啟動(dòng)子GOS2啟動(dòng)PLA2基因(即玉米TE1基因在水稻中的同源基因)在水稻中過表達(dá)能顯著增加種子數(shù)量、提高收獲指數(shù)和粒重。但是PLA2及其同源基因在玉米中過表達(dá)的效果，以及利用組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控PLA2及其同源基因在玉米中過表達(dá)的效果還未見任何報(bào)道。(三)技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種利用TEL基因調(diào)控玉米產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，該方法包括將包含在植物中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子與TEL序列功能性連接DNA載體轉(zhuǎn)化玉米，其中所述的啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：本發(fā)明提供一種TEL基因在調(diào)控玉米農(nóng)藝性狀中的應(yīng)用。進(jìn)一步，本發(fā)明所述TEL基因編碼的氨基酸序列與SEQIDNO：1至少有58％，70％，80％，90％同源性。氨基酸序列的相同性可以通過現(xiàn)有的方法獲得，例如Karlin和Altschul，1990，Porc.Natl.Acad.Sci.USA87：3364；Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877.)。本發(fā)明提供的TEL基因序列為完整的TEL基因或者是部分TEL基因片段。更優(yōu)選所述TEL基因的核苷酸序列為SEQIDNO：2所示，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO：3所示。編碼本發(fā)明功能蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸序列可以有多種不同的變異。多核苷酸序列的變異包括但不限于：1)由于同一個(gè)氨基酸的不同密碼子而獲得的不同的多核苷酸序列，這些序列編碼具有相同活性的蛋白質(zhì)多肽；2)來源于生物的遺傳多態(tài)性(geneticpolymorphism)，即同一種植物的不同個(gè)體或者群體之間的多樣性；3)通過人工操作導(dǎo)入多核苷酸序列的變異。人工導(dǎo)入的這種變異可以是隨機(jī)的變異，也可以是針對性的定向變異。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員就能夠通過分子生物學(xué)的方法產(chǎn)生點(diǎn)突變、插入或者缺失變異等。通過人工操作導(dǎo)入多核苷酸序列的變異也包括通過GeneShuffling等方法獲得仍然具有正常功能的雜合基因。例如US專利2002/0058249；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature370:389-391；Cramerietal.(1997)NatureBiotech.15:436-438；Mooreetal.(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhangetal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509；Cramerietal.(1998)Nature391:288-291；andU.S.Pat.NOs.5,605,793and5,837,458。進(jìn)一步，所述的應(yīng)用是將TEL基因與在植物中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子及DNA載體連接構(gòu)建T-DNA載體，并轉(zhuǎn)化玉米，獲得農(nóng)藝性狀改良的玉米。進(jìn)一步，組成型啟動(dòng)子為在多數(shù)或全部組織中保持持續(xù)的活性的啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子、GOS2啟動(dòng)子；組織特異性啟動(dòng)子為主要在少部分組織中有活性的啟動(dòng)子，如水稻谷蛋白啟動(dòng)子Gt1、GluB-4，綠色組織特異性啟動(dòng)子等。本發(fā)明所述組織特異性啟動(dòng)子為在生殖組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。進(jìn)一步，本發(fā)明提供的組織特異性啟動(dòng)子包括但不限于玉米TE1基因的天然啟動(dòng)子(命名為pZmTE1)的核苷酸序列為SEQIDNO：4中第1bp-1389bp的堿基序列所示；玉米和水稻GA20-氧化酶基因GA20ox-1的啟動(dòng)子(分別命名為pZmGA20ox1和pOsGA20ox1)，其序列分別為SEQID：5和SEQID：6；玉米(Zeamays)auxinimportcarrier1(AUX1)基因啟動(dòng)子(命名為pAUX1)，序列為SEQIDNO：7。植物基因天然啟動(dòng)子的區(qū)域可以通過試驗(yàn)獲得確定。一般啟動(dòng)子可以是編碼蛋白質(zhì)的閱讀框5'端外面至少0.25kb，或0.5kb，或1.0kb，或2.0kb，或3.0kb的DNA片段。本發(fā)明提供的組織特異性啟動(dòng)子包括上述啟動(dòng)子及其同源基因中具有類似表達(dá)模式的基因的啟動(dòng)子。來自不同物種中的同源基因往往具有相似的表達(dá)模式，這些同源基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性往往也具有類似的模式。本發(fā)明提供的組織特異性啟動(dòng)子還包括具有上述啟動(dòng)子類似強(qiáng)度和分布的轉(zhuǎn)錄活性，根據(jù)上述啟動(dòng)子修飾或人工合成的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的強(qiáng)弱和分布是通過其序列中一個(gè)或多個(gè)元件來實(shí)現(xiàn)的，而并不是其序列中每一個(gè)堿基都和其功能相關(guān)。因此，對一個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行某些序列的增減、變換、甚至只需要通過截取或人工合成其中一個(gè)或多個(gè)元件就能實(shí)現(xiàn)該啟動(dòng)子啟動(dòng)基因組織特異性表達(dá)的功能。進(jìn)一步，所述T-DNA載體還包括CaMV35S增強(qiáng)子。進(jìn)一步，所述DNA載體為含耐草甘膦基因EPSPS的雙元載體pCambia1300-G10。進(jìn)一步，所述T-DNA載體結(jié)構(gòu)為：組織特異性啟動(dòng)子-TEL基因-終止子p35S-pZmUbi-EPSPS-終止子。本發(fā)明同時(shí)也提供了獲得能夠調(diào)控植物產(chǎn)量相關(guān)性狀，提高植物產(chǎn)量的基因工程植物的方法。本發(fā)明提供的方法包括：1)構(gòu)建包含表達(dá)本發(fā)明提供的多核苷酸序列的表達(dá)框。表達(dá)框可以通過一個(gè)或者幾個(gè)控制表達(dá)的多核苷酸序列與TE1基因或者其同源基因功能性連接而獲得。本發(fā)明特別提供了組織特異性啟動(dòng)子用來定量定點(diǎn)的控制目標(biāo)基因的表達(dá)。2)將表達(dá)框?qū)氲街参镏?，并且獲得表達(dá)。通過利用組織特異性啟動(dòng)子，使導(dǎo)入的基因獲得最佳的表達(dá)量和最好的表達(dá)位置，從而達(dá)到有效改良植物產(chǎn)量相關(guān)性狀，提高植物產(chǎn)量，并且避免由于目標(biāo)基因的過度和越位表達(dá)帶來的負(fù)面影響?？刂苹虮磉_(dá)的終止子可以是提供基因的天然終止子，也可以是從同種植物的其他基因或者其他植物基因的終止子。常用的終止子包括來源于農(nóng)桿菌的Octopine合成酶終止子和nopaline合成酶終止子等。參考文獻(xiàn)包括：Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell64:671-674；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5:141-149；Mogenetal.(1990)PlantCell2:1261-1272；Munroeetal.(1990)Gene91:151-158；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903；andJoshietal.(1987)NucleicAcidsRes.15:9627-9639。為了提高基因在目標(biāo)植物中的表達(dá)水平，基因的多核苷酸序列可以進(jìn)一步修飾和改變。這些改變包括刪除內(nèi)含子、清除一些可能影響基因正常表達(dá)的序列，如隱藏的非成熟的PolyA信號(hào)序列等。根據(jù)目標(biāo)植物的密碼子使用情況，編碼相同蛋白質(zhì)多肽的多核苷酸序列可以優(yōu)化，以提高其在目標(biāo)植物中的表達(dá)量?？蛇x的，在DNA表達(dá)框中加入一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子可以增加TEL編碼序列的表達(dá)水平。增強(qiáng)子無論是在基因的上游還是下游，都會(huì)對基因的表達(dá)起到增強(qiáng)作用。因此，可以通過增強(qiáng)子來調(diào)控本發(fā)明中的組織特異性啟動(dòng)子和目標(biāo)基因構(gòu)成的表達(dá)框，獲得具有理想的目標(biāo)基因表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)區(qū)域的植物品系。本發(fā)明提供的基因表達(dá)框的載體也可以同時(shí)包含一個(gè)選擇標(biāo)記基因表達(dá)框。這個(gè)選擇標(biāo)記基因可以用來選擇轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞，常用的基因包括抗生素抗性基因，如neomycinphosphotransferaseII(NEO)和hygromycinphosphotransferase(HPT)、抗除草劑基因，如抗草甘膦基因EPSPS等。其他選擇標(biāo)記基因同樣可以用作本發(fā)明轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因。目前本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員能夠利用已有的技術(shù)將本發(fā)明提供的多核苷酸導(dǎo)入到植物中表達(dá)。比較常用的方法是基因槍方法(Kleinetal,1987,Nature(London)327:70-73；U.S.Pat.No.4,945,050))或農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法((DeBlaereetal,1987,Meth.Enzymol.143:277)。但是本發(fā)明不限于以上這些方法。不同植物的轉(zhuǎn)化方法和步驟有所不同。但是，通常通過農(nóng)桿菌或基因槍將外源基因?qū)氲街参锏奈闯墒炫?、成熟胚、未分化的愈傷組織或原生質(zhì)體。然后用相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)。再進(jìn)行分化而獲得轉(zhuǎn)化芽，經(jīng)過生根培養(yǎng)基培養(yǎng)就可以獲得可以種植的轉(zhuǎn)基因苗。進(jìn)一步，抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物可以通過噴施除草劑篩選，例如噴施煙嘧磺隆可以殺滅非轉(zhuǎn)基因的玉米。本發(fā)明還提供了通過在玉米基因組中導(dǎo)入調(diào)控元件，增加TE1基因表達(dá)的方法。本發(fā)明提供的調(diào)控元件可以是增強(qiáng)子。本發(fā)明提供的增強(qiáng)子可以是CaMV35S增強(qiáng)子。把調(diào)控元件定點(diǎn)導(dǎo)入生物基因組中的方法有很多，例如鋅指核酸內(nèi)切酶(ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9技術(shù)。發(fā)明同時(shí)還提供了利用調(diào)控元件獲得能夠調(diào)控植物產(chǎn)量相關(guān)性狀，提高植物產(chǎn)量的基因工程植物的方法。1)構(gòu)建CRISPR/Cas9表達(dá)框。表達(dá)框可以把CaMV35S增強(qiáng)子導(dǎo)入到玉米基因組中的TE1基因表達(dá)框前面或者后面，使得TE1基因的表達(dá)增強(qiáng)。2)將表達(dá)框?qū)氲街参镏?，并且獲得表達(dá)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明第一次發(fā)現(xiàn)在玉米中調(diào)控TE1基因及其同源基因的表達(dá)可以調(diào)控玉米株高、生長勢、種子產(chǎn)量等性狀的功能；本發(fā)明第一次發(fā)現(xiàn)利用調(diào)控元件增加TE1基因及其同源基因可以調(diào)控玉米株高、生長勢、種子產(chǎn)量等性狀，進(jìn)而提高玉米產(chǎn)量；本發(fā)明第一次發(fā)現(xiàn)利用組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控TE1基因及其同源基因在玉米中過表達(dá)可以改良玉米株高、生長勢、種子產(chǎn)量等性狀，進(jìn)而提高玉米產(chǎn)量。(四)附圖說明圖1：包含組織特異性啟動(dòng)子和TEL基因連接構(gòu)成的表達(dá)框的T-DNA結(jié)構(gòu)示意圖。pZmUbi為玉米泛素啟動(dòng)子；EPSPS為本研究組克隆到的抗草甘膦基因1174(中國專利，CN102146371A，SEQIDNO:26-SEQIDNO:30中任意一種)。圖2：包含有增強(qiáng)子調(diào)控組織特異性啟動(dòng)子和TEL基因連接構(gòu)成的表達(dá)框的T-DNA結(jié)構(gòu)示意圖。pZmUbi為玉米泛素啟動(dòng)子；EPSPS為本研究組克隆到的抗草甘膦基因(中國專利，CN102146371A)；p35S為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子，在此有增強(qiáng)子功能。(五)具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：本發(fā)明的以下實(shí)施例所使用的分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法均為已知的技術(shù)。在Ausubel編寫的JohnWileyandSons公司出版的CurrentProtocolsinMolecularBiology，和J.Sambrook等編寫ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)出版的MolecularCloning:ALabortoryManual,3rdED.等文獻(xiàn)均有詳細(xì)的說明。實(shí)施例1、玉米中TE1基因表達(dá)框的克隆和轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建根據(jù)基因庫中TE1基因多核苷酸序列，設(shè)計(jì)了PCR引物，從玉米(Zeamays)基因組中擴(kuò)增TE1基因。由于TE1基因比較大，全長基因，包括啟動(dòng)子、蛋白質(zhì)編碼區(qū)和終止子，通過2個(gè)PCR片段獲得。第一個(gè)片段包括啟動(dòng)子和部分蛋白質(zhì)編碼區(qū)，利用如下PCR引物擴(kuò)增獲得：ZMte3-13F(5’AAGCTTAGTGCCAATCACTGCGTGAGA)和ZMte-22R(5’CCTCGGGCTCCTTGAACAGGAA)。第二個(gè)片段包括部分蛋白質(zhì)編碼區(qū)和終止子，利用如下PCR引物擴(kuò)增獲得：ZMte-32F(5’TCGCAGGGGACTTGAAGGATGTGA)和ZMte-42R(5’GGTACCCTATTTAAGATCTCACTTCAAGCTCTATGA)。這二個(gè)片段分別克隆到pMD19-T載體中。然后，第一個(gè)片段用HindIII和AatII酶從pMD19-T中切出，第二個(gè)片段用AatII和KpnI酶從pMD19-T中切出。這二個(gè)片段同時(shí)克隆到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙元載體pCambia1300-G10的HindIII和KpnI位點(diǎn)之間，獲得pCambia1300-p35S-G10-TE1。轉(zhuǎn)化載體中玉米TE1基因表達(dá)框的多核苷酸序列是SEQIDNO:4。pCambia1300-p35S-G10載體(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069:SEQIDNO.47)包含一個(gè)耐草甘膦基因(EPSPS)(作為轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因)，p35S啟動(dòng)子(作為目標(biāo)基因的增強(qiáng)子)連入目標(biāo)基因表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)。最后，通過電轉(zhuǎn)的方法把上述T-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，通過含有15μg/ml四環(huán)素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基篩選出陽性克隆，并保菌，用于接下來的植物轉(zhuǎn)化。實(shí)施例2、玉米TE1基因cDNA的克隆玉米(Zeamays)TE1基因cDNA的克?。涸O(shè)計(jì)PCR引物ZmTE1-F(5’GAGGATCCAACAGAATTCATGGGTGGGTTC)和ZmTE1-R(5’GCGGTCTAGATTACTAGTCGTCGTAGCCAAGC)，以商業(yè)玉米品種鄭單958的總cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得大小約為2kb的TE1的cDNA片段。PCR反應(yīng)條件為：95℃3分鐘；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分鐘，重復(fù)33個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘。將獲得的大約2kb的PCR產(chǎn)物克隆到T-載體pMD19中。然后，通過BamHI和XbaI雙酶切得到ZmTE1，并且DNA序列測定表明其核苷酸序列正確(SEQIDNO：2)。之后，把酶切獲得的cDNA以及合成的終止子ter1(核苷酸序列為SEQIDNO：8)通過XbaI連接，獲得結(jié)構(gòu)為ZmTE1-ter1結(jié)構(gòu)的核苷酸序列，用于和本發(fā)明中的組織特異性啟動(dòng)子連接。實(shí)施例3、組織特異性啟動(dòng)子的克隆玉米(Zeamays)赤霉素合成酶基因ZmGA20ox1啟動(dòng)子(pZmGA20ox1)的獲得：設(shè)計(jì)PCR引物pZmGA20ox1-F(5’TAAGCTTCTGCCATGACGTGATTGTCCCTGGC)和pZmGA20ox1-R(5’GGGATCCAGGAGGGAGGAAGCAGAGGAGGAG)，以商業(yè)玉米品種鄭單958基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得pZmGA20ox1。PCR反應(yīng)條件為：95℃3分鐘；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分鐘，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；然后72℃10分鐘。將獲得的大約2kb的PCR產(chǎn)物克隆到T-載體pMD19中。然后，通過HindIII和BamHI雙酶切得到相應(yīng)的啟動(dòng)子pZmGA20ox1，并且DNA序列測定表明啟動(dòng)子的核苷酸序列正確(SEQIDNO：6)。玉米(Zeamays)auxinimportcarrier1(AUX1)基因啟動(dòng)子(pAUX1)的克?。喝斯ず铣傻腁UX1基因啟動(dòng)子，序列為SEQIDNO：7，通過HindIII和BamHI雙酶切得到相應(yīng)的啟動(dòng)子pAUX1。實(shí)施例4、玉米種TE1基因cDNA轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建雙元載體pCambia1300-G10載體(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069:SEQIDNO.49)包含一個(gè)耐草甘膦基因(EPSPS)(作為轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因)和連入目標(biāo)基因表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)?？梢园褜?shí)施例3中克隆到的組織特異性啟動(dòng)子pZmGA20ox1和pAUX1與實(shí)施例2中克隆到的TEL基因通過BamHI位點(diǎn)連接，形成“組織特異性啟動(dòng)子-TEL基因-終止子-pZmUbi-EPSPS-終止子”(圖1)的T-DNA結(jié)構(gòu)，獲得的T-DNA載體分別命名為1300-G10-pZmGA20ox1-TE1和1300-G10-pAUX1-TE1。把花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子(命名為p35S)與實(shí)施例2中克隆到的TEL基因通過BamHI位點(diǎn)連接，形成“組成型表達(dá)啟動(dòng)子-TEL基因-終止子-pZmUbi-EPSPS-終止子”(圖1)的T-DNA結(jié)構(gòu)，獲得的T-DNA載體命名為1300-G10-p35S-TE1。最后，通過電轉(zhuǎn)的方法把上述3個(gè)T-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，通過含有15μg/ml四環(huán)素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基篩選出陽性克隆，并保菌，用于接下來的植物轉(zhuǎn)化。實(shí)施例5.具有增強(qiáng)子的組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控的TEL基因的表達(dá)載體的構(gòu)建雙元載體pCambia1300-p35S-G10載體(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069:SEQIDNO.47)包含一個(gè)耐草甘膦基因(EPSPS)(作為轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因)，p35S啟動(dòng)子(作為目標(biāo)基因的增強(qiáng)子)與連入目標(biāo)基因表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)?？梢园褜?shí)施例3中克隆到的組織特異性啟動(dòng)子和實(shí)施例2中克隆的TEL基因通過BamHI位點(diǎn)連接，形成“組織特異性啟動(dòng)子-TEL基因-終止子p35S-pZmUbi-EPSPS-終止子”(圖2)的T-DNA結(jié)構(gòu)。獲得的T-DNA載體分別命名為1300-p35S-G10-pZmGA20ox1-TE1和1300-p35S-G10-pAUX1-TE1。最后，通過電轉(zhuǎn)的方法把上述兩個(gè)T-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，通過含有15μg/ml四環(huán)素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基篩選出陽性克隆，并保菌，用于接下來的植物轉(zhuǎn)化。實(shí)施例6、玉米的轉(zhuǎn)化玉米的轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)比較成熟，例如Frame等描述了利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米的方法(PlantPhysiol,2002,129：13-22)。分別取實(shí)施例1、實(shí)施例4和實(shí)施例5中獲得的農(nóng)桿菌劃板，挑單菌落接種準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。取授粉后8－10天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小為1.0－1.5mm)。將含有T-DNA載體的農(nóng)桿菌與未成熟胚共培養(yǎng)2－3天(22℃)。轉(zhuǎn)移未成熟胚到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(200mg/L的Timentin殺農(nóng)桿菌)，28℃暗培養(yǎng)10－14天。將所有的愈傷轉(zhuǎn)到帶有2mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2-3周。轉(zhuǎn)移所有的組織到新鮮草甘膦(濃度為2mM)的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2－3周。然后，轉(zhuǎn)移所有篩選后成活的胚性組織到再生培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)10－14天，每皿一個(gè)株系。轉(zhuǎn)移胚性組織到新鮮的再生培養(yǎng)基上，26℃光照培養(yǎng)10－14天。轉(zhuǎn)移所有發(fā)育完全的植株到生根培養(yǎng)基上，26℃光照培養(yǎng)直到根發(fā)育完全，然后移植到溫室中單株培養(yǎng)，檢測轉(zhuǎn)基因玉米的抗除草劑能力。實(shí)施例7、TEL基因過表達(dá)玉米植株的鑒定我們使用的轉(zhuǎn)基因受體植株為容易轉(zhuǎn)化，但是農(nóng)藝性狀很差的品種Hi-II。為了準(zhǔn)確的研究轉(zhuǎn)化載體對玉米品系的影響，我們把獲得的對照品系和目標(biāo)載體轉(zhuǎn)基因品系分別與以商業(yè)玉米品種鄭單958的母本進(jìn)行1次雜交和連續(xù)回交8次再挑選近等位基因系自交2次，獲得穩(wěn)定的近等位基因自交系。然后，把對照品系和目標(biāo)載體轉(zhuǎn)基因品系分別與鄭單958的父本雜交，獲得的雜交種子用于比較和分析。將實(shí)施例6獲得的轉(zhuǎn)基因玉米植株和空載體對照植株的產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行比較分析。我們獲得的92個(gè)轉(zhuǎn)1300-G10-pAUX1-TE1載體的轉(zhuǎn)基因品系(命名為AU)中有17個(gè)品系和對照相比生長勢增強(qiáng)、株高顯著增加、棒子變大、粒重增加、生物量增加且產(chǎn)量增加。其中兩個(gè)典型品系的產(chǎn)量相性狀的表型如下如表1。表1：兩個(gè)典型品系與對照品系的比較AU-18AU-46株高10.5％9.5％千粒重25.4％16.4％生物量13.1％11.2％產(chǎn)量12.1％10.8％*表格中的參數(shù)都經(jīng)過F-Test檢驗(yàn)(P≤0.05)且都是和對照相比大于5％的。CK為只含有篩選標(biāo)記基因EPSPS的空載體的轉(zhuǎn)基因玉米植株；AU為載體1300-p35S-G10-pAUX1-TE1的T-DNA轉(zhuǎn)化植株，其中AU后面的編號(hào)(18，46)是對不同品系隨機(jī)編號(hào)，用于區(qū)分不同的轉(zhuǎn)化事件。1300-G10-pZmGA20ox1-TE1載體轉(zhuǎn)基因玉米植株的表型變化和AU類似，15％以上的轉(zhuǎn)基因植株和空載體對照植株相比產(chǎn)量相關(guān)性狀都有顯著改良且產(chǎn)量增加。另外的品系和對照相比表型變化都比較小。我們獲得的94個(gè)轉(zhuǎn)1300-p35S-G10-pAUX1-TE1載體的轉(zhuǎn)基因品系(命名為SAU)中有65個(gè)品系和對照相比生長勢增強(qiáng)、株高顯著增加、棒子變大、粒重增加、生物量增加且產(chǎn)量增加。其中兩個(gè)典型品系的產(chǎn)量相性狀的表型如下如表2。表2：兩個(gè)典型品系與對照品系的比較SAU-3SAU-85株高16.5％25.3％千粒重25.9％30.2％生物量14.1％18.5％產(chǎn)量13.2％14.6％*表格中的參數(shù)都經(jīng)過F-Test檢驗(yàn)(P≤0.05)且都是和對照相比大于5％的。其中CK為只含有篩選標(biāo)記基因EPSPS的空載體的轉(zhuǎn)基因玉米植株；SAU為載體1300-p35S-G10-pAUX1-TE1的T-DNA轉(zhuǎn)化植株，其中SAU后面的編號(hào)(3，85)是對不同品系隨機(jī)編號(hào)，用于區(qū)分不同的轉(zhuǎn)化事件。pCambia1300-p35S-G10-TE1和1300-p35S-G10-pZmGA20ox1-TE1載體轉(zhuǎn)基因玉米植株的表型變化和SAU類似，65％以上的轉(zhuǎn)基因植株和空載體對照植株相比產(chǎn)量相關(guān)性狀都有顯著改良且產(chǎn)量增加。另外的品系和對照相比表型變化都比較小，還有個(gè)別品系的表型出現(xiàn)了畸形。作為對照，我們獲得了組成型表達(dá)啟動(dòng)子花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(p35S)調(diào)控ZmTE1的表達(dá)載體1300-G10-p35S-TE1，獲得的82個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中65個(gè)品系跟空白載體對照相比沒有表型變化的，17個(gè)品系跟空白載體對照相比出現(xiàn)了如嚴(yán)重不育、開花嚴(yán)重延遲、株型不協(xié)調(diào)等畸形表型。SEQUENCELISTING<110>浙江大學(xué)<120>一種TEL基因在調(diào)控玉米農(nóng)藝性狀中的應(yīng)用<130><160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>95<212>PRT<213>unknown<220><223>人工序列<400>1ProPheSerSerTyrAspPheLeuTyrLeuProIleAspPheAsnAsn151015LysCysAsnValGlyTyrGlyPheValAsnLeuThrSerProGluAla202530AlaValArgLeuTyrLysAlaPheHisLysGlnProTrpGluValPhe354045AsnSerArgLysIleCysGlnValThrTyrAlaArgValGlnGlyLeu505560AspAlaLeuLysGluHisPheLysAsnSerLysPheProCysAspSer65707580AspGluTyrLeuProValValPheSerProProArgAspGlyLys859095<210>2<211>1974<212>DNA<213>unknown<220><223>人工序列<400>2atgggtgggttcccggaagccacgggtaaccttctcgatgccgcagctcaggagttccac60cctacggtctgtgccccctatcctctacagccgcttccgcaacagctatactgcccccac120ccatatccagccatgccggtgcctccgccgccgcaaatagccatgttacagccagtgcct180ccgatggcgatggccatggcgccgcagccggggtacaccttgccaacgacgacgccggtg240gtcaatggcccgtcgagccgcgtcgtggtgctgggccttgtcccgccgcacgcgcaggag300gccgacgtggcgcaggcgatggcgccattcggcgcgatccgctcggtcgacgcgtgcgcg360gtggcgtccgagggcgtggccaccgtccatttcttcgacatccgcgccgccgagctcgcc420ttgacctgtgtccgcgagcagcacatgcgccagcagagccgcctcgggcagctctacgcg480gcggccgccgtagccccggcgtgggctcctgcaccgacgccccaggcctgggactggccc540caccccaacgacgacggccgcggcctcgtcctcgggcacgccgtgtgggcccacttcgcc600accggcgccgacgacggcgacaaccgcggctccctggtggtcctgagccccctgcccggc660gtctcggtcgctgacctccgccaagtcttccaggccttcggggacttgaaggatgtgagg720gagtcggcgcagcggcccagccacaagttcgtggacttcttcgacacgcgcgacgccgcg780cgcgcgctcgccgagctcaacggccaggagcttttcggccgccgcctcgtcgtcgagttc840acgcgcccttccggccccgggccccgcaggcgcgggtacgcaccccaccagcaccggccc900accgcgccgactccgccgaggcttcaagcgacgtggcgaccgtcccaaccgacgtcgtct960cagccgccggcatcctcgtcgtcgt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