本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及烷烴氧載體在提高出芽短梗霉菌的聚蘋果酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

聚蘋果酸(polymalicacid)是一種以蘋果酸為唯一單體、相互之間通過(guò)酯鍵連接而成的高分子聚合物，它最早是由shimada等在1969年從圓弧青霉菌(pencilliumcyolopium)中分離得到，1979年vert等在首次用化學(xué)合成制備了該聚合物。聚蘋果酸具有良好的水溶性，其水解后的單體蘋果酸，可通過(guò)參與到生物體內(nèi)的三羧酸循環(huán)而被吸收，對(duì)人體無(wú)任何的毒副作用。聚蘋果酸的較好水溶性、生物可降解性和生物相容性等性能，使聚蘋果酸及其衍生物在生物醫(yī)藥、生物材料和食品工程等眾多領(lǐng)域具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景。微生物發(fā)酵法制備的聚蘋果酸具有很高的化學(xué)純度和光學(xué)純度，這是化學(xué)合成法難以達(dá)到的。聚蘋果酸主要由出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)、絨泡黏菌(physarumpolycephalum)等真核微生物合成，其中a.pullulans具有較強(qiáng)的聚蘋果酸合成能力。

普魯蘭糖是一種線性聚合的高分子多糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是葡萄糖以α-1,4-糖苷鍵結(jié)合成麥芽三糖，兩端再以α-1,6-糖苷鍵同另外的麥芽三糖結(jié)合，如此反復(fù)連接而成。普魯蘭糖作為低能量的食品添加劑，獲得美國(guó)fda權(quán)威認(rèn)證，此外，普魯蘭糖良好的成膜性和安全無(wú)毒的特點(diǎn)，使其在制藥工業(yè)中也具有廣泛用途。

聚蘋果酸和普魯蘭糖可同時(shí)由出芽短梗霉發(fā)酵合成。中國(guó)發(fā)明專利zl201110430053.5公開(kāi)了一種出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭糖的方法。我們實(shí)驗(yàn)室篩選的一株出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d(保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，cgmccno.7.208)合成聚蘋果酸能力較強(qiáng)，但是該菌同時(shí)合成一種胞外多糖副產(chǎn)物，經(jīng)鑒定該副產(chǎn)物為普魯蘭糖。由于普魯蘭糖粘度較大，它的存在會(huì)嚴(yán)重影響聚蘋果酸的分離提取，因此如何降低產(chǎn)物中普魯蘭糖的濃度成為我們關(guān)心的問(wèn)題。鄒祥等公開(kāi)了一種通過(guò)外源添加吐溫提高聚蘋果酸產(chǎn)量、抑制普魯蘭糖的方法(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01410073783.6)，但是未見(jiàn)其他提高聚蘋果酸產(chǎn)量、抑制普魯蘭糖合成的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了烷烴氧載體在提高出芽短梗霉菌的聚蘋果酸產(chǎn)量中的應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的降低產(chǎn)物中普魯蘭糖的濃度效果不佳的問(wèn)題。

烷烴氧載體是一種與水不互溶、對(duì)微生物無(wú)毒的有機(jī)物，其溶氧能力是水的15～20倍。在發(fā)酵液中引入烷烴氧載體，可以減少氣液傳氧阻力，提高發(fā)酵體系溶氧水平。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，菌株a.pullulansha-4d聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭糖受到溶氧調(diào)控，高溶氧條件有利于聚蘋果酸合成，不利于普魯蘭糖合成。因此本發(fā)明通過(guò)烷烴氧載體調(diào)控溶氧，調(diào)節(jié)代謝流向聚蘋果酸合成方向進(jìn)行。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

烷烴氧載體在提高出芽短梗霉菌的聚蘋果酸產(chǎn)量中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

其中，所述的烷烴氧載體為正己烷，正庚烷，正十二烷或正十六烷，優(yōu)選正己烷。

其中，所述的出芽短梗霉菌的菌株號(hào)為a.pullulansha-4d，保藏編號(hào)為cgmccno.7.208。

其中，所述的應(yīng)用方法為：將出芽短梗霉菌活化后在含有烷烴氧載體的培養(yǎng)基中發(fā)酵。

其中，將出芽短梗霉菌活化的方法為：將出芽短梗霉菌接種于種子培養(yǎng)基中，在25～30℃，轉(zhuǎn)速180～250rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)24～48小時(shí)；其中，所述的種子培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖50～100g/l，酵母提取物0.5～2g/l，硝酸鈉1～3g/l，磷酸二氫鉀0.05～0.2g/l，硫酸鎂0.05～0.2g/l，氯化鉀0.3～1.5g/l，碳酸鈣10～20g/l。

其中，所述的含有烷烴氧載體的培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖100～200g/l，硝酸鈉1～3g/l，磷酸二氫鉀0.05～0.2g/l，硫酸鎂0.05～0.2g/l，氯化鉀0.3～1.5g/l，硫酸鋅0.05～0.2g/l，碳酸鈣20～40g/l；其中，烷烴氧載體體積占培養(yǎng)基總體積的0.3～1.5％。

其中，優(yōu)選配方為：

葡萄糖120g/l，硝酸鈉2g/l，磷酸二氫鉀0.1g/l，硫酸鎂0.1g/l，氯化鉀0.5g/l，硫酸鋅0.1g/l，碳酸鈣30g/l，正己烷載體1.5％。

其中，

所述的發(fā)酵的方法為：在25～30℃，轉(zhuǎn)速為180～250rpm的條件下，搖床培養(yǎng)120～168小時(shí)；

或者，在25～30℃，轉(zhuǎn)速300～600rpm，通氣比1：1～2的條件下在機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)96～168小時(shí)。

優(yōu)選的發(fā)酵方法為：

在25℃，轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)144小時(shí)；

或者，在25℃，轉(zhuǎn)速400rpm，通氣比1：1.5的條件下在機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)168小時(shí)。

有益效果：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明公開(kāi)了利用烷烴氧載體提高聚蘋果酸產(chǎn)量、抑制普魯蘭糖合成的方法。采用低濃度烷烴氧載體建立定向調(diào)控策略，實(shí)現(xiàn)對(duì)聚蘋果酸和普魯蘭糖合成的碳代謝流向調(diào)控，抑制副產(chǎn)物普魯蘭糖的合成，提高主產(chǎn)物聚蘋果酸的產(chǎn)量，同時(shí)添加此濃度范圍的烷烴氧載體不會(huì)對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞生長(zhǎng)造成抑制。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例8和9中發(fā)酵全程溶氧變化曲線圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

本發(fā)明中使用的種子培養(yǎng)基各組分為：葡萄糖50g/l，酵母提取物1g/l，硝酸鈉2g/l，磷酸二氫鉀0.1g/l，硫酸鎂0.1g/l，氯化鉀0.5g/l，碳酸鈣20g/l。

本發(fā)明中使用的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基各組分為：葡萄糖120g/l，硝酸鈉2g/l，磷酸二氫鉀0.1g/l，硫酸鎂0.1g/l，氯化鉀0.5g/l，硫酸鋅0.1g/l，碳酸鈣30g/l。

本發(fā)明中檢測(cè)發(fā)酵液中普魯蘭糖含量的方法：收集發(fā)酵液，將發(fā)酵液8000rpm離心10min，收集上清液，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至相當(dāng)于原體積的1/2，然后加入4℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為50％，4℃靜止過(guò)夜，然后8000rpm離心10min收集沉淀，80℃烘干稱重。

本發(fā)明中檢測(cè)發(fā)酵液中聚蘋果酸含量的方法：收集發(fā)酵液，將發(fā)酵液8000rpm離心10min，收集上清液。取1ml上清液，加入1ml濃度為2mol/l的硫酸，90℃水解9h。采用高效液相色譜(hplc)檢測(cè)，色譜柱spursilc18-ep(7.8×300mm，5μm)；以a相(25mmkh2po4ph2.5)：b相(甲醇)＝90:10為流動(dòng)相，柱溫：30℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。使用蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)hplc檢測(cè)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中聚蘋果酸含量。

實(shí)施例1

取保藏號(hào)為cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接種于含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)48h。然后取種子液10ml，接種于500ml搖瓶中，搖瓶中裝有90ml基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并額外添加1ml正庚烷，然后在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)144小時(shí)。結(jié)果顯示，本實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量33.8g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量2.5g/l。

同時(shí)按照與上述相同方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，區(qū)別在于使用的是基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，未加入正庚烷。結(jié)果顯示，本對(duì)比實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量為30.3g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量為5.9g/l。

實(shí)施例1與對(duì)比實(shí)施例相比，聚蘋果酸產(chǎn)量提高了11.6％，普魯蘭糖產(chǎn)量降低了57.6％。

實(shí)施例2

取保藏號(hào)為cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接種于含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)48h，種子液制備3瓶。然后取種子液300ml，接種于5l機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中裝有2.7l基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并額外添加30ml正庚烷，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速400rpm、通氣比1：1.5的條件下進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛鹊陀?0g/l時(shí)，以12ml/h的流速向罐內(nèi)持續(xù)流加300g/l葡萄糖，168小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。本實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量102.8g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量8.7g/l。

同時(shí)按照與上述相同方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，區(qū)別在于使用的是基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，未加入正庚烷。結(jié)果顯示，本對(duì)比實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量為82.5g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量為18.3g/l。

實(shí)施例2與對(duì)比實(shí)施例相比，聚蘋果酸產(chǎn)量提高了24.6％，普魯蘭糖產(chǎn)量降低了52.5％。

實(shí)施例3

取保藏號(hào)為cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接種于含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)48h。然后取種子液10ml，接種于500ml搖瓶中，搖瓶中裝有90ml基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并額外添加1ml正十二烷，然后在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)144小時(shí)。結(jié)果顯示，本實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量32.9g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量2.7g/l。

同時(shí)按照與上述相同方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，區(qū)別在于使用的是基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，未加入正十二烷。結(jié)果顯示，本對(duì)比實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量為30.3g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量為5.9g/l。

實(shí)施例3與對(duì)比實(shí)施例相比，聚蘋果酸產(chǎn)量提高了8.6％，普魯蘭糖產(chǎn)量降低了54.2％。

實(shí)施例4

取保藏號(hào)為cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接種于含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)48h，種子液制備3瓶。然后取種子液300ml，接種于5l機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中裝有2.7l基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并額外添加30ml正十二烷，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速400rpm、通氣比1:1.5的條件下進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛鹊陀?0g/l時(shí)，以12ml/h的流速向罐內(nèi)持續(xù)流加300g/l葡萄糖，168小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。本實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量100.5g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量10.2g/l。

同時(shí)按照與上述相同方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，區(qū)別在于使用的是基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，未加入正十二烷。結(jié)果顯示，本對(duì)比實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量為82.5g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量為18.3g/l。

實(shí)施例4與對(duì)比實(shí)施例相比，聚蘋果酸產(chǎn)量提高了21.8％，普魯蘭糖產(chǎn)量降低了44.3％。

實(shí)施例5

取保藏號(hào)為cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接種于含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)48h。然后取種子液10ml，接種于500ml搖瓶中，搖瓶中裝有90ml基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并額外添加1.5ml正十六烷，然后在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)144小時(shí)。結(jié)果顯示，本實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量33.5g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量2.4g/l。

同時(shí)按照與上述相同方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，區(qū)別在于使用的是基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，未加入正十二烷。結(jié)果顯示，本對(duì)比實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量為30.3g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量為5.9g/l。

實(shí)施例5與對(duì)比實(shí)施例相比，聚蘋果酸產(chǎn)量提高了10.6％，普魯蘭糖產(chǎn)量降低了59.3％。

實(shí)施例6

取保藏號(hào)為cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接種于含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)48h，種子液制備3瓶。然后取種子液300ml，接種于5l機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中裝有2.7l基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并額外添加45ml正十六烷，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速400rpm、通氣比1:1.5的條件下進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛鹊陀?0g/l時(shí)，以12ml/h的流速向罐內(nèi)持續(xù)流加300g/l葡萄糖，168小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。本實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量105.2g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量8.2g/l。

同時(shí)按照與上述相同方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，區(qū)別在于使用的是基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，未加入正十六烷。結(jié)果顯示，本對(duì)比實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量為82.5g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量為18.3g/l。

實(shí)施例6與對(duì)比實(shí)施例相比，聚蘋果酸產(chǎn)量提高了27.5％，普魯蘭糖產(chǎn)量降低了55.2％。

實(shí)施例7

取保藏號(hào)為cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接種于含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)48h。然后取種子液10ml，接種于500ml搖瓶中，搖瓶中裝有90ml基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并額外添加0.5ml正己烷，然后在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)144小時(shí)。結(jié)果顯示，本實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量34.2g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量2.2g/l。

同時(shí)按照與上述相同方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，區(qū)別在于使用的是基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，未加入正己烷。結(jié)果顯示，本對(duì)比實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量為30.3g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量為5.9g/l。

實(shí)施例7與對(duì)比實(shí)施例相比，聚蘋果酸產(chǎn)量提高了12.9％，普魯蘭糖產(chǎn)量降低了62.7％。

實(shí)施例8

取保藏號(hào)為cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接種于含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)48h，種子液制備3瓶。然后取種子液300ml，接種于5l機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中裝有2.7l含基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并額外添加15ml正己烷，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速400rpm、通氣比1:1.5的條件下進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛鹊陀?0g/l時(shí)，以12ml/h的流速向罐內(nèi)持續(xù)流加300g/l葡萄糖，168小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。本實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量107.6g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量7.8g/l。

同時(shí)按照與上述相同方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，區(qū)別在于使用的是基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，未加入正己烷。結(jié)果顯示，本對(duì)比實(shí)施例中聚蘋果酸產(chǎn)量為82.5g/l，普魯蘭糖產(chǎn)量為18.3g/l。

實(shí)施例8與對(duì)比實(shí)施例相比，聚蘋果酸產(chǎn)量提高了30.4％，普魯蘭糖產(chǎn)量降低了57.4％。

實(shí)施例9

按照與實(shí)施例8相同方法進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，區(qū)別在于正己烷添加量分別為0.3％(9ml)、1％(30ml)和1.5％(45ml)。5l發(fā)酵罐內(nèi)溶氧變化曲線見(jiàn)圖1，聚蘋果酸和普魯蘭糖產(chǎn)量見(jiàn)表1。結(jié)果表明，正己烷添加量為0.5％時(shí)調(diào)控效果最佳，主產(chǎn)物聚蘋果酸增加量和副產(chǎn)物普魯蘭減少值最高。

表1