本發(fā)明屬于臨床分子診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種點(diǎn)突變檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性(簡(jiǎn)稱為SNP)是個(gè)體中最常見的遺傳變異類型，占所有已知多態(tài)性的90％以上。SNP研究已成為現(xiàn)在最熱門的課題，可以進(jìn)行性狀基因的精細(xì)定位、分子輔助育種、種子資源鑒定等。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，SNP與癌癥易感性以及個(gè)體化治療的關(guān)系愈發(fā)受到關(guān)注。眾所周知，疾病的部分風(fēng)險(xiǎn)為遺傳，而SNP可能與個(gè)體的癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。近年來，關(guān)于SNP與常見癌癥易感性關(guān)系的研究層出不窮。例如：BRCA1和BRCA2基因突變與女性罹患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)休戚相關(guān)；TGFB1-509C/T多態(tài)性可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控改變從而影響TGFB1基因相關(guān)疾病，如結(jié)直腸癌的發(fā)展和嚴(yán)重程度；另外，XRCC3基因第7個(gè)外顯子中的18067位核苷酸處C到T的替換與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系也有大量報(bào)道。除此之外，近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)，同一種藥物對(duì)不同病人的治療效果有時(shí)差異顯著。此類差異大多是由于藥物在不同的個(gè)體內(nèi)活化、代謝和清除等方面的基因差異所決定的，而這種基因差異主要是SNP。研究SNP與藥物的個(gè)體敏感性或耐受性之間的關(guān)聯(lián)，可以闡明與藥物治療以及毒副作用相關(guān)的SNP基因型，從而為針對(duì)性地使用藥物提供依據(jù)。比如，歐洲藥監(jiān)局和美國(guó)FDA明確規(guī)定在使用靶向藥物愛必妥(Erbitux)和維克替比(Vectibix)治療轉(zhuǎn)移性大腸癌前必須檢測(cè)K-ras基因；另外，進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)用于指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌患者EGFR-TKIs治療已在全球形成共識(shí)，成為標(biāo)準(zhǔn)的臨床實(shí)踐。因此，人們期待準(zhǔn)確且短時(shí)間、低成本地測(cè)定基因突變或進(jìn)行基因分型的方法，通過該類檢測(cè)預(yù)測(cè)各類疾病發(fā)生頻率和/或耐藥性。目前，針對(duì)基因突變的檢測(cè)方法主要有測(cè)序法、高分辨率熔解曲線法、探針熒光定量法。但是，上述方法均存在著一定的缺陷。例如：測(cè)序法靈敏度低，一般需要基因豐度達(dá)到10％以上才能準(zhǔn)確檢測(cè)；高分辨率熔解曲線法對(duì)熒光定量?jī)x器的要求較高；探針熒光定量法探針合成的成本較高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高靈敏度基因點(diǎn)突變檢測(cè)方法及所用試劑盒，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低且檢測(cè)結(jié)果不夠準(zhǔn)確的問題。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒，包括：PCR緩沖液、無外切酶活性的DNA聚合酶、一條LNA修飾的類ARMS引物、一條常規(guī)引物(常規(guī)的無修飾引物)、dNTP混合液、核酸染料和參比染料。作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒的改進(jìn)：所述無外切酶活性的DNA聚合酶，既無3’-5’外切酶活性，亦無5’-3’外切酶活性。備注：一般PCR反應(yīng)所用的為具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)：所述無外切酶活性的DNA聚合酶為PlatinumGenoTypeTspDNAPolymerase(Invitrogen，美國(guó))。作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)：所述LNA修飾的類ARMS引物3’末端是核酸類似物，核酸類似物的碳環(huán)2’氧原子和4’碳原子位置引入亞甲基橋形成鎖狀結(jié)構(gòu)，因此LNA化學(xué)極大地增強(qiáng)了寡核苷酸的識(shí)別能力。作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)：LNA修飾的類ARMS引物，其3’端的一個(gè)堿基進(jìn)行鎖核酸修飾，引物序列與突變型序列互補(bǔ)，3’末端與野生型序列有一個(gè)堿基的差異。作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)：針對(duì)野生型/突變型MINA(突變類型C/T)，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQIDNO:1；常規(guī)引物序列為SEQIDNO:2；針對(duì)野生型/突變型B-raf(突變類型T/A)，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQIDNO:4，常規(guī)引物序列為SEQIDNO:5；針對(duì)野生型/突變型K-ras(突變類型G/A)，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQIDNO:6，常規(guī)引物序列為SEQIDNO:7；針對(duì)野生型/突變型EGFR(突變類型G/C)，LNA修飾的類ARMS引物序列為SEQIDNO:8，常規(guī)引物序列為SEQIDNO:9；針對(duì)野生型/突變型EGFR(突變類型G/A)，LNA修飾的類ARMS引物為SEQIDNO:10，常規(guī)引物為SEQIDNO:11。作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)：所述dNTP混合液濃度為2.5mM，包含等量的dATP、dTTP、dCTP、dGTP；所述核酸染料為SYBRGreenI；所述參比染料為ROX。本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述試劑盒進(jìn)行的高靈敏度基因突變檢測(cè)方法，包括以下步驟：在檢測(cè)管中加入PCR緩沖液、無外切酶活性的DNA聚合酶、LNA修飾的類ARMS引物、常規(guī)引物、dNTP混合液、核酸染料、參比染料，以及加入待測(cè)樣品，從而組成PCR反應(yīng)體系，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)；當(dāng)PCR反應(yīng)的結(jié)果有擴(kuò)增曲線時(shí)，判定待測(cè)樣品屬于突變樣品；反之，當(dāng)PCR反應(yīng)的結(jié)果無擴(kuò)增曲線時(shí)，判定待測(cè)樣品屬于野生型樣品。作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)方法的改進(jìn)：25μl的PCR反應(yīng)體系為(反應(yīng)體系中各組分濃度及含量)：10×PCR緩沖液：2.5μlLNA修飾的類ARMS引物(10μM)：0.5μl常規(guī)引物(10μM)：0.5μl無外切酶活性的DNA聚合酶：1UdNTP(2.5mM)：1.5μlSYBRGreenI(20×)：1μl參比染料ROX(25μM)：0.5μl待測(cè)樣品：1.5ng加水補(bǔ)足至25μl。作為本發(fā)明的高靈敏度基因突變檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：PCR反應(yīng)條件為：95℃2分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃15秒，60℃1秒，35個(gè)循環(huán)。在本發(fā)明中，質(zhì)粒起始量小于1.5ng下，有突變的樣品有擴(kuò)增曲線，野生型樣品無擴(kuò)增曲線。所述無外切酶活性的DNA聚合酶，可以對(duì)引物3’端一個(gè)堿基是否與模板匹配進(jìn)行較好的區(qū)分。所述的一條3’端LNA修飾的引物與一條反向正常引物，可以在使用普通TaqDNA聚合酶的情況下較好的檢出突變。在本發(fā)明中，普通酶+LNA修飾引物，或者無外切酶活性的聚合酶+普通引物，都有將突變型和野生型進(jìn)行區(qū)分的能力，只是LNA修飾引物+無外切酶活性的聚合酶這組合效果更佳。本發(fā)明屬于體外診斷技術(shù)，適用于一般的點(diǎn)突變檢測(cè)；本發(fā)明的突變檢測(cè)方法采用染料法，建立了針對(duì)單堿基突變的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明引入了無外切酶活性的DNA聚合酶及鎖核酸引物用于區(qū)分突變型和野生型基因，即，本發(fā)明包含一類無外切酶活性的DNA聚合酶以及一條鎖核酸(lockedNucleicAcid，LNA)修飾的類ARMS引物。本檢測(cè)方法具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：1、靈敏度高，可以在(1.5ng)野生型質(zhì)粒DNA背景下準(zhǔn)確檢出1‰的突變DNA；2、檢測(cè)過程為閉管反應(yīng)，顯著降低了污染，確保結(jié)果真實(shí)可信；3、操作簡(jiǎn)單快速，能在2h內(nèi)完成檢測(cè)，結(jié)果判讀簡(jiǎn)單客觀，便于分析。4、按照本發(fā)明給出的設(shè)計(jì)規(guī)則能方便設(shè)計(jì)引物，可用于臨床上各類基因點(diǎn)突變的篩查。5、相較測(cè)序法，本發(fā)明檢測(cè)費(fèi)用低，耗時(shí)短，靈敏度高(測(cè)序法靈敏度低，一般需要基因豐度達(dá)到10％以上才能準(zhǔn)確檢測(cè))，判讀簡(jiǎn)單。相較熔解曲線法與探針法，本發(fā)明在維持高靈敏度、短周期與低成本的同時(shí)，具有引物易于設(shè)計(jì)(不用引入錯(cuò)配)，以及稍加改進(jìn)就可進(jìn)行基因分型的特點(diǎn)。附圖說明下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1為用普通TaqDNA聚合酶與普通ARMS引物檢測(cè)野生型與突變型MINA質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線圖；圖2為用無核酸外切酶活性的DNA聚合酶及普通ARMS引物檢測(cè)野生型與突變型MINA質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線圖；圖3為用普通TaqDNA聚合酶與LNA修飾的ARMS引物檢測(cè)野生與突變型MINA質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線圖；圖4為用無核酸外切酶活性的DNA聚合酶及LNA修飾的ARMS引物檢測(cè)野生與突變型MINA質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線圖；圖5為用無核酸外切酶活性的DNA聚合酶及LNA修飾的ARMS引物檢測(cè)不同比例的突變型/野生型MINA質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線圖；圖6為對(duì)B-raf基因15號(hào)外顯子突變進(jìn)行檢測(cè)的擴(kuò)增曲線圖；圖7為對(duì)K-ras基因2號(hào)外顯子第12密碼子突變進(jìn)行檢測(cè)的擴(kuò)增曲線圖；圖8為對(duì)EGFR基因18號(hào)外顯子第12密碼子G719A突變進(jìn)行檢測(cè)的擴(kuò)增曲線圖；圖9為對(duì)EGFR基因18號(hào)外顯子第12密碼子G719S突變進(jìn)行檢測(cè)的擴(kuò)增曲線圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：實(shí)施例1、1)、LNA修飾的類ARMS引物的設(shè)計(jì)方式：野生型/突變型MINA質(zhì)粒的序列(部分)如下：突變類型(C/T)aaagattttgatcagaaaagggcaacgattcagtttcaccaacctcagagatttaaggatgagctttggaggatccaggagaagctggaatgttactttggctccttggttggctcgaatgtgtacataactcccgcaggatctcagggcctgccgccccattatgatgatgtcgaggttttcatcctgcagctggagggagagaaacactggcgcctctaccaccccactgtgcccctggcacgagagtacagcgtggaggccgaggaaaggatcggcaggccggtgcatgagtttatgctgaagccgggtgatttgttgtactttcccagaggaaccattC(T)atcaagcggacactcctgcggggctggcccactcgactcacgtgaccatcagcacctaccagaacaattcatggggagatttccttttggataccatctcggggcttgtatttgatactgcaaaggaagacgtggagttacggaccggcataccccggcagctgctcctgcaggtggaatccacaactgttgctacaagacgattaagtggcttcctgaggacacttgcagaccggctggagggcaccaaagaactgctttcctcagacatgaagaaggattttattatgcacagactccccccttactctgc。LNA修飾的類ARMS引物的設(shè)計(jì)規(guī)則為：其3’端的一個(gè)堿基進(jìn)行鎖核酸修飾，引物序列與突變型序列互補(bǔ)，3’末端與野生型序列有一個(gè)堿基的差異。即，LNA修飾的類ARMS引物3’末端堿基落在突變的位置上，并與突變型互補(bǔ)而與野生型不匹配。所設(shè)計(jì)的LNA修飾的類ARMS引物如下表中的SEQIDNO:1所述；所設(shè)計(jì)的普通反向引物如下表中的SEQIDNO:2所述。編號(hào)引物序列(5’-3’)SEQIDNO:1TGTACTTTCCCAGAGGAACCATTTSEQIDNO:2CCGCAGGAGTGTCCGCTTGAT2)、25μl的PCR反應(yīng)體系的設(shè)置(反應(yīng)體系中各組分終濃度及含量)：10×PCR緩沖液：2.5μlLNA修飾的類ARMS引物(10μM)：0.5μl普通反向引物(即，常規(guī)引物10μM)：0.5μlDNA聚合酶(PlatinumGenoTypeTspDNAPolymerase)：1UdNTP(2.5mM，each)：1.5μlSYBRGreenI(20×)：1μl參比染料ROX(25μM)：0.5μl待測(cè)樣品：1.5ng加水補(bǔ)足至25μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃2分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃15秒，60℃1秒，35個(gè)循環(huán)。上述待測(cè)樣品為野生型MINA質(zhì)粒/突變型MINA質(zhì)粒。3)、按上所述體系進(jìn)行熒光定量PCR，所得結(jié)果如下：當(dāng)正向引物為L(zhǎng)NA修飾的類ARMS引物(SEQIDNO:1)時(shí)，所得結(jié)果如圖4所述，根據(jù)圖4，我們得知此時(shí)突變型質(zhì)粒Ct值約為16，野生型質(zhì)粒無擴(kuò)增曲線。對(duì)比例1、將實(shí)施例1中的LNA修飾的類ARMS引物改成未經(jīng)LNA修飾的類ARMS引物(SEQIDNO:3)，其余等同于實(shí)施例1。編號(hào)引物序列(5’-3’)SEQIDNO:3TGTACTTTCCCAGAGGAACCATTT所得結(jié)果如圖2所述，根據(jù)圖2，我們得知此時(shí)突變型質(zhì)粒Ct值約為16，野生型質(zhì)粒Ct值約為19.5。對(duì)比例2、將實(shí)施例1中的無外切酶活性的DNA聚合酶(PlatinumGenoTypeTspDNAPolymerase，Invitrogen，美國(guó))改成普通的DNA聚合酶(TaqDNAPolymerase，諾唯贊，中國(guó))，其余等同于實(shí)施例1。所得結(jié)果如圖3所述，根據(jù)圖3，我們得知此時(shí)突變型質(zhì)粒Ct值約為18，野生型質(zhì)粒Ct值約為29。對(duì)比例3、將實(shí)施例1中的LNA修飾的類ARMS引物改成未經(jīng)LNA修飾的類ARMS引物(SEQIDNO:3)；將實(shí)施例1中的無外切酶活性的DNA聚合酶改成普通的DNA聚合酶，其余等同于實(shí)施例1。所得結(jié)果如圖1所述，根據(jù)圖1，我們得知此時(shí)突變型質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒Ct值基本無差別，均約為18。實(shí)驗(yàn)一(靈敏性實(shí)驗(yàn))、將實(shí)施例1中的待測(cè)樣品由1.5ng分別改成1.5×10-2ng，其中突變型質(zhì)粒/(突變型質(zhì)粒+野生型質(zhì)粒)為100％、50％、10％、1％和1‰；其余等同于實(shí)施例1。所得結(jié)果如圖5所述，根據(jù)圖5，我們得知此質(zhì)粒模板濃度下，1‰的突變型質(zhì)粒模板Ct值約為35。實(shí)施例2、對(duì)B-raf基因15號(hào)外顯子突變進(jìn)行檢測(cè)野生型/突變型B-raf序列(部分)如下：突變類型(T/A)aatcattgttttagacatacttattgactctaagaggaaagatgaagtactatgttttaaagaatattatattacagaattatagaaattagatctcttacctaaactcttcataatgcttgctctgataggaaaatgagatctactgttttcctttacttactacacctcagatatatttcttcatgaagacctcacagtaaaaataggtgattttggtctagctacagT(A)gaaatctcgatggagtgggtcccatcagtttgaacagttgtctggatccattttgtggatggtaagaattgaggctatttttccactgattaaatttttggccctgagatgctgctgagttactagaaagtcattgaaggtctcaactatagtattttcatagttcccagt。因此，所設(shè)計(jì)的LNA修飾的類ARMS引物為：SEQIDNO:4，另一條常規(guī)引物為SEQIDNO:5。編號(hào)引物序列(5’-3’)SEQIDNO:4GGTGATTTTGGTCTAGCTACAGASEQIDNO:5CTGATGGGACCCACTCCATCGA其余等同于實(shí)施例1。所得結(jié)果如圖6所示，根據(jù)圖6，我們得知突變型樣本Ct值約為21，野生型樣本無擴(kuò)增。實(shí)施例3、對(duì)K-ras基因2號(hào)外顯子第12密碼子突變進(jìn)行檢測(cè)野生型/突變型K-ras序列(部分)如下：突變類型(G/A)attgaattttgtaaggtattttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctgG(A)tggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttgatacagataaaggtttctctgaccattttcatgagtacttattac。因此，所設(shè)計(jì)的LNA修飾的類ARMS引物為：SEQIDNO:6，另一條常規(guī)引物為SEQIDNO:7。編號(hào)引物序列(5’-3’)SEQIDNO:6ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGASEQIDNO:7TCGTCAAGGCACTCTTGCCTACG其余等同于實(shí)施例1。所得結(jié)果如圖7所示，根據(jù)圖7，我們得知突變型樣本Ct值約為20，野生型樣本無擴(kuò)增。實(shí)施例4、對(duì)EGFE基因18號(hào)外顯子G719A突變進(jìn)行檢測(cè)野生型/突變型EGFR序列(部分)如下：突變類型(G/C)gccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcggcctcttcatgcgaaggcgccacatcgttcggaagcgcacgctgcggaggctgctgcaggagagggagcttgtggagcctcttacacccagtggagaagctcccaaccaagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgctggG(C)ctccggtgcgttcggcacggtgtataagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgt。因此，所設(shè)計(jì)的LNA修飾的類ARMS引物為：SEQIDNO:8，另一條常規(guī)引物為SEQIDNO:9。編號(hào)引物序列(5’-3’)SEQIDNO:8CAAAAAGATCAAAGTGCTGGCSEQIDNO:9CTCACCTTCTGGGATCCAGAGTC其余等同于實(shí)施例1。所得結(jié)果如圖8所示，根據(jù)圖8，我們得知突變型樣本Ct值約為24，野生型樣本無擴(kuò)增。實(shí)施例5、對(duì)EGFE基因18號(hào)外顯子G719S突變進(jìn)行檢測(cè)野生型/突變型EGFR序列(部分)如下：突變類型(G/A)gccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcggcctcttcatgcgaaggcgccacatcgttcggaagcgcacgctgcggaggctgctgcaggagagggagcttgtggagcctcttacacccagtggagaagctcccaaccaagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgctgG(A)gctccggtgcgttcggcacggtgtataagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgt。因此，所設(shè)計(jì)的LNA修飾的類ARMS引物為：SEQIDNO:10，另一條常規(guī)引物為SEQIDNO:11。編號(hào)引物序列(5’-3’)SEQIDNO:10CAAAAAGATCAAAGTGCTGASEQIDNO:11CTCACCTTCTGGGATCCAGAGT其余等同于實(shí)施例1。所得結(jié)果如圖9所示，根據(jù)圖9，我們得知突變型樣本Ct值約為27，野生型樣本無擴(kuò)增。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。<110>杭州金溪生物技術(shù)有限公司<120>高靈敏度基因突變檢測(cè)方法及所用試劑盒<160>11<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>LNA修飾的類ARMS引物<400>1tgtactttcccagaggaaccattt24<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>常規(guī)引物<400>2ccgcaggagtgtccgcttgat21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>未經(jīng)LNA修飾的類ARMS引物<400>3tgtactttcccagaggaaccattt24<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>LNA修飾的類ARMS引物<400>4ggtgattttggtctagctacaga23<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>常規(guī)引物<400>5ctgatgggacccactccatcga22<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>LNA修飾的類ARMS引物<400>6acttgtggtagttggagctga21<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>常規(guī)引物<400>7tcgtcaaggcactcttgcctacg23<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>LNA修飾的類ARMS引物<400>8caaaaagatcaaagtgctggc21<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>常規(guī)引物<400>9ctcaccttctgggatccagagtc23<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>LNA修飾的類ARMS引物<400>10caaaaagatcaaagtgctga20<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>常規(guī)引物<400>11ctcaccttctgggatccagagt22當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3