本發(fā)明設計分子生物學檢測鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測鑒定沙雷菌屬的PCR方法。

背景技術(shù)：

沙雷菌在分類上屬腸桿菌科( Enterobacteriaceae)、沙雷菌屬（Serratia）。沙雷菌屬現(xiàn)有包括黏質(zhì)沙雷菌（S．marcescens）、居泉沙雷菌（S．fonticola）、液化沙雷菌（S．liquefaciens）等14個種，兩個亞種。在醫(yī)學領(lǐng)域，沙雷菌屬的各個種主要引起醫(yī)院院內(nèi)感染。其中黏質(zhì)沙雷菌和液化沙雷菌被列入我國衛(wèi)生部制定的《人間傳染的病原微生物名錄》(2006)，危害程度屬第三類。沙雷菌廣泛分布于水、土壤、植物、人類以及動物的腸道和呼吸道中，是空氣中的條件致病菌。該菌長期以來被認為對人體無害，但由于其具有侵襲性并對許多常用抗生素有耐藥性，已成為一種重要的病原菌，可引起人的肺炎、泌尿道感染、敗血癥和外科手術(shù)感染等。在獸醫(yī)領(lǐng)域，沙雷菌是引起牛乳房炎和多種動物疾病的病原菌，能引起牛（乳房炎）和馬（結(jié)膜炎）、山羊（膿毒病）、雞、豬和家兔等多種動物感染，動物可通過被污染的飲水、墊料、用具及飛沫、塵埃、糞便等多種媒介發(fā)生接觸傳染。另外，近年來飲水和乳制品中沙雷菌的污染與存在狀況也越來越受到重視。

我們在對進口動物源性飼料進行沙門菌的日常檢測過程中發(fā)現(xiàn)，在進行選擇性平板分離培養(yǎng)沙門菌時，居泉沙雷菌是主要干擾菌之一。根據(jù)沙雷菌的生化特性進行一系列的生化和血清學鑒定的傳統(tǒng)方法耗時且工作量大，如果能在選擇性平板分離培養(yǎng)后，對疑似沙門菌菌落采用分子生物學方法進行腸道沙門菌和沙雷菌屬的快速鑒別診斷，無疑將提高進境飼料原料中沙門菌檢測工作效率，大大縮短后續(xù)生化和血清學鑒定所需的時間、節(jié)省人力和物力。目前，針對沙門菌的分子生物學檢測技術(shù)研究較為廣泛，有多種商品化試劑盒可供選用，但針對沙雷菌屬尚無較完善的分子生物學檢測手段。本發(fā)明提供的一種PCR快速檢測鑒定沙雷菌屬的方法，將有助于滿足醫(yī)學臨床檢測工作需要和口岸貨物驗放快速檢測工作需要，具有重要理論意義和實際應用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種PCR快速檢測鑒定沙雷菌屬的方法，本發(fā)明針對沙雷菌傳統(tǒng)分離鑒定方法無法滿足醫(yī)學臨床檢測工作需要和無法滿足口岸貨物驗放快速檢測工作需要這些不足開展研究，旨在提供一種快速、靈敏度高、特異性強的檢測方法對沙雷菌進行檢測鑒定。

本發(fā)明公開了一種PCR快速檢測鑒定沙雷菌屬的方法，以編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的gyrB基因為靶基因，設計引物對沙雷菌屬的分子生物學特征進行識別；根據(jù)GenBank公布的基因序列設計的引物為：

上游引物為F：5’-GATCCACCCCAACGTGTTCT-3’，

下游引物為R：5’-GGCACTTTCACCGAAACCAC-3’。

本發(fā)明的PCR反應體系總體積為25μL，其中2×GoTaq Green Master Mix（美國Promega公司生產(chǎn)） 12.5μL，上下游引物各1μL（終濃度為0.8μM），滅菌ddH₂O 9.5μL，DNA模板 1μL。

本發(fā)明的PCR反應循環(huán)設置為：95℃，預變性2 min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，反應結(jié)束。

本發(fā)明與傳統(tǒng)的分離鑒定的方法相比具有的優(yōu)勢：本發(fā)明方法在對沙雷菌進行檢測鑒定中具有快速、靈敏度高、特異性強等特點。本發(fā)明為我國衛(wèi)生部制定的《人間傳染的病原微生物名錄》(2006)中三類病原微生物黏質(zhì)沙雷菌和液化沙雷菌的檢測和鑒定提供高效的技術(shù)手段，同時有助于實現(xiàn)沙雷菌屬和其他腸桿菌科細菌的快速鑒別診斷，解決類似背景技術(shù)中所述實現(xiàn)對腸道沙門菌和沙雷菌屬的快速鑒別診斷的各種實際問題，具有潛在實際應用價值。

本發(fā)明所提供的一種快速檢測鑒定沙雷菌屬的PCR方法，具有如下有益效果：

1、特異性強：以編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的gyrB基因為靶基因設計的特異性引物，在PCR試驗中僅可擴增出沙雷菌，而包括鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、宋氏志賀菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸桿菌等在內(nèi)的9種非沙雷菌的擴增均為陰性，顯示了該引物良好的特異性。

2、靈敏度高：用沙雷菌的基因組DNA 進行PCR反應其檢測靈敏度可達到9.785pg/μL。

3、結(jié)果可靠：已經(jīng)用深紅沙雷菌、無花果沙雷菌、居泉沙雷菌、普利茅斯沙雷菌、黏質(zhì)沙雷菌、液化沙雷菌、變形斑沙雷菌等7種沙雷菌對引物進行驗證，因此可以充分保證結(jié)果的可靠性。

4、實用性好：根據(jù)細菌的生化特性和血清學的傳統(tǒng)分離鑒定方法所需檢測時間長，本發(fā)明采用分子生物學的方法彌補了傳統(tǒng)分離鑒定方法的不足，大大減少了檢測工作所需時間，為臨床因沙雷菌所引起的敗血癥等危重病人的及時診斷和治療提供了寶貴的時間。同時，在進口動物源性飼料的沙門菌檢疫方面，為腸道沙門菌和沙雷菌屬的快速鑒別診斷提供了新方法。

附圖說明

圖1為沙雷菌屬PCR引物特異性試驗結(jié)果。其中，圖1（a）中M為100bp DNA梯度標記物(從下往上依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、1000bp、1500bp)；NC為陰性對照；泳道1～7依次為：居泉沙雷菌Serratia fonticola；變形斑沙雷菌Serratia proteamaculans；粘質(zhì)沙雷菌 Serratia marcescens；無花果沙雷菌 Serratia ficaria；普利茅斯沙雷菌 Serratia plymuthica；液化沙雷菌 Serratia liquefaciens；深紅沙雷菌 Serratia rubidaea；圖1（b）中M為100bp DNA 梯度標記物(從下往上依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、1000bp、1500bp)；NC為陰性對照；PC為陽性對照（居泉沙雷菌Serratia fonticola）；泳道1～9依次為：大腸桿菌Eschericha coli；弗氏檸檬酸桿菌Citrobacter freundii；宋氏志賀菌 Shigella sonnei；產(chǎn)酸克雷伯菌 Klebsiella oxytoca；糞腸球菌Enterrococcus faecalis；產(chǎn)氣腸桿菌 Enterobacter aerogenes；腸炎沙門菌 Salmonella enteritidis；鼠傷寒沙門菌 Salmonella typhimurium；肺炎克雷伯菌 Klebsiella pneumoniae。

圖2為沙雷菌屬PCR引物最佳退火溫度試驗結(jié)果。其中：M為100bp DNA梯度標記物(從下往上依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、1000bp、1500bp)；NC為陰性對照；泳道1～10的溫度依次為：53.2℃、53.9℃、55.0℃、56.2℃、 57.4℃、58.6℃、59.8℃、61.0℃、62.1℃和62.8℃。

圖3為沙雷菌屬（居泉沙雷菌Serratia fonticola）PCR試驗最低檢測限試驗結(jié)果。其中：M為100bp DNA 梯度標記物(從下往上依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、1000bp、1500bp)；NC為陰性對照；泳道1～8的溫度依次為：97.85 ng、 9.785 ng、978.5 pg、97.85 pg、9.785 pg、978.5 fg、97.85 fg和9.785 fg。

具體實施方式

實施例1：沙雷菌屬PCR引物特異性試驗

1.1材料的準備

供試沙雷菌如下：居泉沙雷菌Serratia fonticola;變形斑沙雷菌Serratia proteamaculans;粘質(zhì)沙雷菌 Serratia marcescens;無花果沙雷菌 Serratia ficaria;普利茅斯沙雷菌 Serratia plymuthica;液化沙雷菌 Serratia liquefaciens;深紅沙雷菌 Serratia rubidaea；非沙雷菌如下：大腸桿菌Eschericha coli;弗氏檸檬酸桿菌Citrobacter freundii;宋氏志賀菌 Shigella sonnei;產(chǎn)酸克雷伯菌 Klebsiella oxytoca;糞腸球菌Enterrococcus faecalis;產(chǎn)氣腸桿菌 Enterobacter aerogenes;腸炎沙門菌 Salmonella enteritidis;鼠傷寒沙門菌 Salmonella typhimurium;肺炎克雷伯菌 Klebsiella pneumoniae。

以上所用的菌株均來自國內(nèi)權(quán)威微生物菌種保藏中心。

1.2 PCR方法的建立

1.2.1引物的設計合成：基于沙雷菌的gyrB（編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因）基因序列，通過大量比對及篩選獲得高度保守且特異性強的序列用于特異性引物的設計，經(jīng)NCBI Blast比對驗證所設計引物的特異性，由上海生工生物技術(shù)服務有限公司合成。所設計引物序列如下，并針對所設計的引物用溫度梯度PCR儀摸索其最佳退火溫度，見實施例2。

上游引物F：5’ -GATCCACCCCAACGTGTTCT-3’

下游引物R：5’ -GGCACTTTCACCGAAACCAC-3’

擴增片段大小為279bp。

1.2.2基因組DNA提取

1.2.2.1煮沸法：

1、挑取單菌落劃線接種于LB瓊脂平板， 37℃培養(yǎng)18h-24h；

2、刮取1～2接種環(huán)菌苔加入150微升Tris-EDTA (TE) 緩沖液中，混勻，100℃沸水浴中煮沸10min；

3、12000 r/min 離心10min，取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 試劑盒提取法：按照TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒使用說明書操作提取DNA。將所提取的細菌DNA保存在TE緩沖液中，用超微量核苷酸測定儀測定DNA濃度和質(zhì)量（OD₂₆₀/OD₂₈₀介于 1.7~1.9 且濃度大于 20ng/μL時，可用于后續(xù)PCR反應），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增反應體系：總體積為25μL，2×GoTaq Green Master Mix 12.5μL，上下游引物各1μL（終濃度為0.8μM），滅菌ddH₂O 9.5μL，DNA模板 1μL。

1.2.4 PCR反應循環(huán)設置：95℃預變性2 min；95℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 30s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min，反應結(jié)束。

1.2.5 PCR擴增產(chǎn)物檢測和鑒定：取6μLPCR產(chǎn)物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠），將瓊脂糖凝膠置于1×TAE緩沖液中用120V電壓電泳50 min后，取出，置于凝膠成像儀中用紫外燈觀察。若在279bp的位置出現(xiàn)擴增條帶，則說明所擴增的樣品為沙雷菌。電泳結(jié)果顯示只有沙雷菌的PCR擴增產(chǎn)物在279bp的位置有明亮的擴增條帶(見圖1（a）)，用其他非沙雷菌的DNA作為模板進行PCR反應均未觀察到有擴增條帶(見圖1（b）)，說明引物的特異性很強。

實施例2：PCR引物最佳退火溫度篩選

2.1材料準備

采用實施例1中1.2.2所提取的沙雷菌（以居泉沙雷菌為例）DNA作為PCR反應的模板。

2.2 PCR

2.2.1 PCR擴增反應體系：總體積為25μL，2×GoTaq Green Master Mix 12.5μL，實施例1中1.2.1所述上下游引物各1μL（終濃度為0.8μM），滅菌ddH₂O 9.5μL，DNA模板 1μL。

2.2.2 PCR反應循環(huán)設置為：95℃預變性2 min；95℃ 30s, 應用梯度PCR儀設置10個退火溫度53.2℃～62.8℃ 30s, 72℃ 30s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min，反應結(jié)束。

2.2.3 PCR擴增產(chǎn)物檢測和鑒定：取6μLPCR產(chǎn)物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠），將瓊脂糖凝膠置于1×TAE緩沖液中用120V電壓電泳50min后，取出，置于凝膠成像儀中在紫外燈下觀察。在279bp的位置上均有擴增條帶（見圖2），其中泳道1～5擴增條帶亮度無明顯差異，泳道6～10擴增條帶亮度逐漸變?nèi)?，同時考慮到適當提高退火溫度可以提高特異性擴增，所以退火溫度選擇為56℃。

實施例3：沙雷菌屬PCR檢測靈敏度試驗

3.1材料準備

采用10倍濃度系列稀釋法將實施例1中1.2.2所提取的沙雷菌（以居泉沙雷菌為例）DNA原液 （ 97.85ng/μL）稀釋成9.785 ng、978.5 pg、97.85 pg、9.785 pg、978.5 fg、97.85 fg和9.785 fg共7個不同濃度梯度。對連同原液在內(nèi)的共8個濃度的沙雷菌DNA進行PCR靈敏度試驗。

3.2 PCR檢測

3.2.1 PCR擴增反應體系：總體積為25μL，2×GoTaq Green Master Mix 12.5μL，實施例1中1.2.1所述上下游引物各1μL（終濃度為0.8μM），滅菌ddH₂O 9.5μL，DNA模板 1μL。

3.2.2 PCR反應循環(huán)設置：95℃預變性2 min；95℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 30s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min，反應結(jié)束。

3.2.3 PCR擴增產(chǎn)物檢測和鑒定：取6μLPCR產(chǎn)物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠），將瓊脂糖凝膠置于1×TAE緩沖液中用120V電壓電泳50min后，取出，置于凝膠成像儀中在紫外燈下觀察。若在279bp的位置出現(xiàn)擴增條帶，則說明該濃度的樣品可以被擴增。電泳結(jié)果顯示DNA濃度為9.785 pg/μL時279bp的位置仍然有擴增條帶（見圖3），說明此檢測方法具有較高的靈敏度，可以達到9.785 pg/μL。

以上所述為本發(fā)明優(yōu)化后較為理想的反應設置，凡是依照本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬于本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心

<120> 一種快速檢測鑒定沙雷菌屬的PCR方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatccacccc aacgtgttct 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggcactttca ccgaaaccac 20