本發(fā)明涉及新的雙功能小分子及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的制備方法以及這些化合物和其藥用組合物在治療腫瘤，炎癥，免疫等疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的雙功能小分子是一種蛋白降解靶向聯(lián)合體(PROTACs)，它們能夠選擇性誘導(dǎo)BET蛋白降解。本發(fā)明通過(guò)使用連接臂將BET蛋白小分子抑制劑和E3泛素連接酶復(fù)合體中vonRippel-Lindau(VHL)蛋白配體連接獲得雙功能小分子。
背景技術(shù)：
：E3泛素連接酶通過(guò)底物特異性來(lái)促使蛋白泛素化，所以相對(duì)于蛋白酶體抑制劑，E3泛素連接酶具有較好的治療潛力。但是目前對(duì)E3連接酶配體的開(kāi)發(fā)仍具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樾》肿颖仨毱茐牡鞍踪|(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用才能發(fā)揮作用。由于第一個(gè)小分子E3連接酶抑制劑nutlins的發(fā)現(xiàn)，大量的E3泛素連接酶配體小分子已被報(bào)道。其中一個(gè)效果比較好的E3連接酶配體就是VHL蛋白配體。BET蛋白家族被認(rèn)為是眾多疾病尤其是癌癥的潛在靶點(diǎn)，得到許多研究所和藥企的關(guān)注。BET蛋白家族包括四個(gè)蛋白(BRD2，BRD3，BRD4和BRDT)，每個(gè)蛋白都包含兩個(gè)獨(dú)立的Bromodomain結(jié)構(gòu)域(BD1，BD2)用來(lái)識(shí)別組蛋白末端乙?；馁嚢彼嵛稽c(diǎn)。Bromodomain結(jié)構(gòu)域是一個(gè)高度保守的由約110個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域，蛋白由四個(gè)α螺旋(Z，A，B，C)和兩個(gè)Loop(ZA，BC)構(gòu)成，能夠形成疏水區(qū)域，識(shí)別并結(jié)合乙酰化的賴氨酸殘基。BRD4在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮重要作用，許多研究表明BRD4被募集到靶基因的超增強(qiáng)子區(qū)域，促進(jìn)c-MYC，Bcl-X1和BCL-6等致癌基因的轉(zhuǎn)錄。由于BRD4在調(diào)節(jié)致癌基因轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵作用，使其成為潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)，利用BET抑制劑干擾BRD4與靶基因結(jié)合，下調(diào)c-MYC等致癌基因，達(dá)到抗腫瘤目的。近幾年，BET抑制劑發(fā)展迅速，有14個(gè)抑制劑處于早期臨床研究，例如IBET-762，OTX-015，ABBV-075，和CPI-0610等。雖然BET抑制劑在眾多體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中表現(xiàn)出很好的抗癌活性和耐受性，但是臨床研究還是發(fā)現(xiàn)存在一些問(wèn)題。OTX-015的I期臨床結(jié)果表明，當(dāng)使用劑量高于每天80mg時(shí)，患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用：血小板減少，當(dāng)劑量較低時(shí)，藥物抗腫瘤效果不理想。最終，研究人員給出的合理用藥方案是每天80mg，用藥兩周后需要停藥一周。本發(fā)明中設(shè)計(jì)的雙功能小分子可以對(duì)BRD4蛋白進(jìn)行泛素化標(biāo)記，誘導(dǎo)蛋白降解，抗腫瘤效果優(yōu)于BET抑制劑。抑制BRD4蛋白往往需要將藥物長(zhǎng)期維持在較高的濃度，有可能造成嚴(yán)重的副作用；而誘導(dǎo)蛋白降解只需要少量的藥物就可以，這個(gè)過(guò)程類(lèi)似于催化反應(yīng)，并不需要等摩爾量的藥物，所以使用雙功能小分子可以降低藥物使用劑量，減輕毒副作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一些新的雙功能小分子及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。這些化合物有誘導(dǎo)BET蛋白降解的功能，可用于制備新型抗腫瘤藥物。所述腫瘤可為但不限于多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、結(jié)腸癌、髓母細(xì)胞瘤、急性粒細(xì)胞白血病、慢性白血病、前列腺癌、肝細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞瘤、宮頸癌、皮膚癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌或胰腺癌。本發(fā)明的目的還在于提供一種合成新的雙功能小分子的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有新的雙功能小分子的藥物制劑。詳細(xì)
發(fā)明內(nèi)容如下：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下通式所示的雙功能小分子或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥：A-L-B其中：A是E3泛素連接酶復(fù)合體中VHL蛋白的小分子配體，結(jié)構(gòu)通式如下所示：其中：R1選自-H、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-C(CH3)3；R2、R3相同或不同，分別獨(dú)立地選自-H、-D、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-OH、-CH3、-CH2F、CHF2、-CF3、-CH2D、-CHD2、-CD3、-CH2CH3；R4選自-H、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-C(CH3)3；R5、R6相同或不同，分別獨(dú)立地選自-H、-D、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-OH、-CH3、-CH2F、CHF2、-CF3、-CH2D、-CHD2、-CD3、-CH2CH3；L是連接臂，包含非線性鏈、脂肪族鏈、芳香鏈、雜芳環(huán)結(jié)構(gòu)鏈，通過(guò)共價(jià)鍵與A和B相連，部分連接臂結(jié)構(gòu)如下通式所示：其中：n選自1-10之間的整數(shù)。B是BET蛋白抑制劑或其衍生物。本發(fā)明優(yōu)選涉及如下通式(Ia)所示的雙功能小分子或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥：其中：R7選自-H、-D、-CH3、-CH2F、CHF2、-CF3、-CH2D、-CHD2、-CD3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3；R8、R9相同或不同，分別獨(dú)立地選自-H、-D、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-OH、-CH3、-CH2F、CHF2、-CF3、-CH2D、-CHD2、-CD3、-CH2CH3；n選自1-10之間的整數(shù)。本發(fā)明更優(yōu)選涉及通式(Ia)所示的雙功能小分子或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥：其中：R7選自-H、-CH3、-CH2CH3；R8、R9相同或不同，分別獨(dú)立地選自-H、-F、-Cl、-Br、-CH3、-CH2F、CHF2、-CF3、-CH2D、-CHD2、-CD3；n選自1-6之間的整數(shù)。本發(fā)明的優(yōu)選化合物包括，但不限于：(2S，4R)-(1-((2S)-2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基異噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氫喹唑-3(2H)-基)甲基)-1H-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁?；?-4-羥基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)-2-吡咯烷甲酰胺；(2S，4R)-(1-((2S)-2-(2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基異噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氫喹唑-3(2H)-基)甲基)-1H-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁?；?-4-羥基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)-2-吡咯烷甲酰胺；(2S，4R)-(1-((2S)-2-(2-(2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基異噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氫喹唑-3(2H)-基)甲基)-1H-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羥基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)-2-吡咯烷甲酰胺；(2S，4R)-(1-((2S)-2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基異噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氫喹唑-3(2H)-基)甲基)-1H-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁?；?-4-羥基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)-2-吡咯烷甲酰胺；部分化合物的結(jié)構(gòu)為：通式(Ia)所示的化合物可以含有不對(duì)稱(chēng)或手性中心，因此可以以不同立體異構(gòu)形式存在。本發(fā)明化合物的所有立體異構(gòu)形式，包括但不限于非対映異構(gòu)體、対映異構(gòu)體和阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體以及他們的混合物(如外消旋物)，均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通式(Ia)所示的化合物還可以以不同互變異構(gòu)形式存在，所有這些形式均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。屬于“互變異構(gòu)體”或“互變異構(gòu)形式”是指經(jīng)由低能壘相互轉(zhuǎn)化的不同能量的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。根據(jù)本發(fā)明，藥學(xué)上可接受的鹽包括與下列酸形成的加成鹽：鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對(duì)甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、富馬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。鹽酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、馬來(lái)酸、苯磺酸、琥珀酸以及類(lèi)似的已知可以接受的酸成鹽。此外，本發(fā)明還包括本發(fā)明衍生物的前藥。本發(fā)明衍生物的前藥是通式(Ia)的衍生物，它們自身可能具有較弱的活性甚至沒(méi)有活性，但是在給藥后，在生理?xiàng)l件下(例如通過(guò)代謝、溶劑分解或另外的方式)被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的生物活性形式。本發(fā)明可以含有上式(Ia)的雙功能小分子及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物作為活性成份，與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合制備成組合物，并制備成臨床上可接受的劑型，上述賦形劑是指可用于藥學(xué)領(lǐng)域的稀釋劑、輔助劑或載體。上述劑型是指臨床上常用的注射劑、片劑、膠囊劑等。本發(fā)明涉及的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、前藥可作為唯一的抗腫瘤藥物單獨(dú)使用，或者可以與現(xiàn)已上市的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，用于治療預(yù)防腫瘤等。下文中提供的實(shí)施例和制備例進(jìn)一步闡明和舉例說(shuō)明本發(fā)明化合物及其制備方法。應(yīng)當(dāng)理解，下述實(shí)例和制備例的范圍并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。通式(Ia)的化合物制備方法，方法如下：步驟a：化合物I與對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)得到化合物II；步驟b：化合物II與疊氮鈉反應(yīng)得到化合物III；步驟c：化合物III與溴乙酸叔丁酯反應(yīng)得到化合物IV；步驟d：化合物IV與三氟乙酸反應(yīng)得到化合物V；步驟e：化合物V與VHL配體反應(yīng)得到化合物VI；步驟f：化合物VII與VI反應(yīng)得到通式(Ia)表示的化合物；其中，R7、R8、R9和n的定義如上所述。具體實(shí)施方式不需進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，認(rèn)為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員借助前面的描述，可以最大程度的利用本發(fā)明。因此，下面提供的實(shí)施例僅僅是進(jìn)一步闡明本發(fā)明而已，并不意味著以任何方式限制本發(fā)明范圍。原料可以從商業(yè)途徑獲得，或者通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備，或根據(jù)本文所述方法制備。化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)核磁共振(1H-NMR)和/或質(zhì)譜(MS)來(lái)確定。NMR測(cè)定是用ACF-300BRUK型核磁共振儀，測(cè)定溶劑為氘代氯仿(CDCl3)或氘代二甲亞砜(DMSO-D6)，TMS為內(nèi)標(biāo)。MS的測(cè)定用HPI100型質(zhì)譜儀。柱層析采用200-300目硅膠(青島海洋化工廠生產(chǎn))。實(shí)施例1：制備(2S，4R)-(1-((2S)-2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基異噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氫喹唑-3(2H)-基)甲基)-1H-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁?；?-4-羥基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)-2-吡咯烷甲酰胺(I-1)，其結(jié)構(gòu)式如下：步驟1)2-羥基乙基-4-甲基苯磺酸酯(1a)將乙二醇(3.91g，62.95mmol)溶于5mL吡啶中，分批加入對(duì)甲苯磺酰氯(6g，31.47mmol)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后，加入6mol/L鹽酸(40mL)，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，收集有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸去有機(jī)溶劑，殘留物通過(guò)硅膠柱色譜層析純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝20/1-10/1)洗脫得到無(wú)色液體，重2g，收率29.39％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.81(d，J＝8.3Hz，2H)，7.36(d，J＝8.0Hz，2H)，4.16-4.12(m，2H)，3.85-3.78(m，2H)，2.45(s，3H)，2.01(d，J＝19.0Hz，1H)。步驟2)2-羥基乙基疊氮(1b)將1a(1.2g，5.55mmol)和疊氮化鈉(0.72g，11.1mmol)溶于5mL丙酮和5mL水混合液中，加熱回流16小時(shí)加入20mL水，用乙酸乙酯萃取，飽和碳酸鈉水溶液洗，飽和食鹽水洗，收集有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸去有機(jī)溶劑，得到無(wú)色液體，重0.41g，收率84.85％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ3.82-3.74(m，2H)，3.49-3.39(m，2H)，2.01(s，1H)。步驟3)2-疊氮乙氧基乙酸叔丁酯(1c)將1b(0.41g，4.71mmol)和溴乙酸叔丁酯(1.1g，5.65mmol)溶于15mL四氫呋喃中，在冰水浴中攪拌10分鐘，分批加入氫化鈉(0.38g，9.42mmol)，繼續(xù)在冰水浴中反應(yīng)0.5小時(shí)后，室溫反應(yīng)3小時(shí)，加入30mL水，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，收集有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸去有機(jī)溶劑，殘留物通過(guò)硅膠柱色譜層析純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝30/1-20/1)洗脫得到無(wú)色液體，重0.41g，收率43.28％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ4.06-4.00(m，2H)，3.76-3.70(m，2H)，3.48-3.41(m，2H)，1.49(d，J＝5.8Hz，9H)。步驟4)2-疊氮乙氧基乙酸(1d)將1c(0.15g，0.75mmol)溶于4mL二氯甲烷中，加入1mL三氟乙酸，室溫反應(yīng)3小時(shí)后，減壓蒸去有機(jī)溶劑，得到棕色液體，重0.107g。步驟5)(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-疊氮乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁?；?-4-羥基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)-2-吡咯烷甲酰胺(1e)將(2S，4R)-1-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁?；?-4-羥基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)-2-吡咯烷甲酰胺(0.2g，0.46mmol)，1d(0.1g，0.69mmol)，HATU(0.26g，0.69mmol)和DIEA(0.24g，1.86mmol)溶于2mLDMF中，室溫反應(yīng)4小時(shí)后，加入20mL水，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，收集有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸去有機(jī)溶劑，殘留物通過(guò)硅膠柱色譜層析純化，使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝100/1-30/1)洗脫得到黃色固體，重0.15g，收率57.91％。步驟6)(2S，4R)-(1-((2S)-2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基異噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氫喹唑-3(2H)-基)甲基)-1H-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁?；?-4-羥基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)-2-吡咯烷甲酰胺(I-1)將6-(3，5-二甲基異噁唑-4-基)-1-甲基-4-苯基-3-(丙-2-炔-1-基)-3，4-二氫喹唑啉-2(1H)-酮(0.05g，0.134mmol)，1e(0.071g，0.127mmol)和五水合硫酸銅(0.006g，0.026mmol)溶于2mL二氯甲烷，2mL甲醇和2mL水混合液中，室溫?cái)嚢?0分鐘，加入抗壞血酸鈉(0.011g，0.053mmol)，室溫反應(yīng)4小時(shí)后，加入20mL水，用二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗，收集有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸去有機(jī)溶劑，殘留物通過(guò)硅膠柱色譜層析純化，使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝100/1-30/1)洗脫得到黃色固體，重0.079g，收率63.17％。MS(ESI，m/z)：951.20[M+Na]+實(shí)施例2：制備(2S，4R)-(1-((2S)-2-(2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基異噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氫喹唑-3(2H)-基)甲基)-1H-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁?；?-4-羥基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)-2-吡咯烷甲酰胺(I-2)，其結(jié)構(gòu)式如下：合成步驟同實(shí)施例1MS(ESI，m/z)：995.15[M+Na]+實(shí)施例3：制備(2S，4R)-(1-((2S)-2-(2-(2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基異噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氫喹唑-3(2H)-基)甲基)-1H-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁?；?-4-羥基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)-2-吡咯烷甲酰胺(1-3)，其結(jié)構(gòu)式如下：合成步驟同實(shí)施例1MS(ESI，m/z)：1039.15[M+Na]+實(shí)施例4：(2S，4R)-(1-((2S)-2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基異噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氫喹唑-3(2H）-基)甲基)-1H-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羥基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)-2-吡咯烷甲酰胺(I-4)，其結(jié)構(gòu)式如下：合成步驟同實(shí)施例1MS(ESI，m/z)：1083.30[M+Na]+實(shí)施例5：化合物的蛋白水平活性測(cè)定化合物與BRD4蛋白N端第一個(gè)bromodomain結(jié)構(gòu)域(以下稱(chēng)作BRD4(BD1))的結(jié)合活性測(cè)試采用的是AlphaScreen檢測(cè)技術(shù)?；衔锍鹾Y濃度為500nM。配制HEPES緩沖液(50mMHEPES，100mMNaCl，0.1％BSA，0.05％CHAPS，pH7.5)用于制備BRD4(BD1)蛋白、Biotin標(biāo)記的組蛋白H4、待測(cè)化合物(DMSO0.1％)、donorbeads和acceptorbeads溶液。取384孔板一塊，按照布置，板上分待測(cè)化合物孔、空白對(duì)照孔(min，max)、陽(yáng)性藥對(duì)照孔。向待測(cè)化合物孔和陽(yáng)性藥孔分別加入不同濃度的化合物溶液5μL，空白加入緩沖液5μL(DMSO0.1％)。繼續(xù)向除空白對(duì)照孔(min)外的各孔加入BRD4(BD1)蛋白溶液5μL，向空白對(duì)照孔(min)加入緩沖液5μL。室溫下孵育15分鐘后，每孔加入Biotin標(biāo)記的組蛋白H4溶液5μL，繼續(xù)在室溫下孵育1小時(shí)后，加入donorbeads和acceptorbeads溶液15μL，避光室溫孵育1小時(shí)后用EnSpire檢測(cè)儀的Alphamode(λex＝680，λem＝570)讀取熒光數(shù)值。數(shù)值處理：抑制率＝(Max-Signal)/(Max-Min)×100％其中：Max：Biotin標(biāo)記的組蛋白H4與蛋白完全結(jié)合的值Min：Biotin標(biāo)記的組蛋白H4本底值Signal：化合物相應(yīng)濃度下的值以化合物濃度和相應(yīng)的抑制率做S曲線。得到相應(yīng)化合物的IC50。部分化合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1：表1優(yōu)選化合物對(duì)BRD4(BD1)的抑制活性結(jié)果?；衔镆种坡?％)500nMIC50(μM)I-199.5＜0.5I-299.9＜0.5I-399.7＜0.5I-499.7＜0.5實(shí)施例6：化合物細(xì)胞水平活性測(cè)定化合物細(xì)胞水平的活性檢測(cè)采用Celltiter-Glo熒光細(xì)胞活力檢測(cè)法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL60或MV4-11細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過(guò)夜后，加入待測(cè)化合物37℃，5％CO2孵育72h，結(jié)束后，檢測(cè)前30分鐘在室溫下平衡測(cè)定試劑。每孔加入30uLCelltiter-Glo試劑，搖晃96孔板10分鐘誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。將96孔板在室溫下孵育2分鐘來(lái)穩(wěn)定熒光信號(hào)。使用Envision檢測(cè)儀來(lái)讀取熒光數(shù)值。數(shù)值處理：抑制率＝(Maxsignal-Compoundsignal)/(Maxsignal-Minsignal)×100％其中：Maxsignal：DMSO作用中讀取到的最大值Minsignal：只有介質(zhì)作用的最小值Compoundsignal：化合物相應(yīng)濃度下的值以化合物濃度和相應(yīng)的抑制率做S曲線。得到相應(yīng)化合物的IC50。部分化合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2：表2優(yōu)選化合物對(duì)HL-60細(xì)胞和MV4-11細(xì)胞抗增殖活性?；衔颒L-60IC50(μM)MV4-11IC50(μM)I-1＜0.5＜0.5I-2＜0.5＜0.5I-3＜0.5＜0.5I-4＜0.5＜0.5實(shí)施例7：片劑用含有權(quán)利要求1中化合物(以實(shí)施例1化合物為例)10g，按照藥劑學(xué)一般壓片法加輔料20g混勻后，壓制成100片，每片重300mg。實(shí)施例8：膠囊劑用含有權(quán)利要求1中化合物(以實(shí)施例1化合物為例)10g，按照藥劑學(xué)膠囊劑的要求將輔料20g混勻后，裝入空心膠囊，每個(gè)膠囊重300mg。實(shí)施例9：注射劑用含有權(quán)利要求1中化合物(以實(shí)施例1化合物為例)10g，按照藥劑學(xué)常規(guī)方法，進(jìn)行活性炭吸附，經(jīng)0.65μm微孔濾膜過(guò)濾后，填入氮?dú)夤拗瞥伤樦苿?，每只裝2mL，共灌裝100瓶。盡管已經(jīng)通過(guò)特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但修改和等價(jià)變化對(duì)于精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯見(jiàn)的，且它們都包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3