本發(fā)明屬藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及新型抗氧化劑3,4,5-三甲氧基苯類(lèi)化合物在制備抗氧化損傷藥物及與氧化損傷相關(guān)疾病的治療藥物中的應(yīng)用，這種抗氧化劑通過(guò)激活nrf2通路，上調(diào)通路下游相關(guān)蛋白gclc，進(jìn)而清除胞內(nèi)ros從而達(dá)到很好的抗氧化作用。

背景技術(shù)：

氧化損傷與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。例如腦缺血再灌注損傷、帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中都存在氧化應(yīng)激損傷，抗氧化劑能對(duì)這些疾病有治療作用。抗氧化劑按來(lái)源可分為人工合成抗氧化劑(如bha、bht、pg等)和天然抗氧化劑(如茶多酚、植酸等)。按作用機(jī)制則可分為兩類(lèi)，一類(lèi)為直接清除ros的抗氧化劑；第二類(lèi)為通過(guò)激活抗氧化信號(hào)通路相關(guān)蛋白，間接起到清除ros作用抗氧化劑。目前臨床應(yīng)用的抗氧化劑或處于研究階段的抗氧劑基本為單一機(jī)制，如腦中風(fēng)缺血再灌注治療用的依達(dá)拉奉通過(guò)直接清除自由基起到治療作用，如天然產(chǎn)物黃酮等可以通過(guò)激活keap1-nrf2抗氧化信號(hào)通路起到抗氧化作用。到目前為止，基于同時(shí)通過(guò)直接清除自由基，和激活抗氧化信號(hào)通路起到抗氧化作用的研究極少報(bào)道。

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期和艱苦的研究實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)了3,4,5-三甲氧基苯基在抗氧化活性中起關(guān)鍵作用，并結(jié)合了抗氧化/炎癥藥物中?；吝蚬羌芙Y(jié)構(gòu)，基于拼合原理設(shè)計(jì)了一類(lèi)新型抗氧化劑，獲得了具有直接清除ros和激活抗氧化信號(hào)通路雙重機(jī)制的抗氧化活性化合物ws13。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一個(gè)新型抗氧化劑ws13在制備抗氧化藥物及與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)疾病的治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供一種用于治療氧化應(yīng)激的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的化合物ws13或其可藥用鹽及其藥用輔料。

具體而言，本發(fā)明所述化合物為如下所述：

ws13的分子式為c18h24n2o4，化學(xué)名稱(chēng)為：1-(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3,4,5,6-tetrahydrocyclopenta[c]pyrazol-1(2h)-yl)propan-1-one.

就已經(jīng)報(bào)道的抗氧化劑而言，其抗氧化活性篩選模型一般以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷(如雙氧水刺激模型，6-羥基多巴胺pd模型等)，激活抗氧化信號(hào)通路、清除胞內(nèi)ros等為主。因此，本發(fā)明首先用ws系列化合物對(duì)h2o2誘導(dǎo)的pc12細(xì)胞氧化損傷保護(hù)模型進(jìn)行了化合物抗氧化活性的初篩(詳情見(jiàn)實(shí)施例2)?；衔飛s13具有較好的抗氧化活性，因此選擇這個(gè)化合物進(jìn)一步進(jìn)行了抗氧化活性量效關(guān)系(詳情見(jiàn)實(shí)施例3)研究，發(fā)現(xiàn)它對(duì)h2o2誘導(dǎo)的pc12細(xì)胞氧化損傷保護(hù)具有較好的量效關(guān)系。藥物對(duì)氧化損傷的保護(hù)，應(yīng)該從直接清除活性氧自由基和激活抗氧化信號(hào)通路兩個(gè)方面進(jìn)行考察，因此進(jìn)行了以下方面的研究：ws13體外清除dpph實(shí)驗(yàn)和pc12細(xì)胞nrf2通路激活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(詳情見(jiàn)實(shí)施例4)；ws13激活nrf2通路下游gclc蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)(詳情見(jiàn)實(shí)施例5)；nrf2通路gclc蛋白生成抑制劑反向驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(詳情見(jiàn)實(shí)施例5)。研究發(fā)現(xiàn)，化合物ws13能直接清除dpph，并明顯激活nrf2入核而上調(diào)抗氧化相關(guān)蛋白gclc的表達(dá)，從而清除胞內(nèi)ros達(dá)到抗氧化效果。ws13在抗氧化活性上表現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，在10μm時(shí)，清除ros活性與依達(dá)拉奉相當(dāng)。使用gclc抑制劑時(shí)，ws13的抗氧化活性則被抑制。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明ws13通過(guò)雙重機(jī)制發(fā)揮抗氧化功能，并且nrf2-gclc通路的激活是發(fā)揮抗氧化活性的主要方式。綜上所述，化合物ws13具有開(kāi)發(fā)為抗氧化藥物的前景。

本發(fā)明所述抗氧化化合物可以應(yīng)用于制備抗氧化藥物及與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的治療藥物中，所述疾病的病因至少部分地是由氧化應(yīng)激引起，所述疾病包括但不限于以下疾?。耗X卒中、腦缺血再管注損傷、神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茲海默，帕金森)。

本發(fā)明還提供了一種用于治療氧化應(yīng)激疾病的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的以上所述ws13或其可藥用鹽及其藥用輔料?！八幬锝M合物”指本發(fā)明所述化合物ws13或其可藥用鹽與現(xiàn)已上市的抗氧化藥物聯(lián)合使用，制備得到的防治氧化應(yīng)激疾病類(lèi)藥物的組合物，已上市的抗氧化藥物包括依達(dá)拉奉在內(nèi)的各種合成或天然抗氧化劑。

本文中所用“藥用輔料”指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如：稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣/鎂、聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。

本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。所述藥物的制劑形式包括注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、軟膏劑、控釋或緩釋劑或納米制劑。本發(fā)明可以組合物的形式通過(guò)口服、鼻吸入、直腸或者腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。

下面將結(jié)合實(shí)施例及說(shuō)明書(shū)附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

附圖說(shuō)明

圖1ws系列化合物合成路線(xiàn)方法。合成條件：(i)溶劑：環(huán)己烷；催化劑：對(duì)甲苯磺酸；溫度：90℃；回流5-6h.(ii)溶劑：乙醇；溫度：78℃；回流0.5-1.5h.(iii)試劑：hcl(aq)；溫度：室溫；攪拌至ph～2.(iv)溶劑：乙醇；溫度：78℃；回流2h.(v)溶劑：thf；試劑：et3n；溫度：0℃；攪拌2h。

圖2ws系列化合物抗氧化活性篩選。(a):pc12細(xì)胞用ws系列化合物(10μm)、tbhq(10μm)、或依達(dá)拉奉(10μm)預(yù)處理24h，隨后h2o2(440μm)處理24h，最后通過(guò)噻唑藍(lán)染料(mtt)法，用酶標(biāo)儀測(cè)定od值，各組od值與溶劑dmso組od值相比，計(jì)算細(xì)胞生存率。(b):ws13在雙氧水誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中劑量依賴(lài)性提升pc12細(xì)胞生存率。不同濃度ws13預(yù)處理pc12細(xì)胞24h，隨后雙氧水處理24h。最后用mtt測(cè)定od值，計(jì)算細(xì)胞生存率。每個(gè)柱條為三次實(shí)驗(yàn)的平均值和誤差值(與h2o2組相比，*p<0.05,**p<0.01)。

圖3ws13抑制雙氧水對(duì)pc12細(xì)胞的損傷作用。(a):ws13在雙氧水誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型中抑制pc12細(xì)胞凋亡。pc12細(xì)胞經(jīng)10μm的ws13、依達(dá)拉奉、或ws13(2.5，5，10μm)預(yù)處理24h,隨后雙氧水(440μm)處理24h。收集細(xì)胞，經(jīng)annexin-v與pi分別染色，由流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。(a-a)dmso；(a-b)h2o2；(a-c)tbhq；(a-d)依達(dá)拉奉；(a-e-g)2.5μm、5μm和10μm的ws13。(b):ws13預(yù)孵育減少雙氧水處理的pc12細(xì)胞內(nèi)ros水平。pc12細(xì)胞經(jīng)10μm的ws13、依達(dá)拉奉、或tbhq預(yù)保護(hù)24h，隨后經(jīng)雙氧水處理5h，胞內(nèi)ros水平由流式細(xì)胞儀測(cè)定。

圖4ws13直接清除ros，并激活nrf2核轉(zhuǎn)位。(a):dpph清除實(shí)驗(yàn)。tbhq、依達(dá)拉奉或ws13的濃度為10μm。(b):nrf2核轉(zhuǎn)位。pc12細(xì)胞經(jīng)10μm的tbhq、依達(dá)拉奉或ws13孵育6h，隨后用nrf2抗體和dapi染色，用熒光顯微鏡觀(guān)察并拍照。

圖5ws13通過(guò)誘導(dǎo)gclc的表達(dá)起到對(duì)細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用。(a):ws13誘導(dǎo)gclc的mrna轉(zhuǎn)錄。pc12細(xì)胞用不同濃度ws13(2.5，5，10μm)、tbhq(10μm)、依達(dá)拉奉(10μm)孵育24h，隨后用rt-pcr評(píng)價(jià)gclc的mrna水平。每個(gè)柱條為三次實(shí)驗(yàn)的平均值和誤差值(與dmso組相比，*p<0.05)。(b):ws13誘導(dǎo)gclc蛋白的表達(dá)。pc12細(xì)胞經(jīng)ws13(2.5，5，10μm)、tbhq(10μm)孵育24h，westblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)gclc的表達(dá)情況。(c):gclc抑制劑bso抑制了ws13對(duì)雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。pc12細(xì)胞經(jīng)gclc抑制劑bso孵育2h，隨后經(jīng)10μm的ws13、tbhq或依達(dá)拉奉孵育24h，最后用mtt法檢測(cè)細(xì)胞生存率。每個(gè)柱條為三次實(shí)驗(yàn)的平均值和誤差值(#p<0.05，與雙氧水組相比；*p<0.05，與不加bso組相比)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明在以下的實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明。這些實(shí)施例只是為了說(shuō)明的目的，而不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1化合物的合成。

合成路線(xiàn)見(jiàn)圖1。將10mmol環(huán)戊酮和嗎啡啉溶于20ml的環(huán)己烷中，90℃下回流5-6h后，用tlc檢測(cè)反應(yīng)的進(jìn)程。反應(yīng)完后，減壓旋干溶劑后加20ml乙醇復(fù)溶，隨后加入15mmol的3,4,5-三甲氧基苯甲醛，78℃回流0.5-1.5h，tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后用1m的鹽酸水溶液室溫調(diào)ph值至2-3。靜置析出沉淀，抽濾，真空干燥過(guò)夜后得不飽和酮中間體。中間體與當(dāng)量的水合肼溶于乙醇，78℃回流2h得環(huán)化中間體。1mmol的環(huán)化中間體與當(dāng)量的酰氯溶于thf，經(jīng)et3n催化冰浴2h得目標(biāo)產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱色譜純化后純度均大于98％。在合成的所有化合物中，藥理活性差別很大，有代表性的化合物及其理化性質(zhì)如下所述：

有效化合物ws13：1-(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2,3,5,6-tetrahydrocyclopenta[c]pyrazol-1(4h)-yl)propa-1-one:yellowpower,81.1％yield,mp132.3-135.7℃.¹h-nmr(cdcl3),δ:8.132(d,j＝15.6hz,1h,h-β),7.926(d,j＝8.4hz,2h,h-2’,h-6’),7.733(d,j＝9.6hz,1h,h-6),7.490(d,j＝15.6hz,1h,h-α),7.431(d,j＝9hz,1h,h-3),7.307(m,1h,h-5),7.302(m,1h,h-3),6.700(d,j＝8.4hz,2h,h-3’,h＝5’),4.190(brs,2h,nh2-4’).esi-msm/z:332.2,333.1(m+h)⁺,calcdforc18h24n2o4:332.17.

對(duì)比用無(wú)效化合物ws9：3-chloro-1-(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2,3,5,6-tetrahydrocyclopenta[c]pyrazol-1(4h)-yl)propan-1-one：orangeyellowpowder,38.4％yield,mp123.3～125.6℃.¹h-nmr(600mhz,d-dmso),δ:6.523(s,2h,ar²-h,ar⁶-h),4.952(d,j＝8.4hz,1h,n-ch),3.822(t,j＝10.8hz,2h,ch2-cl),3.739(s,6h,ar³-och3,ar⁵-och3),3.629(s,3h,ar⁴-och3),3.182(t,j＝13.2hz,2h,c＝o-ch2),2.069～2.028(m,2h,ar^3’-h),2.001～1.968(m,2h,ar^5’-h),1.509(m,2h,ar^4’-h).lc-msm/z:366.1,367.1(m+h)⁺,calcdforc18h23cln2o4:366.13.具體結(jié)構(gòu)式如下：

對(duì)比用無(wú)效化合物ws5：cyclohexyl(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2,3,5,6-tetrahydrocyclopenta[c]pyrazol-1(4h)-yl)methanone：khakipower,63.2％yield,mp105.1～108.5℃.¹h-nmr(600mhz,d-dmso),δ:6.236(s,2h,ar²-h,ar⁶-h),5.462(d,j＝10.8hz,1h,n-ch),3.702(s,6h,ar⁴-och3,ar⁵-och3),3.622(s,3h,ar³-och3),3.013(t,j＝15.6hz,2h,3’-h,5’-h),2.274～2.217(m,1h,c＝o-ch),1.988～1.939(m,2h,4’-h),1.726～1.578(dt,4h,ar^2’-h,ar^6’-h),1.402～1.232(dt,4h,ar^3’-h,ar^5’-h),0.647～0.576(m,2h,ar^4’-h).lc-msm/z:386.2,387.1(m+h)⁺,calcdforc22h30n2o4:386.22.具體結(jié)構(gòu)式如下：

實(shí)施例2ws13對(duì)h2o2誘導(dǎo)的pc12細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。

以5000個(gè)/孔的細(xì)胞密度在96孔板接種pc12細(xì)胞，培養(yǎng)箱過(guò)夜。ws系列化合物(10μm)、tbhq(10μm)、或依達(dá)拉奉(10μm)孵育24h。隨后h2o2(440μm)刺激，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。最后用mtt法染色，酶標(biāo)儀測(cè)od值，計(jì)算細(xì)胞生存率。由圖2所示的結(jié)果顯示，與溶劑dmso組相比，加雙氧水后能明顯抑制細(xì)胞的生存。本發(fā)明的有效化合物ws13能夠明顯提高雙氧水存在條件下的細(xì)胞生存率，而對(duì)比化合物ws5和ws9無(wú)此活性。具體而言，ws13具有優(yōu)于依達(dá)拉奉，等同tbhq的細(xì)胞生存保護(hù)活性。此外，ws13表現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，隨給藥劑量增加，對(duì)雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用明顯提升。

實(shí)施例3ws13清除pc12細(xì)胞內(nèi)ros并抑制細(xì)胞凋亡。

以40萬(wàn)個(gè)/孔的細(xì)胞密度在6孔板接種pc12細(xì)胞，培養(yǎng)箱過(guò)夜。細(xì)胞經(jīng)tbhq(10μm)、依達(dá)拉奉(10μm)、或ws13(2.5,5,10μm)預(yù)處理24h,隨后雙氧水(440μm)刺激，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。用不含edta的胰酶消化，收集細(xì)胞。經(jīng)annexin-v與pi分別染色，由流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果見(jiàn)圖3，h2o2能明顯誘導(dǎo)pc12細(xì)胞凋亡，而ws13可明顯地抑制h2o2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，上調(diào)細(xì)胞的生存率(圖3a)。接種pc12細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后用ws13(10μm)、tbhq(10μm)、或依達(dá)拉奉(10μm)孵育24h，隨后h2o2刺激5h。移除培養(yǎng)基，加入含1/1000濃度dcfh探針的無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基，染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)，檢測(cè)pc12細(xì)胞胞內(nèi)ros水平。結(jié)果顯示，h2o2能明顯誘導(dǎo)pc12細(xì)胞ros水平的上升，而10μm的ws13能明顯清除胞內(nèi)ros，其活性與依達(dá)拉奉或tbhq相當(dāng)(圖3b)。因此，ws13可以清除雙氧水誘導(dǎo)pc12細(xì)胞ros的生成，抑制雙氧水誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

實(shí)施例4ws13具有雙重抗氧化機(jī)制。

為了考察ws13的抗氧化機(jī)制，我們檢測(cè)了ws13對(duì)自由基dpph的清除活性和誘導(dǎo)nrf2核轉(zhuǎn)位的活性。結(jié)果見(jiàn)圖4。以10μm濃度的ws13進(jìn)行體外dpph清除實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示ws13具有一定的直接清除自由基dpph的活性，但其活性低于對(duì)照依達(dá)拉奉或tbhq(圖4a)。以30萬(wàn)個(gè)/孔細(xì)胞密度接種pc12細(xì)胞于6孔板(含載玻片)，過(guò)夜培養(yǎng)后，加入依達(dá)拉奉、tbhq或ws13(10μm)孵育6h。隨后多聚甲醛固定細(xì)胞。經(jīng)dpai和nrf2抗體依次孵育，熒光顯微鏡觀(guān)察，選取合適視野拍照，檢測(cè)nrf2核轉(zhuǎn)位效果。結(jié)果顯示，ws13能夠明顯增加nrf2的核轉(zhuǎn)位水平，效果優(yōu)于依達(dá)拉奉或tbhq(圖4b)。以上結(jié)果提示，ws13既具有直接清除自由基，也具有激活抗氧化信號(hào)通路nrf2的功能，因此ws13可能通過(guò)直接清除自由基和激活抗氧化信號(hào)通路的雙機(jī)制起到抗氧化作用，從而起到對(duì)雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

實(shí)施例5ws13通過(guò)誘導(dǎo)gclc的表達(dá)起到對(duì)細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用。

nrf2通路下游蛋白的表達(dá)變化可以直接反應(yīng)藥物對(duì)nrf2通路的激活情況，因此研究了ws13對(duì)nrf2通路下游蛋白gclc的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖5。pc12細(xì)胞用藥物孵育24h后，與對(duì)照依達(dá)拉奉或tbhq一樣，ws13可明顯上調(diào)gclc的mrna的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，在ws13的濃度(2.5,5,10μm)遞增時(shí)，其誘導(dǎo)mrna的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性(圖5a)。進(jìn)一步用westblotting測(cè)定了藥物對(duì)gclc蛋白表達(dá)水平的影響，ws13在2.5μm濃度下就可以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，在10μm濃度下表現(xiàn)出與tbhq相當(dāng)?shù)幕钚?圖5b)。因此，ws13可以明顯誘導(dǎo)pc12細(xì)胞中nrf2通路gclc蛋白的表達(dá)。

為了進(jìn)一步研究ws13對(duì)雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用是否是由于激活nrf2通路gclc蛋白表達(dá)后所導(dǎo)致，進(jìn)一步用gclc蛋白抑制劑bso進(jìn)行了研究(圖5c)。pc12細(xì)胞用bso孵育2h，隨后經(jīng)10μm的ws13、tbhq或依達(dá)拉奉孵育24h，再用mtt法檢測(cè)細(xì)胞生存率。由圖5c可知，ws13、tbhq或依達(dá)拉奉均對(duì)雙氧水誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，能夠明顯提高細(xì)胞生存率；bso加入后可以明顯抑制ws13、tbhq或依達(dá)拉奉對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。即加入gclc抑制劑bso后，ws13對(duì)pc12細(xì)胞的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)了，這也表明ws13確實(shí)是通過(guò)上調(diào)gclc的表達(dá)來(lái)執(zhí)行對(duì)細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用。