本發(fā)明涉及一種抽樣檢測方法，尤其是涉及一種基于DNA分子標(biāo)記的初烤煙葉品種純度抽樣檢測方法。
背景技術(shù)：
烤煙品種特色優(yōu)質(zhì)品種紅花大金元、K326、云系等深受卷煙工業(yè)企業(yè)的青睞，市場優(yōu)勢明顯。由于受利益驅(qū)使、毗鄰產(chǎn)區(qū)補(bǔ)貼政策、超產(chǎn)或減產(chǎn)等諸多因素的影響下，雜劣品種進(jìn)入收購環(huán)節(jié)和煙葉跨產(chǎn)區(qū)流動時(shí)有發(fā)生，產(chǎn)區(qū)煙葉品種純度波動真實(shí)存在。并且，隨著宏觀經(jīng)濟(jì)環(huán)境下行壓力加大，控?zé)煭h(huán)境日趨嚴(yán)厲，工業(yè)企業(yè)煙葉原料庫存高位運(yùn)行和原料定額采購，煙葉市場需求拐點(diǎn)顯現(xiàn)。已有部分工業(yè)企業(yè)提出對質(zhì)量特點(diǎn)不明顯、品種純度不穩(wěn)定、收購等級質(zhì)量不高的產(chǎn)區(qū)下調(diào)需求計(jì)劃。
目前，還缺少科學(xué)有效的收購和工商交接環(huán)節(jié)烤后煙葉品種純度抽樣檢測方法，品種的判定主要依據(jù)外觀形態(tài)特征和判斷者的經(jīng)驗(yàn)。但烤后煙葉的外觀形態(tài)受遺傳、環(huán)境、烘烤等因素的多重影響，并非是截然可辨的特征，特別是非正常氣候和生產(chǎn)條件下的煙葉外觀形態(tài)較為混雜，變化規(guī)律復(fù)雜，容易引起誤判，判定準(zhǔn)確率較低。
烤煙國標(biāo)是目前分級、交售、收購、工商交接唯一可執(zhí)行的強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)?？緹焽鴺?biāo)(GB2635-92)7.1.2和8.2.1中規(guī)定了抽樣數(shù)量，但從成本和時(shí)效性上考慮對于DNA分子標(biāo)記品種檢測顯然無法抽取如此大樣品數(shù)量進(jìn)行逐一檢測。烤煙收購和工商交接工作中唯一可執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)為烤煙國標(biāo)GB2635-92。烤煙國標(biāo)中7.1.2和8.2.1中規(guī)定了抽樣數(shù)量，但對于DNA分子標(biāo)記檢測這類成本較高的檢測方法，樣本抽樣數(shù)量過大不具有現(xiàn)實(shí)可行性。
由此可見，現(xiàn)有的烤煙的抽樣檢測方法存在著抽樣量大，檢測效果差，效率低，成本高的缺陷，亟待進(jìn)一步改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供基于DNA分子標(biāo)記的初烤煙葉品種純度檢測方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的問題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種基于DNA分子標(biāo)記的初烤煙葉品種純度抽樣檢測方法，其包括以下步驟：
步驟A：針對不同烤煙品種，進(jìn)行親本的SSR引物篩選，篩選出不同品種間有差異的SSR引物；
步驟B：根據(jù)產(chǎn)煙區(qū)和待抽檢煙葉的量，確定抽檢批次；
步驟C：從每批次的樣品中隨機(jī)抽取100片初烤煙葉，重復(fù)取樣3次，總共取樣數(shù)量為300片，重復(fù)樣品用于補(bǔ)缺檢測或復(fù)檢；
步驟D：提取步驟C中的樣品初烤煙葉的基因組DNA；
步驟E：對所述樣品初烤煙葉的基因組DNA進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)；
步驟F：利用被檢測的樣品初烤煙葉品種的SSR引物進(jìn)行PCR檢測；
步驟G：對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測；
步驟H：對檢測的結(jié)果進(jìn)行分析計(jì)算，確定品種純度合格率。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟B中，抽檢批次應(yīng)覆蓋所有產(chǎn)煙區(qū)，抽檢的批次按照2萬擔(dān)/批次進(jìn)行抽取，產(chǎn)量低于2萬擔(dān)的產(chǎn)煙區(qū)，不少于1批次。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟D中，所述基因組DNA提取的步驟如下：
步驟D1：對抽取的樣品初烤煙葉烘干，并研磨粉碎至煙葉粉末；
步驟D2：取所述煙葉粉末70-100mg，并加入300-500μl裂解液，65℃水浴10-30min，加入100-200μl提取液，室溫放置2-10min，12000r/min離心8-15min，取上清液加入96孔深孔板；
步驟D3：利用BioMek NXp自動化工作站進(jìn)行DNA提??；
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟E中，通過紫外吸收法對所提取的DNA進(jìn)行檢測，當(dāng)在260nm處有明顯的吸收峰時(shí)，所述DNA質(zhì)量合格。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟F中，SSR標(biāo)記PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：
10×PCR buffer，1.25μl；
dNTP，0.2μl；
TaqDNA polymerase，0.2μl；
滅菌水，6.95μl；
正向引物，0.2μl；
反向引物，0.2μl；
模板DNA，1μl。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟F中，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min后，進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min，35個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，16℃保存。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟G中，所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行檢測。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟H中，對檢測的結(jié)果進(jìn)行分析計(jì)算時(shí)，品種純度合格率＝抽檢合格批次/抽檢總批次×100％。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述烤煙品種為紅花大金元、K326、云系。
本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明利用DNA分子標(biāo)記進(jìn)行初烤煙葉品種純度鑒定，通過BioMek NXp(Beckman)自動化工作站與磁珠法植物DNA提取試劑盒相結(jié)合的批量提取初烤煙葉的DNA，結(jié)合PCR和電泳體系，將整個(gè)檢測周期縮短到半個(gè)工作日，大大提高了檢測的效率。本發(fā)明對被抽檢初烤煙葉抽樣時(shí)，抽樣量少，檢測準(zhǔn)確率高，檢測成本低，檢測時(shí)間短。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的一種基于DNA分子標(biāo)記的初烤煙葉品種純度抽樣檢測方法，只需要檢測較少數(shù)量的樣本就可以推斷一批樣本總體的品種純度，本發(fā)明的DNA分子標(biāo)記的初烤煙葉抽樣檢測方法包括以下步驟：
步驟A：針對不同烤煙品種，進(jìn)行親本的SSR引物篩選，篩選出不同品種間有差異的SSR引物。其中，該烤煙品種為紅花大金元、K326、云系。
步驟B：根據(jù)產(chǎn)煙區(qū)和待抽檢煙葉的量，確定抽檢批次，抽檢批次應(yīng)覆蓋所有產(chǎn)煙區(qū)，抽檢的批次按照2萬擔(dān)/批次進(jìn)行抽取，產(chǎn)量低于2萬擔(dān)的產(chǎn)煙區(qū)，不少于1批次。
步驟C：從每批次的樣品中抽取100片初烤煙葉，重復(fù)取樣3次，總共取樣數(shù)量為300片，重復(fù)樣品用于補(bǔ)缺檢測或復(fù)檢。
步驟D：提取樣品初烤煙葉的基因組DNA，該初烤煙葉的基因組DNA提取的步驟如下：
步驟D1：對抽取的初烤煙葉樣品進(jìn)行低溫烘干，溫度小于18℃，然后研磨烘干后的初烤煙葉粉碎至煙葉粉末。
步驟D2：取所述煙葉粉末70-100mg，并加入300-500μl裂解液，65℃水浴10-30min，加入100-200μl提取液，室溫放置2-10min，12000r/min離心8-15min，取上清液加入96孔深孔板；
步驟D3：利用BioMek NXp自動化工作站進(jìn)行DNA提取；
步驟E：對所述初烤煙葉的基因組DNA進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，通過紫外吸收法對提取的DNA進(jìn)行檢測，當(dāng)在260nm處有明顯的吸收峰時(shí)，表明該DNA質(zhì)量合格。
步驟F：利用被檢測的樣品初烤煙葉品種的SSR引物，進(jìn)行PCR檢測；SSR標(biāo)記PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10×PCR buffer(with 25mM Mg2+)1.25μl；dNTP(2mM)0.2μl；TaqDNA polymerase(5U/μl)0.2μl；滅菌水6.95μl；正向引物(10μM/L)0.2μl；反向引物(10μM/L)，0.2μl；模板DNA(50ng/μl)1μl。PCR反應(yīng)結(jié)束后，在10μl PCR產(chǎn)物中加入2μl上樣緩沖液(0.25％溴酚藍(lán)+0.25％二甲苯青+40％蔗糖水溶液)混勻備用(電泳)。
步驟G：利用被檢測的樣品初烤煙葉品種的SSR引物，對PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min后，進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min，35個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，16℃保存。
本發(fā)明的PCR產(chǎn)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，其采用Bio-Rad PowerPAC3000和北京六一廠DYY-6C型電泳儀和北京六一儀器廠DYCZ-30/28B和DYCZ-28A型電泳槽進(jìn)行。其中DYCZ-30/28B型電泳槽用來分離常規(guī)PCR產(chǎn)物片段，DYCZ-28A型電泳槽用于分離經(jīng)DYCZ-30/28B電泳后不能明顯進(jìn)行觀察讀帶的PCR產(chǎn)物片段。用廢棄的瓊脂糖凝膠放置于微波爐中融化，將烘干并擦拭干凈的電泳槽玻璃板裝好密封膠條后，用融化的瓊脂糖凝膠封底，封2次最佳，待瓊脂糖凝膠凝固后，小心地將玻璃板裝入電泳槽中并擰緊電泳槽兩側(cè)的螺絲旋鈕。根據(jù)PCR產(chǎn)物的分子量，按上述配方配制10％或8％聚丙稀酰胺凝膠混液，搖勻后將膠液小心灌入電泳槽玻璃板的縫隙中，檢查是否有氣泡，并插好梳子。待膠凝固約半小時(shí)后，向電泳槽中加入足量的0.5×TBE緩沖液，預(yù)電泳10min。預(yù)電泳結(jié)束后，吸取每份樣品1.5-2.0μl上樣，350V恒壓電泳，電泳時(shí)間自行控制，一般待二甲苯青指示劑移至膠底部2/3時(shí)，終止電泳。
對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳完畢后進(jìn)行銀染，銀染的具體步驟如下：
步驟A：電泳完畢后，首先往染色托盤中倒入足量固定液，以淹沒所有膠板為標(biāo)準(zhǔn)，小心剝?nèi)【郾□０纺z，打孔標(biāo)記后放入盛有固定液的托盤，置于搖床上輕輕搖動固定6分鐘。
步驟B：固定完畢后，將固定液倒入回收瓶，放入適量AgNO3染色液至浸沒所有聚丙稀酰胺凝膠板，放置于搖床上輕輕搖動染色12分鐘。
步驟C：染色完畢后，將AgNO3染色液倒入回收瓶，向染色托盤中快速放入漂洗液，用手輕搖染色托盤漂洗半分鐘，重復(fù)兩次，計(jì)時(shí)從漂洗液倒入那一刻開始。
步驟D：然后倒凈漂洗液，快速倒入預(yù)先配好的顯色液，置于搖床上輕輕搖動直至顯現(xiàn)出清晰譜帶。
步驟E：待顯色完全后，用去離子水漂凈殘余的顯色液后放入保存液或立即進(jìn)行觀察。
步驟H：對檢測的結(jié)果進(jìn)行分析計(jì)算，品種純度合格率＝抽檢合格批次/抽檢總批次×100％。
本發(fā)明基于DNA分子標(biāo)記的初烤煙葉品種純度抽樣檢測方法，其數(shù)學(xué)模型為：
假設(shè)某批煙葉含有其他品種煙葉的片數(shù)的百分比為p，每片煙葉為該品種或者為其它混雜品種，那么該批煙葉的品種純度為1-p。由于混雜其他品種煙葉的概率為p，所以任取一片取得其他品種煙葉片數(shù)X服從“0-1”分布即
P(X＝x)＝px(1-p)1-x，x＝0或1，現(xiàn)從總體某批煙葉中抽取樣本容量為n的樣本X1，X2，…Xn，則當(dāng)n較大時(shí)，由中心極限定理可知，隨機(jī)變量
近似服從正態(tài)分布Yn～N(0,1)。
若樣本中檢出混雜品種的片數(shù)為m，則樣本平均值用此來估計(jì)總體的混雜率，設(shè)定置信概率為1-α，則有
由不等式得該式可改寫成ap2+bp+c<0，其中xi＝0或1(i＝1，2，…，n)，因此于是有
設(shè)二次三項(xiàng)式ap2+bp+c的兩個(gè)實(shí)根為
則混雜率p的置信概率為100(1-α)％的置信區(qū)間為
進(jìn)一步的，本發(fā)明對初烤煙葉抽樣檢測的結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)采用序貫抽樣檢驗(yàn)方案，參照其它農(nóng)產(chǎn)品以煙葉品種純度達(dá)到95％合格為理論參數(shù)，即p＝5％，論證本抽樣方案。
當(dāng)?shù)谝粯颖緮?shù)量為30時(shí)，此樣本中有很大可能全為真實(shí)品種(由概率統(tǒng)計(jì)理論知，在同樣的可靠性和精確度下，樣本越小，合格的允許樣本混雜其它品種概率越小，即混雜其它品種被控制越嚴(yán))，沒有混雜品種，此時(shí)可以求出樣品中混雜率的置信上限可以推斷出其總體的混雜率為(0，)區(qū)間內(nèi)。設(shè)置信概率(1-α)＝90％，查得zα＝1.282，當(dāng)p＝0.05，n＝30，m＝0時(shí)a＝n+zα＝30+1.2822＝31.643，-b＝1.2822＝1.643，c＝0，即若抽取n＝30片煙葉，經(jīng)分子標(biāo)記檢測，若未檢出其它品種葉片可以有90％的把握確定該批煙葉的混雜率在0-5.19％之間。
其余情況該批煙葉的混雜率的推斷詳見表1，計(jì)算方法與舉例置信區(qū)間的推斷方法相同。表1中不合格批次的判定是指如果達(dá)到相應(yīng)的累計(jì)抽樣數(shù)，其中混其他品種的片數(shù)達(dá)到表格中的閾值即判定該批次煙葉不合格。
例如從某批次煙葉中抽取30片煙葉進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，如果該批次檢出其它品種的片數(shù)大于等于4片，則該批次煙葉判定為不合格批次，并且有80％的把握認(rèn)為該批煙葉的品種混雜率的區(qū)間為(7.26％，23.22％)。
因?yàn)閦α＝1.282，即P(7.26％＜p＜23.22％)＝80％。
本發(fā)明采用80％的置信概率作為品種純度不合格煙葉批次的判定是合適的，由于正態(tài)分布的對稱性，有10％的批次的混雜率小于7.26％，還有10％的批次混雜率大于23.22％，也就是說有不到10％的可能，這批煙葉仍為品種純度合格煙葉。換而言之，如果30片樣本中一旦出現(xiàn)4片其他品種的煙葉，就把它判定為不合格，那么錯(cuò)判的概率小于10％，該批次煙葉品種純度真實(shí)不合格的概率大于90％。如果30片樣本中出現(xiàn)5，6，7…片那么該批次煙葉品種純度判定為不合格，如混雜其他品種的片數(shù)在1～3片之間，則再抽檢30片進(jìn)行檢驗(yàn)，對應(yīng)表1中的累計(jì)抽樣數(shù)70中閥值進(jìn)行判定，依次類推。
最大抽樣數(shù)的決定，在實(shí)際檢驗(yàn)過程中很可能會出現(xiàn)多次檢驗(yàn)均未達(dá)到判定閾值的情況，即累計(jì)的混雜片數(shù)總是介于序貫抽樣表所列的上下限之間而難以確定其混雜率，使檢驗(yàn)不能終止。因此，需要計(jì)算最大抽樣數(shù)nmax來終止抽樣過程，以累計(jì)抽樣片數(shù)最接近判定閾值的界限作為結(jié)論。根據(jù)Karandinos提出的nmax＝t2Pt(1-Pt)/d2可以計(jì)算出最大抽樣數(shù)。其中nmax為最大抽樣數(shù)；t＝1.96，即90％置信水平下的正態(tài)離差值；P＝0.05，即為混雜率；d＝0.05為允許誤差值。因此，nmax＝t2Pt(1-Pt)/d2＝1.9620.05(1-0.05)/0.052＝72.99
表1序貫抽樣參考表
“--”代表此項(xiàng)為空
本發(fā)明利用DNA分子標(biāo)記進(jìn)行初烤煙草品種純度檢測，并且基于BioMek NXp(Beckman)自動化工作站與磁珠法植物DNA提取試劑盒相結(jié)合的批量提取初烤煙葉DNA，結(jié)合PCR和電泳體系，將整個(gè)檢測周期縮短到半個(gè)工作日，大大提高了檢測的效率。本發(fā)明基于DNA分子標(biāo)記的初烤煙葉品種純度檢測抽樣方法，其抽樣量少，檢測準(zhǔn)確率高，成本低，時(shí)間短。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許簡單修改、等同變化或修飾，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。