本發(fā)明涉及一種葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21的應(yīng)用，同時(shí)還涉及包含VvPUB21基因的表達(dá)載體及其應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)泛素化廣泛地參與植物防御調(diào)節(jié)，蛋白泛素化修飾過(guò)程的關(guān)鍵酶是泛素連接酶E3，它決定了底物蛋白的特異性識(shí)別，涉及植物-病原菌互作，包括早期的防御反應(yīng)、基因?qū)虻幕プ骱驼T導(dǎo)性抗病。U-box蛋白是一種新型的E3蛋白，具有E3活性。研究發(fā)現(xiàn)U-box蛋白廣泛存在于真菌、植物、動(dòng)物中，在目前已鑒定出的真核生物U-box蛋白中，植物U-box(plant U-box protein，PUB)蛋白的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他生物。目前在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)六十多個(gè)PUB蛋白，并證實(shí)了有的PUB蛋白與植物防御病原物的侵染反應(yīng)有關(guān)，如擬南芥中PUB22、PUB23和PUB24等3個(gè)U-box型E3連接酶的表達(dá)能被flg22型PAMP(Pathogen-associated molecular pattern)所誘導(dǎo)(Trujillo M等，2008，Current Biology 18(18):1396-1401)。在病原菌的侵襲下，PUB 22/23/24三突變體活性氧的產(chǎn)生比野生型明顯提高，也能明顯抑制病原菌的生長(zhǎng)。與此相一致的是，活性氧產(chǎn)生相關(guān)基因在三突變體材料中也明顯受誘導(dǎo)。在三突變體材料中，其他的PAMP，如elf18和幾丁質(zhì)等也能引起活性氧迸發(fā)。這些結(jié)果表明，植物中PUB22、PUB23和PUB24等E3連接酶是PAMPs激活PTI(PAMP-triggered immunity)下游信號(hào)因子所必需，證明了PUB22、PUB23和PUB24是植物抵抗病原菌侵入的抗病相關(guān)基因。

然而，目前泛素連接酶基因尤其是大多數(shù)新型的U-box蛋白基因在植物抗病反應(yīng)中作用仍不是很清楚。本發(fā)明涉及的VvPUB21基因是葡萄單亞基U-box家族泛素連接酶家族成員之一。通過(guò)對(duì)葡萄U-box基因家族進(jìn)行篩選和鑒定，驗(yàn)證了VvPUB21基因受葡萄多種病原菌的誘導(dǎo)表達(dá)。因此，對(duì)葡萄VvPUB21基因的開(kāi)發(fā)是研究植物抗病的新途徑，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)基因改良葡萄抗病性弱的品種及其他植物品種，將進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗病性，拓寬植物的抗譜，對(duì)于培育植物抗病新品種具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21在增強(qiáng)植物抗病性中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種植物超量表達(dá)載體。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種植物超量表達(dá)載體在增強(qiáng)植物抗病性中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21在增強(qiáng)植物抗病性中的應(yīng)用，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，長(zhǎng)度1820bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)從第108～1442位堿基，它所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(終止密碼子不翻譯)，該蛋白質(zhì)的分子量為50.27，等電點(diǎn)為8.92，在C末端含有一個(gè)U-box保守結(jié)構(gòu)域。

具體的，葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21在增強(qiáng)植物抗病性中的應(yīng)用，包括以下步驟：

1)將葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21連接到表達(dá)載體中，構(gòu)建植物超量表達(dá)載體；

2)取植物超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)染農(nóng)桿菌，再轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中，即可。

一種植物超量表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有如SEQ ID NO：1所示的葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21的開(kāi)放閱讀框。

具體的，所述表達(dá)載體為pCAMBIA3301-VvPUB21，其制備步驟如下：

(1)以葡萄cDNA為模板，P1、P2為引物，PCR擴(kuò)增得到VvPUB21基因的開(kāi)放閱讀框，將擴(kuò)增片段連接到pMD19-T克隆載體上，篩選得到陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T-VvPUB21；

正向引物P1：5’-GGGAGATCTATGATTTCTTCTTGGAGAAGGCGGAG-3’，

反向引物P2：5’-GGGGGTGACCTCAAAAAGGCCTTTTGAGATCCTTG-3’；

P1下劃線(xiàn)處為酶切位點(diǎn)Bgl II，P2下劃線(xiàn)處為酶切位點(diǎn)BstE II；

(2)用Bgl II、BstE II分別雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T-VvPUB21和植物表達(dá)載體pCAMBIA3301，回收目標(biāo)片段與線(xiàn)性化載體，連接、轉(zhuǎn)化后篩選、驗(yàn)證，即得。

上述植物超量表達(dá)載體(即含有如SEQ ID NO：1所示葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21的開(kāi)放閱讀框的表達(dá)載體)在增強(qiáng)植株抗病性中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明為增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性提供了一種新的基因VvPUB21。通過(guò)分離克隆葡萄葉片中VvPUB21基因的DNA片段，與能夠超量表達(dá)該目標(biāo)基因的載體連接，轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞，通過(guò)超量表達(dá)VvPUB21基因改良植物對(duì)病原菌的抗性，控制病害的發(fā)生，減少或避免植物病害所帶來(lái)的損失。同時(shí)，本發(fā)明開(kāi)發(fā)的VvPUB21基因也為植物抗病拓寬了植物的抗譜，克服了傳統(tǒng)育種不能植物種間轉(zhuǎn)移抗病相關(guān)基因的問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1為葡萄葉片接種白粉菌后不同時(shí)間VvPUB21基因的表達(dá)量變化；

圖2為VvPUB21基因轉(zhuǎn)化擬南芥植株抗病性的鑒定；

圖3為VvPUB21基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化葡萄葉片后抗病性的鑒定。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1

葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21的分離克隆，具體方法如下：

1)采用SDS/酚法提取葡萄葉片總RNA，操作如下：

準(zhǔn)備提取液：向2.0mL離心管中加入850μL提取緩沖液(140mM LiCl，10mM EDTA，10mM Tris，5％(w/v)SDS，2％(w/v)PVP)與30μLβ-巰基乙醇，充分混勻，待用。

用液氮預(yù)冷研缽，取0.2g葡萄幼嫩葉片于研缽中，加適量液氮充分研磨后，分裝至含有預(yù)先準(zhǔn)備提取液的2.0mL離心管中，充分渦旋混勻，4℃條件下12000rpm離心5min；吸取上清液至另一2.0mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)，充分渦旋混勻，4℃條件下12000rpm離心15min；吸取上清液至另一2.0mL離心管中，加入1/3體積5M的KAc(pH4.8)，充分渦旋混勻，4℃條件下12000rpm離心10min；吸取上清液至另一2.0mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)，充分渦旋混勻，4℃條件下12000rpm離心10min；吸取上清液至另一1.5mL離心管中，加入1/3體積8M LiCl，充分渦旋混勻，-20℃放置2h以上，然后4℃條件下12000rpm離心15min；輕輕地除去上清液，用800μL 75％乙醇洗滌沉淀兩次(4℃條件下12000rpm離心8min)；空氣中干燥10min，待乙醇充分揮發(fā)，加入30μL DEPC-H₂O溶解沉淀，即得葡萄葉片總RNA。

2)純化總RNA

在1.5mL離心管中加入：總RNA 100μg，DNase I 10U，10×DNase buffer 10μL，RNasin 100U，DEPC-H₂O補(bǔ)齊至100μL，充分混勻，37℃溫育30min；加入等體積的酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)，充分渦旋混勻，4℃條件下12000rpm離心10min；吸取上清液至另一1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)，充分渦旋混勻，4℃條件下12000rpm離心10min；吸取上清液至另一2ml離心管中，加入1/10體積3M NaAC(pH 5.2)，2.5倍體積無(wú)水乙醇，-20℃放置2h以上；然后4℃條件下12000rpm離心15min；輕輕地除去上清液，用800μL 75％乙醇洗滌沉淀兩次(4℃條件下12000rpm離心8min)；空氣中干燥10min待乙醇充分揮發(fā)，加入20μL DEPC-H₂O溶解沉淀，即完成RNA純化。

3)以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈

在PCR管中加入：Random 6mers(50μM)1μL，dNTP Mixture(10mM each)1μL，Total RNA 2μg，RNase free dH₂O補(bǔ)齊至10μL，充分混勻，瞬時(shí)離心使溶液至PCR管底部。在PCR儀上65℃反應(yīng)5min，冰上急冷；在PCR管中加入： Buffer 4μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL， RTase(200U/μL)1μL，RNase Free dH₂O補(bǔ)齊至20μL。在PCR儀上進(jìn)行下述反應(yīng)：30℃，10min；42℃，60min；95℃，5min；4℃，保存；反轉(zhuǎn)錄完成后即得cDNA第一鏈；-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4)以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增

PCR克隆VvPUB21基因的PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1μL，正、反向引物P3、P4各2μL，PCR Buffer 5μL，dNTP Mix 2.5μL，DNA Polymerase 1.0μL，PCR-Grade Water補(bǔ)齊至50μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30sec，94℃30sec，56℃30sec，72℃3min，30cycles，72℃10min，4℃Forever；

正向引物P3：5’-GGGGATCATCAGTTTATTCAATTGTTG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物P4：5’-TCGGCCTCAACATGACACAGATTGAT-3’(SEQ ID NO:4)。

5)檢測(cè)與回收

將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，回收目標(biāo)片段，連接至pMD19-T載體，連接反應(yīng)體系為：pMD19-T載體0.5μl，Solution I 2.5μL，目標(biāo)片段2.0μL，充分混勻，在16℃條件下反應(yīng)2h轉(zhuǎn)化，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10細(xì)胞，在附加100mg/L Amp培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆接種至LB液體培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒得陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T-VvPUB21，送公司測(cè)序檢測(cè)，VvPUB21基因序列如SEQ ID NO:1所示。

實(shí)施例2

葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21超量表達(dá)載體的構(gòu)建，具體方法如下：

以葡萄葉片cDNA為模板，以P1、P2為引物，P1下劃線(xiàn)處為酶切位點(diǎn)Bgl II，P2下劃線(xiàn)處為酶切位點(diǎn)BstE II。PCR擴(kuò)增得到VvPUB21基因片段，連接至pMD19-T載體；連接反應(yīng)體系為：pMD19-T載體0.5μL，Solution I 2.5μL，目標(biāo)片段2.0μL，充分混勻，在16℃條件下反應(yīng)2h；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在附加Amp的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆接種至LB液體培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒得陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T-VvPUB21，送公司測(cè)序檢測(cè)。將正確序列進(jìn)行雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒4μL，Bgl II內(nèi)切酶0.5μL，BstE II內(nèi)切酶0.5μL，ddH₂O 15μL，充分混勻，37℃條件下反應(yīng)2h；酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

正向引物P1：5’-GGGAGATCTATGATTTCTTCTTGGAGAAGGCGGAG-3’(SEQ ID NO:5)；

反向引物P2：5’-GGGGGTGACCTCAAAAAGGCCTTTTGAGATCCTTG-3’(SEQ ID NO:6)。

用Bgl II、BstE II雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T-VvPUB21與植物表達(dá)載體pCAMBIA3301，回收目標(biāo)片段與線(xiàn)性化載體進(jìn)行連接；連接反應(yīng)體系為：pCAMBIA3301線(xiàn)性化載體5μL，Solution I 10μL，目標(biāo)片段5μL，充分混勻，16℃條件下反應(yīng)2h；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在附加卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑取陽(yáng)性克隆接種至LB液體培養(yǎng)基(含100mg/L的卡那霉素)中搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，送公司測(cè)序檢測(cè)，序列正確的質(zhì)粒命名為pCAMBIA3301-VvPUB21。將正確序列進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒4μL，Bgl II內(nèi)切酶0.5μL、BstE II內(nèi)切酶0.5μL，ddH₂O 15μL，充分混勻，在37℃條件下反應(yīng)2h；酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

實(shí)施例3

植物超量表達(dá)載體pCAMBIA3301-VvPUB21轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，具體方法如下：

電擊杯置于紫外燈下處理20min；取出農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化，融化后轉(zhuǎn)移至電擊杯中，并加入10μL質(zhì)粒，充分混勻，置于冰上5min；電擊杯轉(zhuǎn)移至電擊儀中進(jìn)行電擊處理；處理后將電擊杯中的轉(zhuǎn)化液取出至1.5mL的離心管中，加入1mL LB培養(yǎng)基，28℃條件下培養(yǎng)1h；離心機(jī)中瞬時(shí)離心15s，去除部分上清液，懸浮后涂布在含有抗生素(60mg/L的慶大霉素，100mg/L的卡那霉素)的平板上，置于28℃培養(yǎng)。挑取單克隆接種至有抗生素(60mg/L的慶大霉素，100mg/L的卡那霉素)的液體LB培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)24h，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)，得到陽(yáng)性克隆。

實(shí)施例4

植物超量表達(dá)載體pCAMBIA3301-VvPUB21轉(zhuǎn)化入植物，包括以下操作：

1)物超量表達(dá)載體pCAMBIA3301-VvPUB21轉(zhuǎn)化入擬南芥

將轉(zhuǎn)化植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-VvPUB21的農(nóng)桿菌接種至10mL LB液體培養(yǎng)基(含60mg/L的慶大霉素，100mg/L的卡那霉素)中，28℃培養(yǎng)24h；取5mL菌液轉(zhuǎn)移至50mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含60mg/L的慶大霉素和100mg/L的卡那霉素)，28℃繼續(xù)培養(yǎng)，至菌液OD₆₀₀達(dá)到0.6左右；將菌液轉(zhuǎn)移至離心瓶或離心管中，室溫條件下，轉(zhuǎn)速為4000rpm離心10min，去除上清液，收集菌體；重懸于滲透緩沖液(0.5×MS，5％蔗糖，0.03％Silwet L-77)，調(diào)OD₆₀₀至0.8；將擬南芥花序上已有的果莢去掉，花序完全浸入滲透液中20s(10～30s均可，或者用移液器直接將滲透液滴在花序上)，立即去掉擬南芥葉或莖稈上的滲透液，將植株平放在托盤(pán)中，用塑料薄膜覆蓋托盤(pán)，24h后取下薄膜，于溫室中繼續(xù)培養(yǎng)；為提高轉(zhuǎn)化效率，7天之后用同樣方法再次侵染；經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的擬南芥植株進(jìn)行正常管理，待果莢現(xiàn)白色時(shí)收獲種子；將收獲的轉(zhuǎn)基因種子用0.2％的TritonX-100浸泡10min；再用10％的次氯酸鈉表面消毒12min；滅菌水洗滌五次，每次2min；少量水將種子混合均勻，用藍(lán)色槍頭(去尖)將種子鋪在含除草劑(Basta，20mg/L)的MS(0.5×MS，1％蔗糖，1％瓊脂，pH 5.7)平板上，4℃黑暗培養(yǎng)兩天；然后轉(zhuǎn)移至22℃，光照16h培養(yǎng)。經(jīng)除草劑(Basta，20mg/L)篩選后仍然長(zhǎng)勢(shì)良好，真葉葉片及生長(zhǎng)點(diǎn)呈深綠色且根部伸扎入培養(yǎng)基的幼苗即可初步確定為轉(zhuǎn)基因植株，移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中繼續(xù)培養(yǎng)。

2)植物超量表達(dá)載體pCAMBIA3301-VvPUB21轉(zhuǎn)化入葡萄

將轉(zhuǎn)化植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-VvPUB21的農(nóng)桿菌接種至10mL LB液體培養(yǎng)基(含60mg/L的慶大霉素，100mg/L的卡那霉素)中，28℃培養(yǎng)24h；取5mL菌液轉(zhuǎn)移至50mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含60mg/L的慶大霉素和100mg/L的卡那霉素)，28℃繼續(xù)培養(yǎng)，至菌液OD₆₀₀達(dá)到0.6左右；將菌液轉(zhuǎn)移至離心瓶或離心管中，室溫條件下，轉(zhuǎn)速為4000rpm離心10min，去除上清液收集菌體；加入相同體積的滲透緩沖液(10mM MES pH5.6，10mM MgCl₂，2％(w/v)sucrose and 150mM acetosyringone)重懸；將葡萄葉片置于適量的重懸液中，置于水式真空循環(huán)泵中進(jìn)行抽真空處理，當(dāng)真空泵壓強(qiáng)指針為0.085MPa時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，30min后緩慢釋放氣體；將處理好的葡萄葉片取出，用滅過(guò)菌的濾紙除去葉片表面的菌液，將葉片遠(yuǎn)軸面朝上置于托盤(pán)中，葉柄用脫脂棉保濕，托盤(pán)用保鮮膜覆蓋，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

試驗(yàn)例

1、葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21在葡萄中的表達(dá)模式分析

為了證實(shí)VvPUB21基因參與抗病反應(yīng)的調(diào)控，采用熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)分析VvPUB21基因在葡萄葉片接種白粉菌后的表達(dá)模式。接種方法按照Wang的方法(Wang Y等，Vitis34:159-164)，SDS/酚法提取接種白粉菌后不同時(shí)間(0，12，24，36，48，60，72h)葡萄葉片的總RNA，按PrimeScript^TMRT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)(購(gòu)自TAKARA公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，7個(gè)不同時(shí)間的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為Real-time PCR模板，檢測(cè)葡萄VvPUB21基因?qū)ζ咸讶~片接種白粉菌后的響應(yīng)。Real-time PCR采用SYBR Premix Ex TMTaq II試劑盒(購(gòu)自TAKARA公司)，并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，在iCycler iQ5Real-time PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：模板1μL，SYBR Mix 12.5μL，正、反向引物各1μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)齊至25μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min，95℃30s，68℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，72℃5min，4℃10min。P5、P6為VvPUB21基因擴(kuò)增的正、反向引物，VvActin為內(nèi)參基因，P7、P8為VvActin基因擴(kuò)增的正、反向引物。

正向引物P5：5’-TGCTCTAACCATGCCTGTTC-3’(SEQ ID NO:7)；

反向引物P6：5’-CATTTTTGCTGAGCTTCCAA-3’(SEQ ID NO:8)。

正向引物P7：5’-TCCTGTGGACAATGGATGGA-3’(SEQ ID NO:9)；

反向引物P8：5’-CTTGCATCCCTCAGCACCTT-3’(SEQ ID NO:10)。

Thresh值按PCR儀默認(rèn)為30，分別記錄每個(gè)反應(yīng)熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)(threshold cycle，Ct)，然后用2^-△△Ct法以未接種白粉菌的葉片為對(duì)照，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)VvPUB21基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行規(guī)一化。結(jié)果顯示，VvPUB21基因在接種病原菌后12h表達(dá)量急劇增加，24h時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰，36～48h時(shí)表達(dá)量持續(xù)下降，48h表達(dá)量最低，隨后表達(dá)量又急劇增加，在60h時(shí)又達(dá)到高峰，隨后又呈下降趨勢(shì)(見(jiàn)圖1)。這說(shuō)明VvPUB21基因是受葡萄白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)的。

2、葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21抗病性的鑒定

1)葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21在擬南芥中抗病性鑒定

轉(zhuǎn)化的擬南芥T3代轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)60天后進(jìn)行抗病性鑒定。擬南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum UCSC1)接種在pad4突變體植株上進(jìn)行保存。選擇生長(zhǎng)一致的轉(zhuǎn)基因植株，按照Wang的方法(WangW等，2007，Molecular Plant-Microbe Interactions20:966-976)接種白粉菌。接種6天后檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株對(duì)白粉病的抗病性，采用Trypan blue染色法檢測(cè)細(xì)胞程序性死亡，結(jié)果如圖2所示，3個(gè)轉(zhuǎn)基因系相對(duì)于野生型更抗病，顯示較輕的感病癥狀；3個(gè)轉(zhuǎn)基因系植株葉片產(chǎn)生超敏反應(yīng)，野生型植株沒(méi)有或者產(chǎn)生輕微的超敏反應(yīng)；以上結(jié)果說(shuō)明超量表達(dá)VvPUB21基因?qū)е聰M南芥植株抗病性增強(qiáng)。圖2中WT為野生型，#1、#2、#4為3個(gè)轉(zhuǎn)基因系。

2)葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21在葡萄中抗病性鑒定

驗(yàn)證葡萄抗病相關(guān)基因VvSTS、VvPR1、VvPR10、VvNPR1在VvPUB21基因轉(zhuǎn)化入葡萄葉片后的表達(dá)情況。VvPUB21基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化葡萄葉片24h后，按照Wang的方法(Wang Y等，1995，Vitis34:159-164)接種白粉菌，接種完成后繼續(xù)培養(yǎng)24h。以對(duì)葡萄葉片噴水處理作為對(duì)照，提取轉(zhuǎn)化VvPUB21基因組與對(duì)照組葡萄葉片總RNA，用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)葡萄抗病相關(guān)基因VvSTS、VvPR1、VvPR10和VvNPR1的表達(dá)。以P9、P10為VvSTS基因擴(kuò)增的正、反向引物，P11、P12為VvPR1基因擴(kuò)增的正、反向引物，P13、P14為VvPR10基因擴(kuò)增的正、反向引物，P15、P16為VvNPR1基因擴(kuò)增的正、反向引物，內(nèi)參VvActin基因擴(kuò)增的引物與試驗(yàn)例1中相同。

正向引物P9：5'-GAAACGCTCAACGTGCCAAGG-3’(SEQ ID NO:11)；

反向引物P10：5'-GTAACCATAGGAATGCTATGTAGC-3'(SEQ ID NO:12)。

正向引物P11：5'-GGAGTCCATTAGCACTCCTTTG-3’(SEQ ID NO:13)；

反向引物P12：5'-CATAATTCTGGGCGTAGGCAG-3’(SEQ ID NO:14)。

正向引物P13：5'-CCAACCAATCCTCCTCCTCTTC-3’(SEQ ID NO:15)；

反向引物P14：5'-CATCTCCGTCAACCACAGTGTA-3’(SEQ ID NO:16)。

正向引物P15：5'-TCTCCGATTCCAACGACTTCAG-3’(SEQ ID NO:17)；

反向引物P16：5'-CATCATCAACGCACGCACAA-3’(SEQ ID NO:18)。

PCR反應(yīng)在iCycler iQ5Real-time PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)上進(jìn)行。以2-△△^Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖3所示，在接種白粉菌后，轉(zhuǎn)化的葡萄葉片中抗病相關(guān)基因VvSTS、VvPR1、VvPR10、VvNPR1相對(duì)于未轉(zhuǎn)化的葡萄葉片其表達(dá)量顯著增加(見(jiàn)圖3)，說(shuō)明轉(zhuǎn)化VvPUB21基因后葡萄葉片抗病相關(guān)基因表達(dá)量的上升，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)化植株的抗病性。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 河南科技大學(xué)

<120> 葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21及其植物表達(dá)載體和應(yīng)用

<170> PatentIn version 3.5

<211> 1820

<212> DNA

<213> 序列

<221> 葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21

<222> (1)..(1820)

<400> 1

GGGGATCATC AGTTTATTCA ATTGTTGAAC GCAAACCCAA CACCACAACT TGTAGATTTC 60

CTTCGTTTCC GAACTAATTA CCTAAATTTT CATACCGGTT ATTGGCAATG ATTTCTTCTT 120

GGAGAAGGCG GAGAGCTGGG CGGAGGGCAG CCAAGCTGCA GCAACACGCA GAAGATGATA 180

TTGGAAGCAT GGAATTGACT ACTCCTAATC ATTTTCGGTG TCCGATATCT CTGGACTTGA 240

TGAAAGATCC GGTTACATTG TCCACAGGGA TCACATATGA TCGTGAGAGC ATCGAGATGT 300

GGATTGAAGC CGGAAACCGG ACTTGCCCCA TTACCAACCA GGTGTTGAGG AGTCTGGAGC 360

CGATACCCAA TCACACAATT CGGAAGATGA TACAGGATTG GTGTGTCGAG AACCGGTCTT 420

TTGGGATTGA GAGGATCCCA ACGCCTCGAA TTCCTTTGAG TTCTGTCGAG GTTACAGATA 480

TACTTTCCAA GCTTAAGATG GCTTATCGGC GAGAGGATGA AGCTGGGTGC CGGGAGTTGG 540

TGGCAAAGAT GAAGTCAAAG GGGAAGGAAA GCGAGCGCAA CAAGCGATGC ATTGTTTCCA 600

ATGGGGCTGC TGGTGTTTTA TCAGCTGCAT TTGAAGCATT TCTCGAGCGC CCCTTTTCGA 660

TAAATATGTT GCAGTCTTGG AGGATATCTT GGCGGCTCTC CCTTGGATGT CTCCTCTTGA 720

TGGAAAAACC AAATCTTACC TTACCTCACC CGCCTCTTTT AAATTGTTTG GGATGGCTTT 780

TGAAGTTCTG GAAATTTGTC AGCCAAAAGG GAACCCTTTT TTCGACATTG AAAGAGCTAC 840

TTTCTTCAGA TAAACGAAAG GTGTATGCTT TGTCTGAGAT AGAAGGAGCG AAAGAAGCGT 900

TGGTGAAGCT CGTCAAAGAG CCCATTTGCC CTACTGCAAC AAAAACTTCA TTGGTGGTCA 960

TCTTCCATAT GGTTTCATCA TCTCCTTCAA ATGAAGATAC CAAAGTAAGG TTTGTCGAGA 1020

TGGGGTTAGT GGAGCTGCTC CTAGAACTAC TGGTGGACTC TGAGAAAAGC GTATGCGAGA 1080

AGGCATTGGG TGTTCTTGAT GGCATTTGCG GCTGCGAGGA AGGGAGGGAA AAGGCCTACG 1140

GCCATGCTCT AACCATGCCT GTTCTGGTTA AGAAGTTATT GCGCGTTTCT GATTTGGCTA 1200

CCGAGTTCTC AGTTTCCATC CTTTGGAAGC TCAGCAAAAA TGAGAAGAGG GAAGATGGAA 1260

GCGTCCTTGT TGAAGCTCTT CAAGTGGGTG CTTTTCAGAA GCTCTTGTTG CTCTTACAGG 1320

TTGGATGCTC TGACCGAACA AAGGAGAAGG CGACTGAGTT GTTGAAATTG TTGAACATTC 1380

ATAGGGAGAG GTTGGAGTGC ATTGACTCGA TGGATTTCAA GGATCTCAAA AGGCCTTTTT 1440

GATCAATCCA ATACCCAAAA TCAGTAGTTT TAGAGAGAAG TTTAAAGGGT ATTTCTCATG 1500

ATTTACAGTT CAATGTACAA AATACGAAAC ATACTTAGGA TAAATGCCAT TGAAATTCTT 1560

ACAAATAATT CTCTGCAAGA AGGCCCAAAG GTCTATTATG TGATTTCGAA GTTCTCTTGG 1620

TTTGCGACGA GTGCTTGATA TATATGTTTC AGTTAAACTG GTTTTGATCT TAATTTGAGA 1680

AATTGTACCA CCGATAATAA ATCATTGCCA AAGATATGTC ATTTTACATA TTTCTTTTAA 1740

ATGATGGCCT AGCTCAAGGA CGCTGTTATT AGAGAAATAT CATCTTGTCC TCCGATCAAT 1800

CTGTGTCATG TTGAGGCCGA 1820

<211> 444

<212> PRT

<213> 序列

<221> 葡萄抗病相關(guān)基因VvPUB21編碼的蛋白質(zhì)

<222> (1)..(444)

<400> 2

MISSWRRRRA GRRAAKLQQH AEDDIGSMEL TTPNHFRCPI SLDLMKDPVT LSTGITYDRE 60

SIEMWIEAGN RTCPITNQVL RSLEPIPNHT IRKMIQDWCV ENRSFGIERI PTPRIPLSSV 120

EVTDILSKLK MAYRREDEAG CRELVAKMKS KGKESERNKR CIVSNGAAGV LSAAFEAFLE 180

RPFSINMLQS WRISWRLSLG CLLLMEKPNL TLPHPPLLNC LGWLLKFWKF VSQKGTLFST 240

LKELLSSDKR KVYALSEIEG AKEALVKLVK EPICPTATKT SLVVIFHMVS SSPSNEDTKV 300

RFVEMGLVEL LLELLVDSEK SVCEKALGVL DGICGCEEGR EKAYGHALTM PVLVKKLLRV 360

SDLATEFSVS ILWKLSKNEK REDGSVLVEA LQVGAFQKLL LLLQVGCSDR TKEKATELLK 420

LLNIHRERLE CIDSMDFKDL KRPF 444

<211> 27

<212> DNA

<213> 序列

<221> 正向引物P3

<222> (1)..(27)

<400> 3

GGGGATCATC AGTTTATTCA ATTGTTG 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 序列

<221> 反向引物P4

<222> (1)..(26)

<400> 4

TCGGCCTCAA CATGACACAG ATTGAT 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 序列

<221> 正向引物P1

<222> (1)..(35)

<400> 5

GGGAGATCTA TGATTTCTTC TTGGAGAAGG CGGAG 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 序列

<221> 反向引物P2

<222> (1)..(35)

<400> 6

GGGGGTGACC TCAAAAAGGC CTTTTGAGAT CCTTG 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> 正向引物P5

<222> (1)..(20)

<400> 7

TGCTCTAACC ATGCCTGTTC 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> 反向引物P6

<222> (1)..(20)

<400> 8

CATTTTTGCT GAGCTTCCAA 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> 正向引物P7

<222> (1)..(20)

<400> 9

TCCTGTGGAC AATGGATGGA 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> 反向引物P8

<222> (1)..(20)

<400> 10

CTTGCATCCC TCAGCACCTT 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 序列

<221> 正向引物P9

<222> (1)..(21)

<400> 11

GAAACGCTCA ACGTGCCAAG G 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> 反向引物P10

<222> (1)..(24)

<400> 12

GTAACCATAG GAATGCTATG TAGC 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 序列

<221> 正向引物P11

<222> (1)..(22)

<400> 13

GGAGTCCATT AGCACTCCTT TG 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 序列

<221> 反向引物P12

<222> (1)..(21)

<400> 14

CATAATTCTG GGCGTAGGCA G 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 序列

<221> 正向引物P13

<222> (1)..(22)

<400> 15

CCAACCAATC CTCCTCCTCT TC 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 序列

<221> 反向引物P14

<222> (1)..(22)

<400> 16

CATCTCCGTC AACCACAGTG TA 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 序列

<221> 正向引物P15

<222> (1)..(22)

<400> 17

TCTCCGATTC CAACGACTTC AG 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> 反向引物P16

<222> (1)..(20)

<400> 18

CATCATCAAC GCACGCACAA 20