本發(fā)明屬于現(xiàn)代生物技術(shù)與家畜育種領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)，特別涉及一種檢測(cè)黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因T>A的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(T-ARMS-PCR)方法。

背景技術(shù)：

動(dòng)物育種技術(shù)主要包括以表型和表型值為基礎(chǔ)的常規(guī)育種技術(shù)和以DNA多態(tài)為基礎(chǔ)的分子育種技術(shù)。作為分子育種技術(shù)體系的重要組成部分，分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)育種技術(shù)首先檢測(cè)重要基因的DNA多態(tài)性，然后分析DNA多態(tài)與遺傳性狀之間的相關(guān)性，最后再根據(jù)與遺傳性狀顯著相關(guān)的DNA標(biāo)記進(jìn)行性狀選擇。作為現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展過(guò)程中孕育而生的新技術(shù)，MAS育種技術(shù)可以在DNA水平上快速準(zhǔn)確地分析個(gè)體的遺傳組成，該方法通過(guò)有性雜交將目的基因轉(zhuǎn)移到需要改良的親本中，將目標(biāo)基因型的鑒定與傳統(tǒng)育種相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型的直接選擇，提高育種目標(biāo)的定向性。該方法在克服表型鑒定的困難、早期選擇、進(jìn)行無(wú)損害的性狀評(píng)價(jià)和選擇及提高回交育種效率等方面具有優(yōu)越性。

在MAS育種技術(shù)體系中，尋找重要功能基因、篩查重要基因遺傳變異位點(diǎn)，并分析重要功能基因遺傳變異位點(diǎn)與生長(zhǎng)性能的相關(guān)性，是分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)應(yīng)用的前提和關(guān)鍵。作為分子遺傳標(biāo)記的重要方式之一。單核苷酸多態(tài)性(SNP)指序列間單堿基替換或插入缺失，且在群體中的發(fā)生頻率大于1％的多態(tài)類(lèi)型(Kwok and Gu 1999)。根據(jù)其在基因組中的位置可以劃分為外顯子多態(tài)性(包括錯(cuò)義突變、同義突變和無(wú)義突變)、基因間區(qū)多態(tài)性、內(nèi)含子或3’-/5’-調(diào)控區(qū)多態(tài)性。

SNP作為一種遺傳標(biāo)記，具有發(fā)生頻率高、能穩(wěn)定遺傳、易進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，并且在不同物種、不同品種間SNP分布都存在差異，所以SNP可以作為評(píng)價(jià)群體遺傳多樣性的重要指標(biāo)。目前，在遺傳多樣性研究中，雜合度是常用的一種變量，這種情況下，雜合度是指在基因組上檢測(cè)到的所有SNP標(biāo)記在不同樣本間的差異程度(Purcell et al.2007)。發(fā)現(xiàn)并且充分利用個(gè)體間基因變異對(duì)家畜育種而言是非常重要的。近幾年來(lái)，通過(guò)在家畜上已經(jīng)定位出了很多與重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的位點(diǎn)。Fan等檢測(cè)820個(gè)商品豬的全基因組SNP，并且對(duì)背膘厚、眼肌面積等性狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了與上述性狀相關(guān)的候選基因，如MC4R、BMP2等(Fan et al.2011)。Jiang等通過(guò)對(duì)2093頭中國(guó)荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶性狀進(jìn)行研究，共檢測(cè)出了105個(gè)與產(chǎn)奶性狀顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記位點(diǎn)(Jiang et al.2010)。此外，很多影響牛數(shù)量性狀(包括體尺、繁殖力、產(chǎn)奶量、壽命、難產(chǎn)率等)的SNP位點(diǎn)及其候選基因逐漸被定位出來(lái)。SNP作為一種標(biāo)記輔助選擇(Marker-assisted selection)在家畜育種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

迄今為止，檢測(cè)SNPs的技術(shù)非常多，包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)、單構(gòu)鏈多態(tài)性PCR(PCR-SSCP)、等位基因特異性PCR(AC-PCR)、直接測(cè)序法、新型高通量SNP檢測(cè)技術(shù)和引入突變位點(diǎn)的PCR-RFLP(Forced-PCR-RFLP)法等。在這些技術(shù)中，PCR-RFLP法是最早應(yīng)用于分子人類(lèi)學(xué)的SNP檢測(cè)技術(shù)，因?yàn)樵摷夹g(shù)簡(jiǎn)單且易操作，對(duì)于檢測(cè)單拷貝上(線(xiàn)粒體和Y染色體)的SNP，準(zhǔn)確度非常高，但由于PCR-RFLP分析受到特定的自然酶切位點(diǎn)的限制，故在實(shí)際應(yīng)用中也有一定的局限性；PCR-SSCP技術(shù)簡(jiǎn)便、快速、靈敏，但最后確定突變的位置和類(lèi)型，還需進(jìn)一步測(cè)序，且電泳條件要求較嚴(yán)格，故多用于DNA研究中的未知基因突變的檢測(cè)和臨床實(shí)驗(yàn)；直接測(cè)序法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，但其檢測(cè)費(fèi)用極其昂貴，且需要有測(cè)序儀等大型儀器，還需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，故對(duì)于在一段很短的序列上存在多個(gè)SNP的檢測(cè)是有優(yōu)勢(shì)的，但不適用于生產(chǎn)實(shí)際；新型高通量SNP檢測(cè)技術(shù)，如SNP芯片、GWAS和第二代測(cè)序等對(duì)于樣本量較小的實(shí)驗(yàn)研究，成本過(guò)高，在生產(chǎn)實(shí)際中應(yīng)用較為局限；四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(T-ARMS-PCR)方法是一種新型的SNP檢測(cè)方法，該方法只需要設(shè)計(jì)特定的引物，兩個(gè)反應(yīng)就能得到一個(gè)SNP位點(diǎn)的分型，能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，且四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR不需要酶切，因此既減少了試驗(yàn)費(fèi)用，又縮短了時(shí)間?？傊囊飻U(kuò)增受阻突變體系PCR方法，不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，而且對(duì)所檢測(cè)的序列位點(diǎn)無(wú)特殊性要求，因此，四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR方法受到育種工作中的青睞，在動(dòng)物分子育種的MAS體系中具有廣闊應(yīng)用前景。

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，社會(huì)對(duì)黃牛產(chǎn)品的需求不斷加強(qiáng)，但由于近年來(lái)牛肉、牛奶等產(chǎn)品嚴(yán)重短缺，所以黃牛育種專(zhuān)家期望更早、更好、更快地獲得黃牛產(chǎn)品的優(yōu)良品種。在高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效的黃牛育種目標(biāo)上，黃牛育種專(zhuān)家一直關(guān)注生長(zhǎng)發(fā)育性狀，但僅靠傳統(tǒng)育種手段是不行的，還需要依靠分子育種技術(shù)。即首先在DNA水平上篩查和檢測(cè)與黃牛生長(zhǎng)發(fā)育性狀密切相關(guān)的DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行基因多態(tài)性的檢測(cè)，最后是進(jìn)行基因多態(tài)性與生長(zhǎng)發(fā)育性狀的關(guān)聯(lián)分析，從而實(shí)現(xiàn)早期選擇。

LncRNA是一種長(zhǎng)度在200-100000nt之間的RNA分子，不編碼蛋白但卻參與細(xì)胞內(nèi)多種過(guò)程調(diào)控(Mercer et al.,2009)，其種類(lèi)、數(shù)量、功能都不明確。目前發(fā)現(xiàn)的許多l(xiāng)ncRNA都具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，一定的剪切形式以及亞細(xì)胞定位。它們?cè)诨蚪M上相對(duì)于蛋白編碼基因的位置，可以分為5種：正義鏈(sense)、反義鏈(antisense)、雙向(bidirectional)、內(nèi)含子間(intronic)、基因間(intergenic)(Kapranov et al.,2007；Core et al.,2008；Guttman et al.,2009；Mercer et al.,2009；Orom et al.,2010)，其所在的位置與其功能有一定的相關(guān)性。但人們對(duì)lncRNA的認(rèn)識(shí)還處在初級(jí)階段，lncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的"噪音"，是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能(Struhl,2007)。然而，近年來(lái)的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾，核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過(guò)程，lncRNA的這些調(diào)控作用也開(kāi)始引起人們廣泛的關(guān)注。哺乳動(dòng)物基因組序列中4％～9％的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是lncRNA，相應(yīng)的蛋白編碼RNA的比例是1％(Ponting etal.,2009)，雖然近年來(lái)關(guān)于lncRNA的研究進(jìn)展迅猛，但是絕大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的，隨著研究的推進(jìn)，各類(lèi)lncRNA的大量發(fā)現(xiàn)，lncRNA的研究將是RNA基因組研究非常吸引人的一個(gè)方向，使人們逐漸認(rèn)識(shí)到基因組存在人類(lèi)知之甚少的"暗物質(zhì)"。

lncRNAs通常較長(zhǎng)，具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)剪接，具有polyA尾巴與啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，分化過(guò)程中有動(dòng)態(tài)的表達(dá)與不同的剪接方式。lncRNAs啟動(dòng)子同樣可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，如Oct3/4，Nanog、CREB、Sp1、c-myc、Sox2與p53，局部染色質(zhì)組蛋白同樣具有特征性的修飾方式與結(jié)構(gòu)特征。大多數(shù)的lncRNAs在組織分化發(fā)育過(guò)程中，都具有明顯的時(shí)空表達(dá)特異性，如有人針對(duì)小鼠的1300個(gè)lncRNAs進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在腦組織中的不同部位，lncRNAs具有不同的表達(dá)模式。在腫瘤與其他疾病中有特征性的表達(dá)方式。序列上保守性較低，只有約12％的lncRNA可在人類(lèi)之外的其它生物中找到。

lncRNAs的作用機(jī)制主要包括以下幾種：①RNA誘餌，占據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合位點(diǎn)；②miRNAs吸附劑，與miRNAs靶基因競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNAs；③作為支架與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；④與mRNA形成互補(bǔ)雙鏈，抑制翻譯、調(diào)節(jié)可變剪切或調(diào)節(jié)mRNA降解。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR，是通過(guò)高通量測(cè)序新發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA。長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR在牛上的全長(zhǎng)為1730bp，包含2個(gè)外顯子，主要在前體脂肪細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。Li等發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR能抑制牛脂肪細(xì)胞的分化。通過(guò)檢測(cè)其上游約3kb處的編碼基因PLDXC2的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR并不能改變PLDXC2的表達(dá)量，說(shuō)明長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR不能通過(guò)cis作用脂肪細(xì)胞分化。通過(guò)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)及后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR通過(guò)靶向miRNA-204并與其競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到SIRT1基因上進(jìn)而參與脂肪的調(diào)控中。SIRT1基因是SIRTs家族的一員，通過(guò)與NCoR以及SMART結(jié)合去抑制PPARγ的活性進(jìn)而抑制脂肪細(xì)胞的分化和成脂基因的表達(dá)。

目前，有關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼基因的SNP研究比較少，而長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR的SNP研究更是沒(méi)有，尤其是，尚未見(jiàn)到利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR方法對(duì)黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR的SNP g.1263T>A多態(tài)性進(jìn)行的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種黃牛ADNCR基因單核苷酸多態(tài)性的四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用，從而加快良種選育速度。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因單核苷酸多態(tài)的四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(T-ARMS-PCR)檢測(cè)方法，包括以下步驟：

以待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P1為四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(T-ARMS-PCR)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因片段，該片段包含黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因T>A單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)；再對(duì)PCR擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因T>A單核苷酸位點(diǎn)的多態(tài)性。

所述單核苷酸位點(diǎn)的多態(tài)性為：野生純合基因型TT表現(xiàn)為429bp和194bp兩條帶紋；雜合子基因型TA表現(xiàn)為429bp、291bp和194bp三條帶紋；突變純合基因型AA表現(xiàn)為429bp和291bp兩條帶紋。

一種黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因單核苷酸多態(tài)的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括用于PCR擴(kuò)增黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因中T>A單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的引物對(duì)P1。

所述的引物對(duì)P1為：

內(nèi)引物上游：5'-ATGTACTCCTATTTCCTTGTGTTCGCAT-3'；

內(nèi)引物下游：5'-CAAAGTGCCCTGTAAAATGTAAAGTGTTT-3'；

外引物上游：5'-GTCTTTATCTGGTTTTACATGCCCCTAC-3'；

外引物下游：5'-GACATGCCTGGTCTCTTACTGTTTGTAC-3'。

上述黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因單核苷酸多態(tài)的四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(T-ARMS-PCR)檢測(cè)方法在黃牛分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。

所述單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的單核苷酸(TT基因型)可作為秦川牛坐骨端寬的DNA標(biāo)記。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明提供了針對(duì)黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(g.1263T>A的單核苷酸多態(tài)性)的四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(T-ARMS-PCR)檢測(cè)方法，通過(guò)設(shè)計(jì)的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，能夠簡(jiǎn)單、快速、低成本、精確的檢測(cè)該位點(diǎn)的單核苷酸的多態(tài)性，有利于快速建立生長(zhǎng)發(fā)育性狀優(yōu)良的黃牛遺傳資源群體，加快良種選育速度。

本發(fā)明對(duì)黃牛品種的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型進(jìn)行了檢測(cè)和基因頻率分析，對(duì)上述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與黃牛部分生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)能夠作為提高秦川牛坐骨端寬(P＝0.032)的分子標(biāo)記，從而為黃牛良種選育提供依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因單核苷酸多態(tài)(SNP)位點(diǎn)(g.1263T>A位點(diǎn))的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，包含AA、AT以及TT基因型的結(jié)果，M為Marker I。

圖2為黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖；a：基因型為AA，b：基因型為T(mén)A，c：基因型為T(mén)T，黑色方框標(biāo)出的部分表示突變序列：g.1263T>A。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明利用PCR擴(kuò)增方法對(duì)黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因在g.1263T>A位點(diǎn)突變可能產(chǎn)生的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，并將其與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標(biāo)記，從而加快良種選育速度。

(一)實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

1.生化試劑與生物學(xué)試劑：①Taq DNA聚合酶(購(gòu)自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(購(gòu)自華美生物工程公司)③Marker I(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)。

2.普通試劑：普通試劑從華美生物工程公司購(gòu)買(mǎi)，為進(jìn)口分裝產(chǎn)品：Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、醋酸鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴化乙錠(EB)、溴酚藍(lán)、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、瓊脂糖等。

3.溶液與緩沖液：所有溶液與緩沖液均采用去離子超純水配制。高壓滅菌條件為15bf/in(1.034×10⁵Pa)，25min。試劑配制方法均參考Sambrook等編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

1)提取組織樣DNA所用溶液：除了基因組DNA提取時(shí)的公用溶液外，還配制以下試劑：①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高壓滅菌。②組織DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-Cl(pH 8.0)l mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。

2)瓊脂糖電泳分析所用溶液:①1×TBE緩沖液：取10×TBE 100mL定容至1000mL。②上樣緩沖液：0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯青FF，40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

(二)黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因在g.1263T>A位PCR引物的設(shè)計(jì)

在NCBI上檢索牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因的序列(Gene ID:107992386)，并利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)(參考SEQ.ID.NO.1)能夠擴(kuò)增包含牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因第1內(nèi)含子區(qū)域T>A位點(diǎn)的四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR引物，其引物序列如下：

內(nèi)引物上游：5'-ATGTACTCCTATTTCCTTGTGTTCGCAT-3'(SEQ.ID.NO.2)；

內(nèi)引物下游：5'-CAAAGTGCCCTGTAAAATGTAAAGTGTTT-3'(SEQ.ID.NO.3)；

外引物上游：5'-GTCTTTATCTGGTTTTACATGCCCCTAC-3'(SEQ.ID.NO.4)；

外引物下游：5'-GACATGCCTGGTCTCTTACTGTTTGTAC-3'(SEQ.ID.NO.5)。

根據(jù)上述引物，利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR對(duì)黃牛基因組擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增包含黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因在g.1263T>A位點(diǎn)的SNP的不同的基因型片段。理論上，當(dāng)該位點(diǎn)的T發(fā)生純合子突變時(shí)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)之后是429bp和291bp大小的兩條帶紋；當(dāng)該位點(diǎn)的T發(fā)生雜合子突變時(shí)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)之后是429bp、291bp和194bp大小的三條帶紋。當(dāng)該位點(diǎn)的T不發(fā)生突變時(shí)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)之后是429bp和194bp兩條帶紋。

(三)PCR擴(kuò)增待測(cè)黃牛的長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因片段

1、黃牛樣本的采集

實(shí)驗(yàn)所用的動(dòng)物為秦川牛品種的252個(gè)樣本，其中：秦川牛(QC)樣品252份采自陜西省扶風(fēng)縣秦川牛保種場(chǎng)(表1)。采用隨機(jī)采樣方式采取個(gè)體耳組織樣品，這些樣品為70％乙醇保存，冰盒低溫帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-80℃凍存。

表1.黃牛樣本的采集

2、組織樣品中基因組DNA的提取與分離

1)取約10mg耳組織樣，放于1.5mL的離心管中，用小剪刀盡量剪碎。

2)加入600μL組織DNA提取液，10％SDS至終濃度為1％，蛋白酶K至終濃度為100μg/mL，55.0℃消化過(guò)夜，最好保證組織樣較均勻地分布在組織提取液中。

3)將溶液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，蓋緊管蓋，緩慢地來(lái)回顛倒離心管，至少持續(xù)10min以上，12000r/min離心15min。

4)取上清液，加入等體積的Tris飽和酚:氯仿(1:1)，蓋緊管蓋，緩慢地來(lái)回顛倒離心管，至少持續(xù)10min以上，12000r/min離心15min。

5)取上清液，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，蓋緊管蓋，緩慢地來(lái)回顛倒離心管，至少持續(xù)10min以上，12000r/min離心15min。

6)取上清液，加入2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇和1/10體積的3mol/L乙酸鈉，蓋緊管蓋，緩慢地來(lái)回顛倒離心管，直至液體清亮，出現(xiàn)白色絮狀DNA。

7)挑出DNA，放進(jìn)一個(gè)1.5mL的離心管中，加入500μL 70％乙醇，蓋緊管蓋，緩慢地來(lái)回顛倒離心管，然后12000r/min離心3～5min，小心倒掉乙醇，將管倒置于吸水紙上。

8)再一次向離心管中加入500μL 70％乙醇，蓋緊管蓋，緩慢地來(lái)回顛倒離心管，然后12000r/min離心3～5min，小心倒掉乙醇，將管倒置于吸水紙上。

9)待干燥后，加入60μL滅菌超純水，為使其完全溶解，4℃保存過(guò)夜，待檢測(cè)。

3、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA

1)將凝膠電泳槽洗干凈，用膠帶紙將兩端封住，插上梳子。

2)稱(chēng)取0.24g的瓊脂糖，轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入1×TBE 30mL使其懸浮，微波爐中火加熱，待沸騰2次拿出，待其冷卻至不燙手時(shí)加入終濃度為0.5μg/mL的EB。然后快速將瓊脂糖溶液導(dǎo)入，輕微搖動(dòng)，防止出現(xiàn)氣泡。

3)混勻后(約60℃)，立即將瓊脂糖溶液到入槽內(nèi)。如出現(xiàn)氣泡，立即用移液器移出。

4)完全冷卻凝固(約25～40min)后，拔掉梳子，去掉兩端膠帶紙，將凝膠移入電泳槽中。

5)向電泳槽中加入1×TBE緩沖液，使液面高出膠面2～5mm。

6)取DNA樣品2～4μL，加2μL上樣緩沖液后混勻，統(tǒng)一上樣(注意槍頭的順序應(yīng)前后對(duì)應(yīng))，并將DNA Marker加在一邊。

7)80V電壓電泳2h。

8)在紫外分析儀上觀察，如果有RNA則需要純化，如果有明顯降解不能用，需重新提取相應(yīng)樣品的DNA。

4、DNA的純化

1)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其終濃度為0.1％，加入蛋白酶K至終濃度達(dá)到100μg/mL。

2)55℃保溫10h左右。

3)等體積苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿分別抽提一次。

4)12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中。

5)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無(wú)水乙醇沉淀DNA。

6)倒掉液體，70％乙醇洗滌后涼干，加入60μL滅菌超純水溶解，4℃待檢測(cè)。

5、分光光度法檢測(cè)DNA

用紫外光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計(jì)算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，說(shuō)明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。

DNA濃度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀釋倍數(shù)

DNA檢測(cè)完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μL，存于-20℃?zhèn)溆?，其余的存放?80℃。

6、四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR

1)擴(kuò)增體系

25μL的總反應(yīng)體系，其中1.0μL的基因組DNA，上、下游內(nèi)引物各0.4μL，上、下游外引物各0.8μL，12.5μL的2×Eco Taq PCR Mix以及9.1μL ddH₂O

2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序

(1)94℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)入步驟(2)；

(2)循環(huán)一：94℃變性30s，68℃復(fù)性30s，72℃延伸25s；共18個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中復(fù)性溫度降低1℃，然后進(jìn)入步驟(3)；

(3)循環(huán)二：94℃變性30s，60℃復(fù)性30s，72℃延伸205s；共24個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入步驟(4)；

(4)72℃延伸10min。

3)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析

PCR產(chǎn)物上樣量為4μL，且瓊脂糖凝膠電泳采用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為2％。電泳結(jié)果參見(jiàn)圖1，野生純合基因型TT表現(xiàn)為429bp和194bp兩條帶紋；雜合子基因型TA表現(xiàn)為429bp、291bp和194bp三條帶紋；突變純合基因型AA表現(xiàn)為429bp和291bp兩條帶紋，與測(cè)序分型結(jié)果一致，參見(jiàn)圖2。

(五)黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析

1)基因和基因型頻率

基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。P_TT＝N_TT/N，其中P_TT代表某一位點(diǎn)的TT基因型頻率；N_TT表示群體中具有TT基因型的個(gè)體數(shù)；N為檢測(cè)群體的總數(shù)量。

基因頻率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對(duì)其等位基因總數(shù)的相對(duì)比率。計(jì)算的公式可以寫(xiě)成：P_T＝(2N_TT+N_Ta1+N_Ta2+N_Ta3+N_Ta4+……+N_Tan)/2N

式中，P_T表示等位基因T頻率，N_TT表示群體中具有TT基因型的個(gè)體數(shù)量，N_Tai表示群體中具有Tai基因型個(gè)體數(shù)量，a1～an為等位基因T的n個(gè)互不相同的復(fù)等位基因。

在秦川牛品種中長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因單核苷酸(SNP)位點(diǎn)中的基因型頻率及等位基因頻率如表2所示。秦川牛等位基因“A”的頻率為0.732，相應(yīng)的等位基因“T”的頻率為0.268，等位基因“A”和“T”的頻率均大于1％，故為穩(wěn)定存在單核苷酸(SNP)類(lèi)型。

表2.黃牛ADNCR基因在g.1263T>A位點(diǎn)上的SNP基因頻率分布表

注：HWE:哈代溫伯格平衡；Ho:純合度；He:雜合度；Ne:有效等位基因數(shù)；PIC:多態(tài)信息含量。

(六)黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因SNP位點(diǎn)基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析

基因型數(shù)據(jù)：PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳識(shí)別的基因型。

生產(chǎn)數(shù)據(jù)：秦川牛的體重、胸圍、尻長(zhǎng)、坐骨端寬等體尺性狀數(shù)據(jù)。

關(guān)聯(lián)分析模型：利用SPSS(18.0)軟件來(lái)分析品種，不同因素與生長(zhǎng)形狀相關(guān)性。首先要對(duì)所得數(shù)據(jù)描述性的統(tǒng)計(jì)分析，來(lái)確定是不是存在離群值。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的特性，利用方差分析、多元線(xiàn)性模型或者t分析進(jìn)而來(lái)分析基因型的效應(yīng)。在數(shù)據(jù)處理的過(guò)程中，依據(jù)影響體重、體尺生長(zhǎng)發(fā)育的指標(biāo)的因素的不同，考慮到個(gè)體的效應(yīng)，基因之間的互作以及基因型的效應(yīng)，采用固定的模型來(lái)進(jìn)行相關(guān)分析。此外，根據(jù)實(shí)際條件來(lái)進(jìn)行取舍，完整模型如下所示：Y＝μ+G+E，其中，Y：個(gè)體表型記錄；u：總體均值；G：標(biāo)記基因型效應(yīng)；E：隨機(jī)誤差。

結(jié)果表明：黃牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因不同基因型頻率與等位基因頻率的分布對(duì)黃牛某些生產(chǎn)性狀(如秦川牛的坐骨端寬)的影響均有顯著差異。

由表3可以看出，在對(duì)252個(gè)秦川牛個(gè)體的研究中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因的單核苷酸多態(tài)性對(duì)秦川牛的坐骨端寬性狀有顯著影響(P<0.05)。因此，長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因的T>A單核苷酸多態(tài)性是黃牛生長(zhǎng)發(fā)育的遺傳標(biāo)記。

表3.長(zhǎng)鏈非編碼RNA ADNCR基因SNP對(duì)秦川牛生長(zhǎng)性狀的影響

注：不同字母a、b表示兩者之間差異顯著。

核苷酸序列表

<110> 西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120> 黃牛ADNCR基因單核苷酸多態(tài)性的四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用

<160> 5

<210> 1

<211> 436

<212> DNA

<213>黃牛（bovine）

<221> allele

<222>（271）

<400> 1

attgcaaggt ctttatctgg ttttacatgc ccctacctat ggccatctaa gttagcaata 60

ctatcttgtg tcacttaaaa ttgctctgcc tttgcttcat ttcttcccag atgtacatga 120

aaactagtca tcttcatagc agattttctt actgaattat cacaattttt atttgctttt 180

aaactagtgg agcctaagaa gctctttgga gcaaatgtta cgaggtcagt ggcattacat 240

actatgtact cctatttcct tgtgttcgta tagcacttta cattttacag ggcactttga 300

tttatttctt catttgttca ttcattcaac cacccagttc acttaaatag ttattgagca 360

cctactggaa ccaagttcct gtgctaggtc ttgtgatata cagtgagagg tacaaacagt 420

aagagaccag gcatgt 436

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgtactcct atttccttgt gttcgcat 28

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

caaagtgccc tgtaaaatgt aaagtgttt 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gtctttatct ggttttacat gcccctac 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gacatgcctg gtctcttact gtttgtac 28