本發(fā)明涉及體外診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別的，涉及一種基于宮頸癌特異性甲基化檢測(cè)的引物對(duì)、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
：宮頸癌是最為常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，是危害女性健康與生命的主要疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，每年全球有46.5萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例，其中中國(guó)每年約有13萬(wàn)新發(fā)病例。目前宮頸癌的發(fā)病年齡趨于年輕化，受宮頸癌侵害的女性多處于生兒育女及經(jīng)營(yíng)家庭的黃金時(shí)期。宮頸癌不同于其他腫瘤，疾病自然史明確，有一系列的癌前病變，它的發(fā)生和發(fā)展是由量變到質(zhì)變、漸變到突變，要經(jīng)歷幾年到十幾年的過(guò)程。因此，宮頸癌的防治關(guān)鍵在于通過(guò)篩查及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療宮頸病變，終止其向?qū)m頸癌的發(fā)展。因而，早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療對(duì)于提高宮頸癌治療效果具有重大意義。目前采用的宮頸癌常規(guī)篩查技術(shù)包括：巴氏涂片法：該技術(shù)靈敏度低，特異性一般，檢測(cè)方法人為干擾因素較大，結(jié)果準(zhǔn)確性有限及成本低；液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(Thin-CytologicTest，TCT)：該技術(shù)靈敏度低，特異性高，檢測(cè)方法需要人工觀察分析且易干擾，對(duì)非典型鱗狀細(xì)胞診斷率不高，無(wú)法檢查宮頸腺癌；HPV-DNA檢測(cè)：該技術(shù)靈敏度高，特異性低，檢測(cè)方法通量高，適用于大規(guī)模臨床篩查，但是假陽(yáng)性率高，只能預(yù)警而非早期發(fā)現(xiàn)；HPV-E6E7mRNA檢測(cè)：該技術(shù)靈敏度高，特異性一般，檢測(cè)方法分型體系復(fù)雜，RNA不穩(wěn)定，檢測(cè)的是病毒而非個(gè)體基因，也只能預(yù)警而非早期發(fā)現(xiàn)。上述這些方法均存在操作繁瑣、假陽(yáng)性率高、靈敏度低等缺點(diǎn)，限制了其在臨床實(shí)驗(yàn)室的準(zhǔn)確篩查。近期宮頸癌DNA甲基化研究表明，PAX1的DNA甲基化改變與宮頸癌的病情進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。PAX1基因在宮頸癌變的發(fā)生機(jī)制中起到潛在的抑癌作用，PAX1基因的高甲基化可以促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。因此檢測(cè)宮頸癌PAX1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，對(duì)宮頸癌的篩查具有重要的意義。目前，傳統(tǒng)的甲基化檢測(cè)方法包括：甲基化特異性PCR及亞硫酸氫鹽測(cè)序法。然而這些方法存在操作繁瑣、準(zhǔn)確性低及敏感性不高的缺點(diǎn)，限制了其在臨床實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用。因此，有必要提供一種新的宮頸癌PAX1基因的甲基化檢測(cè)方法來(lái)克服上述缺陷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述傳統(tǒng)甲基化檢測(cè)方法存在操作繁瑣、準(zhǔn)確性低及敏感性不高的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高及敏感性高且基于熒光PCR技術(shù)的基于宮頸癌特異性甲基化檢測(cè)的引物對(duì)、試劑盒及其方法。本發(fā)明提供了一種基于宮頸癌特異性甲基化檢測(cè)的引物對(duì)，包括針對(duì)PAX1基因和ACTB基因的啟動(dòng)子區(qū)的特異性引物及探針，如下：PAX1正向引物：5'-GTGGAGAGTGTTTTGGGAGGG-3'(SEQIDNO.1)，PAX1反向引物：5'-CTACCRCCCRCTCCAAAACC-3'(SEQIDNO.2)，PAX1檢測(cè)探針：5'FAM-TAGTAGCGGCGGCGGT-3'MGB(SEQIDNO.3)；ACTB正向引物：5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3'(SEQIDNO.4)，ACTB反向引物：5'-ATCATCTTTCCCACCAAACTATAACC-3'(SEQIDNO.5)，ACTB檢測(cè)探針：5'VIC-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'MGB(SEQIDNO.6)。本發(fā)明還提供了一種基于宮頸癌特異性甲基化檢測(cè)的試劑盒，包括含有如上述引物及探針的PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括：PAX1正向引物、PAX1反向引物、PAX1檢測(cè)探針，ACTB正向引物、ACTB反向引物、ACTB檢測(cè)探針，10×PCRbuffer，dNTP及無(wú)核酸酶水。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述試劑盒還包括ExTaq酶。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述PCR反應(yīng)液的成分終濃度為：1×PCRbuffer，0.4μMPAX1正向引物、0.4μMPAX1反向引物、0.4μMPAX1檢測(cè)探針，0.4μMACTB正向引物、0.4μMACTB反向引物、0.4μMACTB檢測(cè)探針，0.25mMdNTP。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照品及陰性對(duì)照品，所述陽(yáng)性對(duì)照品為甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA，所述陰性對(duì)照品為非甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA。其中所述甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA如SEQIDNO.7所示：AAATTGATTttCGtACGtTGtAGttTttCGGTtAGACGAATTTtTtttAATCGGATGAAGTTtAtttTGGGttTGGGGTCGCGGGCGTGGAGAGTGTttTGGGAGGGGGtAGtAGCGGCGGCGGtAGGtttTGGAGCGGGCGGtAGCGCGtTtCGtTGtCGCGtAtAGCGCGTtTttAGttCGCGGtTGGGtCGtCGCGGtTtTCG；所述非甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA如SEQIDNO.8所示：AAATTGATTtttGtAtGtTGtAGttTtttGGTtAGAtGAATTTtTtttAATtGGATGAAGTTtAtttTGGGttTGGGGTtGtGGGtGTGGAGAGTGTttTGGGAGGGGGtAGtAGtGGtGGtGGtAGGtttTGGAGtGGGtGGtAGtGtGtTttGtTGttGtGtAtAGtGtGTtTttAGtttGtGGtTGGGttGttGtGGtTtTtGGt。本發(fā)明還提供了一種基于宮頸癌特異性甲基化檢測(cè)的方法，包括如下步驟：步驟一：取待檢測(cè)樣本抽提的DNA，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，轉(zhuǎn)化后的DNA作為PCR的模板；步驟二：提供上述基于宮頸癌特異性甲基化檢測(cè)的試劑盒，對(duì)所述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟三：根據(jù)PAX1與ACTB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果的相對(duì)熒光CT值來(lái)確定待檢測(cè)樣本的甲基化率，即待檢測(cè)樣本中PAX1/ACTB的比值除以陽(yáng)性對(duì)照品中PAX1/ACTB的比值。在本發(fā)明提供的所述方法的一種較佳實(shí)施例中，所述步驟一中轉(zhuǎn)化處理所采用的試劑為亞硫酸氫鹽或重亞硫酸鹽。在本發(fā)明提供的所述方法的一種較佳實(shí)施例中，所述步驟二中PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性10min；50cycles，95℃15sec，60℃30sec。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的基于宮頸癌特異性甲基化檢測(cè)的引物對(duì)、試劑盒及方法的有益效果在于：通過(guò)設(shè)計(jì)特異性高的引物及探針，并配置成使用方便且檢測(cè)結(jié)果可靠的試劑盒，再設(shè)計(jì)出科學(xué)合理的PCR反應(yīng)體系，使得本發(fā)明具有快速、高通量、靈敏及特異性好的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸癌PAX1基因的甲基化程度快速及準(zhǔn)確測(cè)量，以便對(duì)宮頸癌間接進(jìn)行及時(shí)、有效的診斷和治療，降低醫(yī)療成本，節(jié)約社會(huì)資源。附圖說(shuō)明圖1為針對(duì)不同甲基化率樣本的PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)圖；圖2為利用本發(fā)明引物對(duì)及試劑盒所能檢測(cè)出的最低檢出限的PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1：試劑盒的制備一、引物和探針的設(shè)計(jì)與合成針對(duì)人基因組中PAX1基因和內(nèi)標(biāo)基因ACTB(β-actin)的啟動(dòng)子區(qū)(序列參見(jiàn)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)的人類(lèi)全基因組序列)，使用PrimerPremier3.0及MethylPrimerExpressv1.0軟件，分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物及探針。特異性引物及探針序列，如下表所示：二、對(duì)照品選擇使用甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA為陽(yáng)性對(duì)照品，其序列為：AAATTGATTttCGtACGtTGtAGttTttCGGTtAGACGAATTTtTtttAATCGGATGAAGTTtAtttTGGGttTGGGGTCGCGGGCGTGGAGAGTGTttTGGGAGGGGGtAGtAGCGGCGGCGGtAGGtttTGGAGCGGGCGGtAGCGCGtTtCGtTGtCGCGtAtAGCGCGTtTttAGttCGCGGtTGGGtCGtCGCGGtTtTCG；非甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA為陰性對(duì)照品，其序列為：AAATTGATTtttGtAtGtTGtAGttTtttGGTtAGAtGAATTTtTtttAATtGGATGAAGTTtAtttTGGGttTGGGGTtGtGGGtGTGGAGAGTGTttTGGGAGGGGGtAGtAGtGGtGGtGGtAGGtttTGGAGtGGGtGGtAGtGtGtTttGtTGttGtGtAtAGtGtGTtTttAGtttGtGGtTGGGttGttGtGGtTtTtGGt。三、PCR反應(yīng)液組成包括含有上述特異性引物及探針的PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括：PAX1正向引物：5'-GTGGAGAGTGTTTTGGGAGGG-3'，PAX1反向引物：5'-CTACCRCCCRCTCCAAAACC-3'，PAX1檢測(cè)探針：5'FAM-TAGTAGCGGCGGCGGT-3'MGB，ACTB正向引物：5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3'，ACTB反向引物：5'-ATCATCTTTCCCACCAAACTATAACC-3'，ACTB檢測(cè)探針：5'VIC-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'MGB；10×PCRbuffer，dNTP及無(wú)核酸酶水。其中，所述10×PCRbuffer、dNTP及無(wú)核酸酶水均購(gòu)自大連寶生物(寶生物(大連)工程有限公司)；所述無(wú)核酸酶水為(Nuclease-FreeWater)用DEPC(Diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過(guò)并經(jīng)高溫高壓滅菌的超純水。所述PCR反應(yīng)液成分的終濃度為：1×PCRbuffer，0.4μM(μmol/L)PAX1正向引物，0.4μMPAX1反向引物，0.4μMPAX1檢測(cè)探針；0.4μMACTB正向引物，0.4μMACTB反向引物，0.4μMACTB檢測(cè)探針；0.25mM(mmol/L)dNTP。所述試劑盒還包括ExTaq酶，購(gòu)自大連寶生物(寶生物(大連)工程有限公司)；所述ExTaq酶的活性維持更好，相對(duì)于普通Taq可以有效擴(kuò)增更長(zhǎng)的片段。實(shí)施例2：利用上述試劑盒進(jìn)行宮頸癌甲基化檢測(cè)的方法一、技術(shù)原理在人基因組中PAX1基因和內(nèi)標(biāo)基因ACTB(b-actin)的啟動(dòng)子區(qū)分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的甲基化檢測(cè)的引物及探針。然后用該引物及探針去擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的樣本DNA，根據(jù)PAX1與ACTB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果的相對(duì)熒光CT值來(lái)確定待測(cè)樣本的甲基化率，根據(jù)甲基化率來(lái)評(píng)判宮頸癌變的風(fēng)險(xiǎn)。二、檢測(cè)方法步驟一：取待檢測(cè)樣本抽提的DNA，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，轉(zhuǎn)化后的DNA作為PCR的模板；其中，轉(zhuǎn)化處理所采用的試劑為亞硫酸氫鹽或重亞硫酸鹽，及其他輔助(相應(yīng)試劑盒為購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司的EpiTectFastDNABisuLfiteKit)。步驟二：提供上述基于宮頸癌特異性甲基化檢測(cè)的試劑盒，對(duì)所述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性10min；50cycles，95℃15sec、60℃30sec。步驟三：根據(jù)PAX1與ACTB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果的相對(duì)熒光CT值來(lái)確定待檢測(cè)樣本的甲基化率，即待檢測(cè)樣本中PAX1/ACTB的比值除以陽(yáng)性對(duì)照品中PAX1/ACTB的比值。具體檢測(cè)方法，如下：一)收集生物樣本：選自2016年3-6月期間在湖南省腫瘤醫(yī)院就診的30例C1N1宮頸脫落細(xì)胞、30例C1N2患者宮頸脫落細(xì)胞、30例C1N3宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞、90例正常人群的宮頸脫落細(xì)胞。二)提取組織DNA：以下提取樣本組織DNA所用的試劑成分均選自湖南宏灝基因生物科技有限公司的《人外周血基因組DNA提取試劑盒(濾過(guò)柱法)》(備案號(hào)：湘長(zhǎng)械備20150166)。1)將取回的樣本充分震蕩1min，取出宮頸刷。2)取無(wú)菌的1.5mLEP管，加入1.5ml樣品，12000rpm離心1.5min；倒掉上部廢液，收集管底沉淀。3)重復(fù)步驟2)將所有的樣本處理完。4)依次加入20μL蛋白酶K、250μL裂解液ABL，渦旋振蕩10s，65℃水浴15min，期間振蕩混勻2-3次。5)取出后加入250μL無(wú)水乙醇，渦旋振蕩10sec，短暫離心5sec。6)將吸附柱插入收集管中，將上一步所得混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中。10,000rpm離心1min。7)棄收集管中廢液，將吸附柱重新放入收集管；加入500μL洗液I，10,000rpm，離心1min。8)棄收集管中廢液，加入700μL洗液II，10,000rpm，離心1min，。棄廢液。(洗液II使用前需加入無(wú)水乙醇至80％)9)重復(fù)步驟8)一次。10)棄流出液，將吸附柱插回收集管，空轉(zhuǎn)離心，13,000rpm，2min。11)將吸附柱插入到新的EP管中。加入30-100μLDNA溶解液(65℃預(yù)熱可提高DNA獲得率)，室溫靜置5min。12)再次10,000rpm，離心1min。棄吸附柱，EP管內(nèi)液體即為DNA溶液。2-8℃保存，若需長(zhǎng)期保存則置于-20℃或更低溫度。三)DNA轉(zhuǎn)化流程：1)將提取的DNA配置亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化體系配置：2)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的運(yùn)行體系：反應(yīng)溫度反應(yīng)時(shí)間95℃5min60℃10min95℃5min60℃10min20℃∞3)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后DNA純化：以下對(duì)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后DNA純化所用的試劑成分均選自德國(guó)QIAGEN公司的EpiTectFastDNA亞硫酸氫鈉試劑盒。a)將亞硫酸轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管中；b)小于100ng/μLDNA需加1μLCarrierRNA到BufferBL中，若濃度大于100ng/μL則無(wú)需加CarrierRNA；c)加310μLBufferBL混勻；d)再加250μL無(wú)水乙醇，混勻15sec；e)將以上的混合物轉(zhuǎn)移至過(guò)濾柱，10000rpm離心1min；f)棄濾液，加500μLBufferBW，10000rpm離心1min；g)棄濾液，加500μLBufferBD靜止15min，10000rpm離心1min；h)棄濾液，加500μLBufferBW，10000rpm離心1min；i)重復(fù)步驟h)；j)棄濾液，加250μL無(wú)水乙醇，10000rpm離心1min；k)棄濾液，再12000rpm空轉(zhuǎn)1min；l)加15μLBufferEB室溫靜止1min，10000rpm離心1min；m)將收集的DNA保存于-20℃。四)PCR流程1、使用的PCR儀器為美國(guó)ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(購(gòu)自LifeTech(appliedbiosystems公司)，反應(yīng)體系為20μL；2、PCR反應(yīng)體系配制及條件，如下表所示：PCR反應(yīng)體系：成分反應(yīng)體積(μL)PCR反應(yīng)液18.3μLExTaq酶0.2μL亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA模板1.5μLPCR反應(yīng)程序：五)結(jié)果分析用待測(cè)樣本中PAX1/ACTB的比值除以陽(yáng)性對(duì)照(甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA)中PAX1/ACTB的比值，來(lái)計(jì)算PAX1甲基化比例。甲基化率計(jì)算公式為借用相對(duì)定量的公式計(jì)算出待檢測(cè)樣本的甲基化率，公式如下所示。2－△△CT＝2待測(cè)樣本(PAX1CT-ACTBCT)-全甲基化樣本(PAX1CT-ACTBCT)部分樣本甲基化率數(shù)據(jù)，如下表所示：序號(hào)編號(hào)樣本△CTMean△△CT甲基化率100％19.85717.7930115％9.9297.8640.0041215％4.8112.7470.1491335％3.4771.4130.37614100％2.06401基于本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖1和圖2，其中圖1為針對(duì)不同甲基化率樣本的PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)圖，可以得出不同甲基化率樣本PAX1基因擴(kuò)增曲線(xiàn)與ACTB管家基因的擴(kuò)增曲線(xiàn)關(guān)系；圖2為利用本發(fā)明引物對(duì)及試劑盒所能檢測(cè)出的最低檢出限的PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)圖，本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物及試劑盒可檢測(cè)出最低檢出限為10％的甲基化率樣本，與非甲基化樣本有顯著區(qū)別。本發(fā)明提供的基于宮頸癌特異性甲基化檢測(cè)的引物對(duì)、試劑盒及方法的有益效果在于：通過(guò)設(shè)計(jì)特異性高的引物及探針，并配置成使用方便且檢測(cè)結(jié)果可靠的試劑盒，再設(shè)計(jì)出科學(xué)合理的PCR反應(yīng)體系，使得本發(fā)明具有快速、高通量、靈敏及特異性好的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸癌PAX1基因的甲基化程度快速及準(zhǔn)確測(cè)量，以便對(duì)宮頸癌間接進(jìn)行及時(shí)、有效的診斷和治療，降低醫(yī)療成本，節(jié)約社會(huì)資源。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專(zhuān)利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>韓林志<120>基于宮頸癌特異性甲基化檢測(cè)的引物對(duì)、試劑盒及方法<130>2017<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1gtggagagtgttttgggaggg21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ctaccrcccrctccaaaacc20<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>3tagtagcggcggcggt16<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>4ggttaggaaggaggttgtttgtttt25<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>5atcatctttcccaccaaactataacc26<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6cccattaactaaacacaacct21<210>7<211>206<212>DNA<213>人工序列<400>7aaattgattttcgtacgttgtagtttttcggttagacgaattttttttaatcggatgaag60tttattttgggtttggggtcgcgggcgtggagagtgttttgggagggggtagtagcggcg120gcggtaggttttggagcgggcggtagcgcgtttcgttgtcgcgtatagcgcgtttttagt180tcgcggttgggtcgtcgcggttttcg206<210>8<211>208<212>DNA<213>人工序列<400>8aaattgatttttgtatgttgtagttttttggttagatgaattttttttaattggatgaag60tttattttgggtttggggttgtgggtgtggagagtgttttgggagggggtagtagtggtg120gtggtaggttttggagtgggtggtagtgtgttttgttgttgtgtatagtgtgtttttagt180ttgtggttgggttgttgtggtttttggt208當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3