本發(fā)明涉及一種嗜麥芽窄食單胞菌外膜蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)是廣泛存在于自然界和醫(yī)院環(huán)境的非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，為條件致病菌。隨著廣譜抗菌藥物和免疫抑制劑的大量使用以及侵襲性醫(yī)療操作的不斷增加，該菌的臨床分離率呈逐年上升趨勢，已成為醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌。中國CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)2005-2011年資料顯示，該菌分離率居于革蘭陰性菌的第5-6位，非發(fā)酵菌的第3位，僅次于銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌；其中2011年該菌占所有革蘭陰性菌的4.45％，非發(fā)酵菌的11.61％。SENTRY全球細(xì)菌耐藥監(jiān)測顯示，2009-2012年在美國由該菌引起的肺炎占4.4％，歐洲和地中海地區(qū)為3.2％；在加拿大由嗜麥芽窄食單胞菌導(dǎo)致血流感染占0.4％-2.2％；最近在美國的一家醫(yī)院ICU，由該菌引起的呼吸機相關(guān)肺炎(VAP)病例甚至超過鮑曼不動桿菌，已成為一種新興的全球性條件致病菌。嗜麥芽窄食單胞菌引起的感染常發(fā)生在免疫力低下、患有多種基礎(chǔ)疾病的老年或危重患者，可引起肺炎、血流感染、心內(nèi)膜炎、皮膚軟組織、泌尿系及腦膜炎、骨關(guān)節(jié)、消化道感染等，其中以下呼吸道感染最為常見，特別是患有結(jié)構(gòu)性肺病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊性纖維化(CF)的患者。研究顯示，長期接受廣譜抗菌藥物尤其碳青霉烯類、免疫功能低下、長期入住ICU病房、慢性呼吸系疾病、氣管插管或氣管切開、留置中心靜脈導(dǎo)管、重度營養(yǎng)不良、腫瘤放化療等是嗜麥芽窄食單胞菌感染的易患因素。另外的研究顯示，該菌所致的血流感染病死率達(dá)14％-69％。一項臺灣地區(qū)近10年的病例隊列研究顯示，由單一病原菌(嗜麥芽窄食單胞菌)所致的感染，住院14天的病死率為23.2％，住院總病死率為41.1％。血液惡性腫瘤患者中，由嗜麥芽窄食單胞菌感染引起的出血性肺炎，28天的病死率達(dá)100％。如此高的致死率除患者自身免疫功能低下、基礎(chǔ)疾病多以外，還由于該菌具有多重耐藥性，導(dǎo)致對目前大多數(shù)抗菌藥物耐藥有關(guān)；其次是體外藥敏試驗結(jié)果對該菌的不確定性，一些最初敏感的抗菌藥物往往在治療過程中很快產(chǎn)生耐藥，從而導(dǎo)致治療的失敗而引起死亡。該菌耐藥機制復(fù)雜，包括膜通透性低、外排泵系統(tǒng)表達(dá)、產(chǎn)生鈍化酶和水解酶等，使其對臨床常用的多種抗菌藥物耐藥，甚至高度耐藥，尤其對碳青霉烯類天然耐藥，使該菌引起的相關(guān)感染的治療非常棘手。以往推薦的治療藥物有甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、氟喹諾酮類(左氧氟沙星)和替卡西林/克拉維酸。但是，隨著對該菌較有效的磺胺類藥物耐藥性的增加，個體差異導(dǎo)致的藥物耐受性差，使其臨床使用受到限制，其所致感染已成為臨床治療難點。目前，臨床上因無酶抑制劑或有效藥物出現(xiàn)，尤其新的抗菌藥物發(fā)展緩慢。目前針對嗜麥芽窄食單胞菌保護性抗原研究較少。三種常見非發(fā)酵革蘭陰性桿菌中，銅綠假單胞菌保護性抗原研究最早、內(nèi)容最多，并制成菌體滅活疫苗、組分疫苗及基因工程疫苗等多種形式的疫苗制劑，取得較大的進展，近期對鮑曼不動桿菌保護性抗原研究也增多，而國內(nèi)外針對嗜麥芽窄食單胞菌保護性抗原研究主要針對獸醫(yī)學(xué)或漁業(yè)，且非常有限。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種嗜麥芽窄食單胞菌外膜蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，獲自嗜麥芽窄食單胞菌，命名為Smlt4123蛋白，是如下(a1)-(a3)中任一種：(a1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a2)由序列表中序列4自N端第53-240位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a3)將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a1)中的Smlt4123蛋白便于純化和檢測，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(a3)中的Smlt4123蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達(dá)得到。上述(a3)中的Smlt4123蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述Smlt4123蛋白的基因(Smlt4123基因)也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因為如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：(b1)編碼區(qū)如序列表中序列3自5′末端第1至723位核苷酸所示的DNA分子；(b2)編碼區(qū)如序列表中序列3自5′末端第157至723位核苷酸所示的DNA分子；(b3)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)限定的DNA序列雜交且編碼與編碼所述Smlt4123蛋白的DNA分子；(b4)與(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼所述Smlt4123蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。含有所述Smlt4123基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還保護以Smlt4123蛋白作為抗原得到的抗體。本發(fā)明還保護Smlt4123蛋白或Smlt4123基因或所述抗體在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的用途為如下(c1)-(c3)中至少一種：(c1)抑制嗜麥芽窄食單胞菌；(c2)預(yù)防嗜麥芽窄食單胞菌感染；(c3)治療嗜麥芽窄食單胞菌感染。本發(fā)明還保護一種預(yù)防嗜麥芽窄食單胞菌感染的疫苗，其活性成分為Smlt4123蛋白或所述抗體。本發(fā)明還保護Smlt4123蛋白作為抗原在制備抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護Smlt4123蛋白的制備方法，包括如下步驟：將Smlt4123基因?qū)氤霭l(fā)菌，得到重組菌；培養(yǎng)所述重組菌，表達(dá)得到所述蛋白質(zhì)。所述Smlt4123基因可通過含有所述Smlt4123基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入出發(fā)菌?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體。使用所述編碼基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子；此外，使用所述編碼基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。所述重組表達(dá)載體具體可為在pET-30a(+)載體的多克隆位點插入序列表的序列1自5′端第1-567位所示的DNA分子得到的重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體具體可為將pET-30a(+)載體的EcoRI和XhoI酶切位點之間的小片段取代為序列表的序列1第1-567位所示的DNA分子得到的重組表達(dá)載體。所述出發(fā)菌具體可為大腸桿菌BL21(DE3)。所述方法中，所述培養(yǎng)重組菌的條件具體可為37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)。所述培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基具體可為LB液體培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)結(jié)束時得到OD600nm＝0.6的菌液。所述表達(dá)得到所述蛋白質(zhì)包括向所述菌液中加入IPTG進行誘導(dǎo)的步驟。IPTG在培養(yǎng)體系中的濃度可為1mM。從加入IPTG開始計時，培養(yǎng)時間可為4小時。所述誘導(dǎo)條件可為30-37℃、180rpm。所述誘導(dǎo)條件具體可為37℃、180rpm。所述誘導(dǎo)條件具體可為30℃、180rpm。所述表達(dá)得到所述蛋白質(zhì)還包括如下步驟：(d1)完成所述誘導(dǎo)后，收集菌體，進行菌體破碎，然后離心收集沉淀；(d2)取步驟(d1)得到的沉淀，進行蛋白變性，然后離心收集上清；(d3)取步驟(d2)得到的上清經(jīng)過鎳柱線性洗脫和尿素復(fù)性，得到所述蛋白質(zhì)溶液。所述步驟(d1)中，所述菌體破碎的方法可為超聲破碎。所述菌體破碎的方式具體可為將菌體使用超聲裂解液溶解后超聲。所述超聲時間具體可為1.5h。所述超聲裂解液中含有0.1MNaH2PO4、0.01MTris-Cl。所述超聲裂解液的pH值具體可為8.0。所述步驟(d2)中，所述蛋白變性具體可為將步驟(d1)得到的沉淀使用A液溶解變性。所述變性的溫度具體可為4℃。所述變性的時間具體可為12h。所述離心具體可為10000rpm離心15min。所述A液中含有8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01MTris-Cl。所述A液的pH值為8.0。所述步驟(d3)中，所述鎳柱線性洗脫具體可為用A液平衡柱子，然后將濾液上樣，然后進行洗脫(60min時間，B液在洗脫液中的體積分?jǐn)?shù)由0％線性上升至100％)，B液在洗脫液中的體積分?jǐn)?shù)為90％時出峰，收集出峰時的流穿蛋白溶液。所述A液中含有8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01MTris-Cl。所述A液的pH值為8.0。所述B液中含有8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01MTris-Cl。所述A液的pH值為4.0。以上任一所述抗體為多克隆抗體。所述抗體的用途為如下(c1)-(c3)中至少一種：(c1)抑制嗜麥芽窄食單胞菌；(c2)預(yù)防嗜麥芽窄食單胞菌感染；(c3)治療嗜麥芽窄食單胞菌感染。以上任一所述抑制嗜麥芽窄食嗜單胞菌具體可為抑制血液中的嗜麥芽窄食單胞菌。以上任一所述嗜麥芽窄食單胞菌具體可為嗜麥芽窄食單胞菌K279a。本發(fā)明提供了一種嗜麥芽窄食單胞菌外膜蛋白，經(jīng)過實驗證明，該蛋白具有較強的免疫原性，制備的免疫血清調(diào)理的全血殺傷試驗發(fā)現(xiàn)在體外該蛋白可以降低血中菌載量，且攻毒試驗顯示該蛋白免疫產(chǎn)生抗體在體內(nèi)亦可降低血中菌載量，具有一定的保護作用，可作為重點疫苗候選分子。附圖說明圖1為實施例1蛋白純化過程中各組分SDS-PAGE分析結(jié)果。圖2為實施例2抗血清效價測定結(jié)果。圖3為實施例4相對保護率統(tǒng)計結(jié)果。圖4為實施例5小鼠體內(nèi)攻毒試驗統(tǒng)計結(jié)果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。嗜麥芽窄食單胞菌K279a：參考文獻(xiàn)：AvisonMB，vonHeldreichCJ，HigginsCS，BennettPM，WalshTR.ATEM-2beta-lactamaseencodedonanactiveTnl-liketransposoninthegenomeofaclinicalisolateofStenotrophomonasmaltophilia.JAntimicrobChemother，2000，46(6)：879-884.，嗜麥芽窄食單胞菌K279a在文獻(xiàn)中的名稱為“S.maltophiliaK279a”；公眾可以從中國人民解放軍307醫(yī)院獲得。pET-30a(+)載體：Novagen公司。大腸桿菌BL21(DE3)：北京全式金生物科技有限公司。BALB/c小鼠：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗動物中心。弗氏完全佐劑：Sigma公司。弗氏不完全佐劑：Sigma公司。HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實施例1、嗜麥芽窄食單胞菌外膜蛋白的表達(dá)與純化1、提取嗜麥芽窄食單胞菌K279a的基因組DNA。2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用引物P1和引物P2進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。P1：5′CGGAATTCCAGGACAGCAGCTCCACCGAT-3′；P2：5′-CCCTCGAGTCAGAAGCGGGCACCGAT-3′。P1和P2中，下劃線分別標(biāo)注EcoRI和XhoI酶切位點。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切步驟2的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)4、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切pET-30a(+)載體，回收約5388bp的載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組載體pET-30a-Smlt4123。根據(jù)測序結(jié)果，對重組載體pET-30a-Smlt4123進行結(jié)構(gòu)描述如下：將pET-30a(+)載體的EcoRI和XhoI酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列1的自5′端第1-567位核苷酸所示的DNA分子。序列1所示的DNA分子編碼序列2所示的蛋白質(zhì)。將序列2所示的蛋白質(zhì)命名為Smlt4123蛋白，由188個氨基酸殘基組成。將蛋白Smlt4123的編碼基因命名為Smlt4123基因。Smlt4123基因編碼區(qū)如序列表中序列1所示(567bp)。外源插入的DNA分子與載體骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列3所示的融合基因，編碼序列表的序列4所示的融合蛋白。序列表的序列4中，自N端第53-240位氨基酸殘基為Smlt4123蛋白區(qū)段。序列表的序列3中，自5’端第157-723位核苷酸為Smlt4123基因區(qū)段。6、將步驟5得到的重組載體pET-30a-Smlt4123轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌，將重組菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm＝0.6。取菌液進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見圖1的泳道1。7、向步驟6得到的菌液中加入IPTG并使其在體系中的濃度為1mM，30℃、180rpm誘導(dǎo)4h。誘導(dǎo)結(jié)束將整個體系離心，收集菌體。取菌體和上清分別進行SDS-PAGE電泳分析，上清的分析結(jié)果見圖1的泳道2，菌體的分析結(jié)果見圖1的泳道3。8、向步驟6得到的菌液中加入IPTG并使其在體系中的濃度為1mM，37℃、180rpm誘導(dǎo)4h。誘導(dǎo)結(jié)束將整個體系離心，收集菌體。取菌體和上清分別進行SDS-PAGE電泳分析，上清的分析結(jié)果見圖1的泳道4，菌體的分析結(jié)果見圖1的泳道5。根據(jù)步驟7和步驟8的SDS-PAGE電泳分析判斷，目的蛋白以包涵體形式出現(xiàn)。9、將步驟8收集的菌體，線性洗脫方式純化，得到重組蛋白ompW溶液，具體步驟如下：(1)將收集的菌體用超聲裂解液(0.1MNaH2PO4、0.01MTris-Cl，pH8.0)超聲1.5h后離心收集沉淀，將沉淀用0.2MNaCl水溶液洗滌兩次，然后用1％(體積百分比)的Triton-100洗滌一次。(2)采用A液(8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01MTris-Cl，pH8.0)溶解步驟(1)的沉淀，4℃變性12h，然后10000rpm離心15min，取上清，0.45mm濾膜過濾并收集濾液。(3)將步驟(2)得到的濾液進行鎳柱線性洗脫(pH8.0-pH4.0)。洗脫液由A液(8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01MTris-Cl，pH8.0)和B液(8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01MTris-Cl，pH4.0)組成。用A液平衡柱子，然后將濾液上樣，然后進行洗脫(60min時間，B液在洗脫液中的體積分?jǐn)?shù)由0％線性上升至100％)，B液在洗脫液中的體積分?jǐn)?shù)為90％時出峰，收集出峰時的流穿蛋白溶液。(4)將步驟(3)得到的流穿蛋白溶液用含有1M尿素的透析液4℃過夜透析復(fù)性，得到重組蛋白ompW溶液。10、采用pET-30a(+)載體替代重組載體pET-30a-Smlt4123，按照步驟6-9進行操作，得到對照蛋白溶液。實施例2、重組蛋白ompW免疫小鼠制備抗血清實驗小鼠：雄性BALB/c小鼠(6-8周)。1、分別將步驟9得到的重組蛋白ompW溶液和步驟10得到的對照蛋白溶液進行蛋白定量并稀釋至100μg/ml，得到重組蛋白ompW稀釋液和對照蛋白稀釋液。2、將實驗小鼠隨機分為兩組(每組10只)。第0天時分組進行如下操作：實驗組：取免疫前血清(眼眶取血，室溫靜置60min后2500rpm離心5min，取上層血清，即為免疫前血清)，然后采用重組蛋白ompW抗原乳劑I免疫實驗小鼠(腹部、背部進行皮下多點注射，100μL/只)。對照組：取免疫前血清(眼眶取血，室溫靜置60min后2500rpm離心5min，取上層血清，即為免疫前血清)，然后采用對照蛋白抗原乳劑I免疫實驗小鼠(腹部、背部進行皮下多點注射，100μL/只)。重組蛋白ompW抗原乳劑I的配置方法為：弗氏完全佐劑與重組蛋白ompW稀釋液等體積混合乳化。對照蛋白抗原乳劑I的配置方法為：弗氏完全佐劑與對照蛋白稀釋液等體積混合乳化。第14天和第28天時分組進行如下操作：實驗組：取重組蛋白ompW抗原乳劑II免疫實驗小鼠(腹部、背部進行皮下多點注射，100μL/只)。對照組：取對照蛋白抗原乳劑II免疫實驗小鼠(腹部、背部進行皮下多點注射，100μL/只)。重組蛋白ompW抗原乳劑II的配置方法為：弗氏不完全佐劑與重組蛋白ompW稀釋液等體積混合乳化。對照蛋白抗原乳劑II的配置方法為：弗氏不完全佐劑與對照蛋白稀釋液等集體混合乳化。第29天，各組小鼠眼眶取血，室溫靜置60min后2500rpm離心5min取上層血清，得到免疫后血清。實施例3、抗血清效價測定待測血清：實施例2得到的免疫前血清、實驗組免疫后血清、對照組免疫后血清。1、將待測血清使用PBST緩沖液1∶1×105稀釋，得到待測血清稀釋液。2、將實施例1得到的重組蛋白ompW溶液定量并稀釋至10μg/ml后加入96孔板中(每孔100μl)，4℃過夜包被。3、完成步驟2后，棄掉孔內(nèi)溶液，采用0.5％(體積百分比)PBST溶液洗板。4、完成步驟3后，每孔加入100μL步驟1的待測血清稀釋液，37℃孵育30min。5、完成步驟4后，棄掉孔內(nèi)溶液，采用0.5％(體積百分比)PBST溶液洗板。6、完成步驟5后，每孔加入100μL用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1：8000稀釋)，37℃孵育30min。7、完成步驟6后，棄掉孔內(nèi)溶液，采用0.5％(體積百分比)PBST溶液洗板。8、完成步驟7后，每孔加入TMB顯色液A液、B液各50μL，避光顯色5-10min。9、完成步驟8后，每孔加入50μL終止液(2mol/L硫酸水溶液)，用酶聯(lián)檢測儀讀取反應(yīng)體系在OD450nm下的吸光度值。間接ELISA法測抗體滴度的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：所測抗體OD450nm值大于0.2且與對照孔OD450nm的比值大于等于2.1時所測抗體的最大稀釋度。通常當(dāng)抗體滴度達(dá)到1×105時認(rèn)為抗體效價達(dá)到要求。實驗組免疫前、后血清抗體1∶102400稀釋后的實驗結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，實驗組免疫后血清抗體1∶102400稀釋后OD450nm值大于0.2且與對照組OD450nm值的比值大于2.1，達(dá)到抗體效價要求，而免疫前血清不能滿足上述條件。上述結(jié)果表明，重組蛋白ompW具有較強的免疫原性。實施例4、重組蛋白ompW抗血清調(diào)理殺傷作用待測血清：實施例2得到的免疫前血清、實驗組免疫后血清。1、將待測血清使用PBST緩沖液按照1∶1稀釋，得到待測血清稀釋液。2、將嗜麥芽窄食單胞菌K279a接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)至OD600nm＝1.0(濃度約4.0×108CFU/mL)。3、取1mL步驟2得到的菌液，8000rpm離心5min，去上清，用100μL無菌PBS重懸菌體沉淀，得到菌懸液。4、向步驟3得到的菌懸液中加入50μL待測血清稀釋液，37℃，20rpm孵育30min后加入350μL健康人全血，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中20rpm孵育1h。5、完成步驟4后，取100μL步驟4處理后的菌懸液涂布于LB平板，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16h后統(tǒng)計菌落數(shù)，計算相對保護率。實驗重復(fù)兩次。相對保護率＝1-(免疫后血清處理后的菌落數(shù)/免疫前血清處理后的平均菌落數(shù))。結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，重組蛋白ompW的抗血清調(diào)理人全血對嗜麥芽窄食單胞菌的相對保護率為37％左右。實施例5、小鼠體內(nèi)攻毒試驗實驗小鼠：雄性BALB/c小鼠(6-8周)。1、將嗜麥芽窄食單胞菌K279a接種于LB培養(yǎng)基中，LB培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)至OD600nm＝1.0(濃度約4.0×108CFU/mL)。2、取1mL步驟1得到的菌液，8000rpm離心5min，去上清，用200μL無菌PBS重懸菌體沉淀，得到菌懸液。3、采用實施例2中的方法免疫小鼠，第29天時給對照組小鼠和實驗組小鼠腹腔注射步驟2得到的菌懸液(200μL/只)，8h后摘眼球取血，取100μL血液均勻涂布于LB平板，于37℃孵育箱中靜置孵育24h后進行菌落計數(shù)。結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，實驗組和對照組有顯著差異，重組蛋白ompW作為抗原產(chǎn)生抗體可以有效的減少感染小鼠血中的細(xì)菌數(shù)，清除該菌在血中的生長，具有一定的保護作用。<110>中國人民解放軍第307醫(yī)院<120>一種嗜麥芽窄食單胞菌外膜蛋白及其應(yīng)用<160>4<210>1<211>567<212>DNA<213>嗜麥芽窄食單胞菌<400>1caggacagcagctccaccgataccgcttcgggcaagcattttgccgtggttggcggcgtc60gcgctgctgcagccgaagaatgatccgatcgacggcatcaagaaggtcgatggtggcccg120gcgccgaccgtcagcttcagctactacatcaacgacaactgggccgttgaactgtggggc180gccgccgacaagttcgaccacaaggtgaagggcccgaacaatgcccgcctgggcaacgtc240gagcagcagccggtcgcgctgagcggccagtaccacttcggccaggctgacaacgtgttc300cgtccgttcgtgggcgtgggctactaccagtccagcttcagcaatgaaacgctggccgac360ggcagcagctccgacatccgcctcaaggacgccaagggcgtgatcggcaccgtcggcgtg420gacatgaacatcaactccacctggttcgcccgtgccgatgcccgctacatgcgttcgcgt480ccggacgtgaaggtcggcggcgagaagatcggcgaagccaagatggatccgtggaccgtc540ggcttcggcatcggtgcccgcttctga567<210>2<211>188<212>PRT<213>嗜麥芽窄食單胞菌<400>2GlnAspSerSerSerThrAspThrAlaSerGlyLysHisPheAlaVal151015ValGlyGlyValAlaLeuLeuGlnProLysAsnAspProIleAspGly202530IleLysLysValAspGlyGlyProAlaProThrValSerPheSerTyr354045TyrIleAsnAspAsnTrpAlaValGluLeuTrpGlyAlaAlaAspLys505560PheAspHisLysValLysGlyProAsnAsnAlaArgLeuGlyAsnVal65707580GluGlnGlnProValAlaLeuSerGlyGlnTyrHisPheGlyGlnAla859095AspAsnValPheArgProPheValGlyValGlyTyrTyrGlnSerSer100105110PheSerAsnGluThrLeuAlaAspGlySerSerSerAspIleArgLeu115120125LysAspAlaLysGlyValIleGlyThrValGlyValAspMetAsnIle130135140AsnSerThrTrpPheAlaArgAlaAspAlaArgTyrMetArgSerArg145150155160ProAspValLysValGlyGlyGluLysIleGlyGluAlaLysMetAsp165170175ProTrpThrValGlyPheGlyIleGlyAlaArgPhe180185<210>3<211>723<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3atgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaa60accgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgac120gacgacaaggccatggctgatatcggatccgaattccaggacagcagctccaccgatacc180gcttcgggcaagcattttgccgtggttggcggcgtcgcgctgctgcagccgaagaatgat240ccgatcgacggcatcaagaaggtcgatggtggcccggcgccgaccgtcagcttcagctac300tacatcaacgacaactgggccgttgaactgtggggcgccgccgacaagttcgaccacaag360gtgaagggcccgaacaatgcccgcctgggcaacgtcgagcagcagccggtcgcgctgagc420ggccagtaccacttcggccaggctgacaacgtgttccgtccgttcgtgggcgtgggctac480taccagtccagcttcagcaatgaaacgctggccgacggcagcagctccgacatccgcctc540aaggacgccaagggcgtgatcggcaccgtcggcgtggacatgaacatcaactccacctgg600ttcgcccgtgccgatgcccgctacatgcgttcgcgtccggacgtgaaggtcggcggcgag660aagatcggcgaagccaagatggatccgtggaccgtcggcttcggcatcggtgcccgcttc720tga723<210>4<211>240<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>4MetHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySer151015GlyMetLysGluThrAlaAlaAlaLysPheGluArgGlnHisMetAsp202530SerProAspLeuGlyThrAspAspAspAspLysAlaMetAlaAspIle354045GlySerGluPheGlnAspSerSerSerThrAspThrAlaSerGlyLys505560HisPheAlaValValGlyGlyValAlaLeuLeuGlnProLysAsnAsp65707580ProIleAspGlyIleLysLysValAspGlyGlyProAlaProThrVal859095SerPheSerTyrTyrIleAsnAspAsnTrpAlaValGluLeuTrpGly100105110AlaAlaAspLysPheAspHisLysValLysGlyProAsnAsnAlaArg115120125LeuGlyAsnValGluGlnGlnProValAlaLeuSerGlyGlnTyrHis130135140PheGlyGlnAlaAspAsnValPheArgProPheValGlyValGlyTyr145150155160TyrGlnSerSerPheSerAsnGluThrLeuAlaAspGlySerSerSer165170175AspIleArgLeuLysAspAlaLysGlyValIleGlyThrValGlyVal180185190AspMetAsnIleAsnSerThrTrpPheAlaArgAlaAspAlaArgTyr195200205MetArgSerArgProAspValLysValGlyGlyGluLysIleGlyGlu210215220AlaLysMetAspProTrpThrValGlyPheGlyIleGlyAlaArgPhe225230235240當(dāng)前第1頁1 2 3