本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種軟骨細(xì)胞的增殖培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：關(guān)節(jié)軟骨是一種由軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)和ii型膠原組成的透明軟骨，關(guān)節(jié)的創(chuàng)傷和炎癥均可引起關(guān)節(jié)軟骨的損傷。由于關(guān)節(jié)軟骨再生能力有限，如果人軟骨先天缺損或者后天損傷或缺損時(shí)，通常不會(huì)再生，難以自行修復(fù)。關(guān)節(jié)軟骨的損傷會(huì)導(dǎo)致患者的關(guān)節(jié)反復(fù)疼痛和活動(dòng)受限，嚴(yán)重影響了患者的日常生活。作為治療人軟骨疾病的現(xiàn)有方法，有從自身的其他部位采集軟骨組織移植到缺損部位的方法，但存在采集部位和數(shù)量有限的問題。因此，關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù)一直是骨科研究的重要課題之一。軟骨組織工程技術(shù)是在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增軟骨種子細(xì)胞，并且以較高濃度將其種植于具有良好的生物相容性和降解性的支架材料上構(gòu)建組織工程軟骨，然后植入到組織缺損部位，完成組織的修復(fù)和重建。軟骨組織工程的最終目的就是得到高質(zhì)量的修復(fù)組織和長期有效的功能，為病人最終解決痛苦。從這種意義上看，組織工程方法是目前治療關(guān)節(jié)軟骨損傷最有希望的方法，是目前軟骨損傷修復(fù)研究的主要方面。近年來，研究者致力于應(yīng)用組織工程學(xué)治療修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的研究，但其前提條件是獲取足夠數(shù)量的軟骨細(xì)胞，即關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)及擴(kuò)增問題。使用軟骨細(xì)胞移植的方法存在三個(gè)問題，即：侵襲采集部位的問題、細(xì)胞數(shù)量及增殖的問題與維持形態(tài)時(shí)間的問題。針對(duì)第一個(gè)問題，侵襲采集部位的問題，是指采集用于培養(yǎng)軟骨的軟骨時(shí)，導(dǎo)致該部位缺損、凹陷等畸形或功能障礙，現(xiàn)有常用解決方案是采集肋軟骨組織用于后續(xù)細(xì)胞分離培養(yǎng)。針對(duì)第三個(gè)問題，長期維持形態(tài)的問題，是指由培養(yǎng)的軟骨再生的組織長期未被吸收，是否可以持續(xù)維持其形態(tài)的問題，這取決于第二個(gè)問題的解決。目前的研究者或醫(yī)務(wù)人員認(rèn)為，如果能獲得足夠量的軟骨細(xì)胞，就能夠解決第三個(gè)問題或者至少能夠緩解患者疼痛，因?yàn)檐浌堑娜睋p導(dǎo)致骨與骨之間相互碰撞摩擦從而刺激或損傷神經(jīng)，產(chǎn)生劇烈疼痛，但是在骨與骨之間存在足夠量的細(xì)胞就會(huì)顯著緩解上述問題。因此，需要提供一種可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基及其方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種軟骨細(xì)胞的增殖培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)方法。該增殖培養(yǎng)基可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖；該培養(yǎng)方法細(xì)胞獲得周期短、數(shù)量較多，獲得細(xì)胞的活率也較高。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種軟骨細(xì)胞的增殖培養(yǎng)基，包括l-谷氨酰胺、胎牛血清、脯氨酸、非必須氨基酸、雞胚提取物、青霉素、鏈霉素和高糖dmem液體培養(yǎng)基。作為優(yōu)選，增殖培養(yǎng)基中各組分用量為：在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，增殖培養(yǎng)基中各組分用量為：作為優(yōu)選，增殖培養(yǎng)基的ph值為7.2～7.4。作為優(yōu)選，非必須氨基酸為甘氨酸(glycine)、l-丙氨酸(l-alanine)、l-天門冬酰胺(l-asparagine)、l-天冬氨酸(l-asparticacid)、l-谷氨酸(l-glutamicacid)、l-脯氨酸(l-proline)或l-絲氨酸(l-serine)中的一種或幾種。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，非必須氨基酸為甘氨酸、l-丙氨酸、l-天門冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸或l-絲氨酸的混合物。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，甘氨酸的濃度為0.01mm，l-丙氨酸的濃度為0.01mm，l-天門冬酰胺的濃度為0.01mm，l-天冬氨酸的濃度為0.01mm，l-谷氨酸的濃度為0.01mm，l-脯氨酸的濃度為0.01mm，l-絲氨酸的濃度為0.01mm。作為優(yōu)選，雞胚提取物的制備方法為：去除雞胚中的雞眼，然后將去除雞眼的雞胚進(jìn)行勻漿，用等體積的dmem稀釋，在15～30℃、10～100rpm/min條件下?lián)u動(dòng)1～3h，而后轉(zhuǎn)移至-80～-70℃條件下凍存48h以上，解凍后離心，收集上清液，經(jīng)過濾除菌，得到雞胚提取物。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，雞胚提取物的制備方法為：去除雞胚中的雞眼，然后將去除雞眼的雞胚進(jìn)行勻漿，用等體積的dmem稀釋，在室溫、50rpm/min條件下?lián)u動(dòng)2h，而后轉(zhuǎn)移至-70℃條件下凍存48h以上，解凍后離心，收集上清液，經(jīng)過濾除菌，得到雞胚提取物。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，離心為在15000g下離心10min。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，在收集上清液與過濾除菌之間還包括離心的步驟。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，在收集上清液與過濾除菌之間的離心為在700g下離心10min。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，過濾除菌為分別采用0.45μm、0.22μm的濾膜進(jìn)行過濾除菌。作為優(yōu)選，過濾除菌之后還包括純化的步驟。在本發(fā)明中，獲得的雞胚提取物可以適當(dāng)脫鹽后直接使用。此外，也可以通過使用超濾膜、凝膠過濾、各種柱色譜、膜濾器、等電點(diǎn)的方法等進(jìn)行精制、分級(jí)后使用。作為優(yōu)選，雞胚為10～12d的雞胚。本發(fā)明還提供了一種軟骨細(xì)胞的增殖培養(yǎng)方法，采用本發(fā)明提供的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)軟骨細(xì)胞。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，增殖培養(yǎng)方法包括：將軟骨細(xì)胞接種于含5％fbs的高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)1天；然后接種到本發(fā)明提供的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)3～10天。作為優(yōu)選，軟骨細(xì)胞的接種密度為(0.3～5)×104個(gè)/cm2。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，培養(yǎng)的條件為5％co2、37℃。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，增殖培養(yǎng)方法包括：將軟骨細(xì)胞以2×104個(gè)/cm2的密度接種到培養(yǎng)容器中，添加含5％fbs的高糖dmem培養(yǎng)基，于5％co2、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)1天后，用不含血清的高糖dmem培養(yǎng)基洗滌1次，添加與含5％fbs的高糖dmem培養(yǎng)基等體積的本發(fā)明增殖培養(yǎng)基，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)3～10天。在本發(fā)明中，雞胚提取物具有軟骨細(xì)胞增殖促進(jìn)作用、軟骨障礙的預(yù)防治療或改善作用、關(guān)節(jié)痛的預(yù)防治療或改善作用等，因此能夠適合作為軟骨細(xì)胞增殖促進(jìn)劑、軟骨障礙的預(yù)防治療或改善劑、及關(guān)節(jié)痛的預(yù)防治療或改善劑等的有效成分使用。其中，軟骨障礙，可以列舉例如變形性關(guān)節(jié)癥、軟骨的缺損、軟骨損傷、半月板損傷等。本發(fā)明提供了一種軟骨細(xì)胞的增殖培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)方法。該增殖培養(yǎng)基包括l-谷氨酰胺、胎牛血清、脯氨酸、非必須氨基酸、雞胚提取物、青霉素、鏈霉素和高糖dmem液體培養(yǎng)基。本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)將雞胚提取物添加入本發(fā)明增殖培養(yǎng)基可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖；本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法細(xì)胞獲得周期短、數(shù)量多，獲得細(xì)胞的活率高。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種軟骨細(xì)胞的增殖培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的軟骨細(xì)胞的增殖培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)方法中所用試劑或儀器均可由市場(chǎng)購得。以下實(shí)施例中使用的非必須氨基酸購自gbico公司，為100×非必須氨基酸，在使用時(shí)為1×非必須氨基酸，即99ml培養(yǎng)基中添加1ml100×非必須氨基酸，使用濃度換算為0.01mm。l-谷氨酰胺購自sigma公司，胎牛血清購自gibco公司，脯氨酸購自sigma公司，青霉素-鏈霉素混合溶液購自gibco公司。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1：雞胚提取液的制備取10-12d的雞胚，消毒，于氣室位置，小心剪開蛋殼，剝除膜，用鑷子挑出雞胚置入無菌玻璃皿，去除雞眼后經(jīng)pbs充分清洗血液、卵黃，回收空蛋殼，重復(fù)以上步驟直至制備完足夠數(shù)量的雞胚為止。提取物經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎勻漿，用等體積的dmem稀釋，盛放于其1.5倍大體積的玻璃瓶中，并于室溫條件下，于搖床內(nèi)50rpm/min搖動(dòng)2h，而后轉(zhuǎn)移至–70℃冰箱中凍存48h以上，隨后解凍，分裝，于15000g下離心10min，收集上清液，分裝保存。在臨用前，將提取物再于700g下，離心10min，去除絮狀物，并分別用0.45μm和0.22μm濾膜過濾除菌，獲得的濾液即為雞胚提取液。實(shí)施例2：增殖培養(yǎng)基的配制本實(shí)施例增殖培養(yǎng)基的配方與制備方法如下：高糖dmem液體培養(yǎng)基，2％l-谷氨酰胺，20％胎牛血清，0.4mm脯氨酸，1×非必須氨基酸，0.5％實(shí)施例1制備的雞胚提取液，5×104u/l青霉素，5×104u/l鏈霉素，ph：7.2～7.4，用0.45μm、0.22μm雙濾膜過濾除菌，分裝后置于4℃冷藏柜中保存?zhèn)溆?。?shí)施例3：增殖培養(yǎng)基的配制本實(shí)施例增殖培養(yǎng)基的配方與制備方法如下：高糖dmem液體培養(yǎng)基，2％l-谷氨酰胺，20％胎牛血清，0.4mm脯氨酸，1×非必須氨基酸，2％實(shí)施例1制備的雞胚提取液，5×104u/l青霉素，5×104u/l鏈霉素，ph：7.2～7.4，用0.45μm、0.22μm雙濾膜過濾除菌，分裝后置于4℃冷藏柜中保存?zhèn)溆?。?shí)施例4：增殖培養(yǎng)基的配制本實(shí)施例增殖培養(yǎng)基的配方與制備方法如下：高糖dmem液體培養(yǎng)基，2％l-谷氨酰胺，20％胎牛血清，0.4mm脯氨酸，1×非必須氨基酸，5％實(shí)施例1制備的雞胚提取液，5×104u/l青霉素，5×104u/l鏈霉素，ph：7.2～7.4，用0.45μm、0.22μm雙濾膜過濾除菌，分裝后置于4℃冷藏柜中保存?zhèn)溆?。試?yàn)例1：增殖培養(yǎng)基對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的效果的研究本試驗(yàn)例使用來自小鼠胚細(xì)胞的軟骨細(xì)胞樣分化的atdc5(rikenbank、rbc0565)培養(yǎng)細(xì)胞株。將atdc5以2×104個(gè)/cm2的密度接種到96孔板，每孔添加100μl含5％fbs(胎牛血清)的高糖dmem培養(yǎng)基，于5％co2、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)1天后，用不含血清的高糖dmem培養(yǎng)基洗滌1次。對(duì)照組各孔添加不含雞胚提取液的100μl的高糖dmem培養(yǎng)基。試驗(yàn)組各孔添加含不同濃度的雞胚提取液的高糖dmem培養(yǎng)基(實(shí)施例2-4培養(yǎng)基)。在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)3天，培養(yǎng)結(jié)束后，用mtt法測(cè)定細(xì)胞數(shù)。以％值(增殖值)形式計(jì)算出將雞胚提取液無添加組的細(xì)胞數(shù)設(shè)為100％時(shí)的不同添加量組的細(xì)胞數(shù)。各組培養(yǎng)基配方見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。表1：試驗(yàn)組和對(duì)照組增殖培養(yǎng)基配方表2：細(xì)胞獲得率及增值率分組3天細(xì)胞獲得率增值率(％)對(duì)照組3.49×104個(gè)/孔100實(shí)驗(yàn)組14.51×104個(gè)/孔129.2實(shí)驗(yàn)組25.35×106個(gè)/孔153.3實(shí)驗(yàn)組36.53×106個(gè)/孔187.1如上表所示，雞胚提取液使atdc5細(xì)胞用量依賴性地增加，即表明其對(duì)軟骨細(xì)胞具有顯著的增殖促進(jìn)作用。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12