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一種全人源化EGFRvIII嵌合抗原受體T細胞及其制備方法與流程

文檔序號:11145076閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種全人源化EGFRvIII CART細胞,其特征在于,所述T細胞表面表達全人源化EGFRvIII CAR基因,其堿基序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根據權利要求1所述的全人源化EGFRvIII CART細胞,其特征在于,所述全人源化EGFRvIII CAR基因是由合成的ScFV基因和合成的3代CAR結構基因通過重疊PCR進行拼接。

3.根據權利要求2所述的全人源化EGFRvIII CART細胞,其特征在于,所述合成的ScFV基因包括編碼CD8信號肽的核苷酸+全人源化139抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸密碼子優(yōu)化的核苷酸+編碼linker(G4S)3的核苷酸+全人源化139抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸密碼子優(yōu)化的核苷酸序列,其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根據權利要求2所述的全人源化EGFRvIII CART細胞,其特征在于,所述合成的3代CAR結構基因包括編碼CD8鉸鏈區(qū)+CD28跨膜區(qū)、胞漿區(qū)+4-1BB胞漿區(qū)+CD3ζ胞漿區(qū)的核苷酸片段,其堿基序列如SEQ ID NO:2所示。

5.一種如權利要求1-4之一所述的全人源化EGFRvIII CART細胞的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:

(1)構建3代慢病毒CAR載體:首先將合成的ScFV基因或合成的3代CAR結構基因分別擴增PCR,得到合成的ScFV基因片段的PCR產物和合成的3代CAR結構基因片段的PCR產物;然后進行重疊PCR將這兩個基因片段的PCR產物連接在一起,得到3代CAR結構的EGFRvIII CAR基因;最后將Pre-Lenti-EF1-MCS載體和EGFRvIII CAR基因雙酶切,連接,轉化,提質粒,測序,得到序列正確的表達EGFRvIII CAR的慢病毒載體Pre-Lenti-EF1-EGFRvIII CAR;

(2)包裝EGFRvIII CAR慢病毒,感染T細胞,制備得到CART,進行細胞殺傷實驗驗證,證明有效;

(3)再次制備EGFRvIII CART,進行動物實驗功能驗證,證明有效。

6.根據權利要求5所述的全人源化EGFRvIII CART細胞的制備方法,其特征在于,步驟(1)中,用于所述擴增PCR的引物為EGFRvIII-EcoRI-up序列如SEQ ID NO:4所示和EGFRvIII-BamHI-down序列如SEQ ID NO:5所示。

7.根據權利要求5所述的全人源化EGFRvIII CART細胞的制備方法,其特征在于,步驟(1)中,用于所述重疊PCR的引物為Middle-R如SEQ ID NO:6所示和Middle-F如SEQ ID NO:7所示。

8.根據權利要求5所述的全人源化EGFRvIII CART細胞的制備方法,其特征在于,步驟(1)中,所述測序引物為Pre-up-Seq,如SEQ ID NO:8所示和Pre-down-Seq,如SEQ ID NO:9所示。

9.根據權利要求5所述的全人源化EGFRvIII CART細胞的制備方法,其特征在于,步驟(1)中,所述雙酶為EcoRI限制性內切酶和BamHI限制性內切酶。

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