本發(fā)明涉及一種融合基因，具體的說是一種具有抑制hiv-1作用的融合基因betatrcp-cypa及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，hiv)俗稱艾滋病（acquiredmedeficiencysyndrome,aids)病毒，誘發(fā)人類獲得性免疫缺陷綜合征。自1984年首次報(bào)道艾滋病毒（hiv-1)為引起艾滋?。╝ids)的病原以來，全世界大批頂尖的科學(xué)家都致力于攻克這一疫病。haart等療法已顯著降低了艾滋病的發(fā)生率和死亡率。但是，由于只能抑制hiv-1復(fù)制，無法清除細(xì)胞內(nèi)感染的病毒，所以需要長期不間斷用藥，一旦停藥即出現(xiàn)病毒反跳現(xiàn)象。長期大量的服用抗病毒藥給患者帶來了一系列問題，例如有些藥物對病人有線粒體毒性、嚴(yán)重胃腸道反應(yīng)等副作用等。

目前艾滋病防治方面也有針對hiv-1的有關(guān)疫苗，由于h1v基因變異問題，使得hiv-1能逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，這是hiv-1疫苗研制的主要障礙。因此，單純應(yīng)用疫苗防治艾滋病效果不理想。

目前有關(guān)作用于hiv-1輔助受體方面的藥物，似乎也逃避了hiv-1的變異問題，但其作用也只是阻止hiv-1進(jìn)入細(xì)胞，不能降解或殺死病毒。

目前針對hiv-1的haart等療法已顯著降低了艾滋病的發(fā)生率和死亡率。但是，由于只能抑制hiv-1復(fù)制，無法清除細(xì)胞內(nèi)感染的病毒，所以需要長期不間斷用藥，一旦停藥即出現(xiàn)病毒反跳現(xiàn)象。

近年來，隨著人們對泛素一蛋白酶體途徑(ubiq-uitin-proteasomepathway，upp)認(rèn)識(shí)的不斷深人，人們利用upp具有特異性降解蛋白底物的功能特點(diǎn)，提出了靶向泛素化降解蛋白質(zhì)技術(shù)，也稱為蛋白質(zhì)敲減技術(shù)，其核心就是構(gòu)建某個(gè)能夠與靶蛋白特異結(jié)合的e3，該e3含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即功能結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域。靶向泛素化降解蛋白質(zhì)技術(shù)與基因沉默等技術(shù)的比較具有優(yōu)勢，如在敲減對象方面，靶向泛素化降解蛋白質(zhì)技術(shù)能有效針對某一類修飾后的目的蛋白進(jìn)行敲減，在作用時(shí)效方面，在靈活性方面，在應(yīng)用規(guī)模方面更有優(yōu)勢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種基于設(shè)計(jì)的具有抑制hiv-1作用的融合基因betatrcp-cypa及其構(gòu)建方法，構(gòu)建的融合基因betatrcp-cypa能夠降解hiv-1gag，能抑制hiv-1病毒。

一種具有抑制hiv-1作用的融合基因betatrcp-cypa，能抑制hiv-1病毒，其基因序列如seqidno:1所示。

所述基于泛素連接酶抑制hiv-1的融合基因betatrcp-cypa的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

步驟一、根據(jù)genbank中登陸號(hào)為nm_003939記載的人betatrcp基因n端序列，利用dnastar等對betatrcp基因n端序列進(jìn)行優(yōu)化得到優(yōu)化后的人betatrcp基因n端序列，然后進(jìn)行人工合成得到優(yōu)化后的betatrcp基因n端dna；優(yōu)化后betatrcp基因n端dna的堿基序列如序列表seqidno:2所示；

步驟二、設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：

b1：5'ggaattcgccaccatggacccagcagaagcagtg3'；

b2：5'actgtgtcttccgcatctccag3'；

b3：5'ctggagatgcggaagacacagtggctcaggatcaggctcagga

tcaggctcaatggtcaaccccaccgtgttct3'；（下劃線部分是含5個(gè)絲甘氨酸結(jié)構(gòu)的dna）

b4：5'cgggatccttcgagttgtccacagtcagca3'；

c1：5'ggaattcgccaccatggtcaaccccaccgtgttc3'；

步驟三、以betatrcp基因n端dna序列為模板，以b1和b2為引物擴(kuò)增betatrcp基因n端部分，得到betatrcp基因n端dna片段；以cypacdna（seqidno:3）質(zhì)粒為模版，以b3和b4為引物擴(kuò)增cypa部分，得到cypacdna片段；分別取1μlbetatrcp基因n端部分片段pcr產(chǎn)物和1μlcypadna片段pcr產(chǎn)物作為模板，以b1和b4為引物pcr擴(kuò)增融合基因betatrcp-cypa，擴(kuò)增出目的條帶，大小1300bp。分別用ecori/bamhi雙酶切融合基因betatrcp-cypa和pcdna3.1his載體，將酶切后的融合基因betatrcp-cypa克隆入pcdna3.1his載體。

步驟三中所述以b1和b2為引物擴(kuò)增betatrcp基因n端序列，98℃預(yù)變性15s，再98℃10s，58℃15s，再72℃60s，28個(gè)循環(huán)，以cypacdna質(zhì)粒為模版，以b3和b4為引物擴(kuò)增cypa部分，其擴(kuò)增條件均：98℃預(yù)變性15s，再98℃10s，58℃15s，再72℃30s，28個(gè)循環(huán)。

步驟三中所述以b1和b4為引物pcr擴(kuò)增融合基因betatrcp-cypa，其擴(kuò)增條件均：98°c預(yù)變性15s，再98°c10s，58°c15s，再72°c90s，30個(gè)循環(huán)。

有益效果是：

目前針對hiv-1的haart等療法已顯著降低了艾滋病的發(fā)生率和死亡率。但是，由于只能抑制hiv-1復(fù)制，無法清除細(xì)胞內(nèi)感染的病毒，所以需要長期不間斷用藥，一旦停藥即出現(xiàn)病毒反跳現(xiàn)象；本發(fā)明解決了該技術(shù)難題，構(gòu)建的融合基因betatrcp-cypa能夠降解hiv-1gag，從而抑制hiv-1病毒的組裝，或降解hiv-1中的gag，從而達(dá)到抑制hiv-1的作用。

附圖說明

圖1pcdna3.1mychis(-)（簡稱pcdna3.1his）載體示意圖；

圖2含hiv-1gag基因的pspax2載體；

圖3betatrcp-cypa融合基因構(gòu)建betatrcp-n端和c端cypa的pcr擴(kuò)增圖；其中，m:dl2000marker，1、表示betatrcp-cypa融合基因c端cypa基因的擴(kuò)增，2表示betatrcp-n端基因的擴(kuò)增圖；

圖4betatrcp-cypa基因pcr擴(kuò)增，1:betatrcp-cypa基因的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物圖;m:dl2000dna分子量標(biāo)準(zhǔn)；

圖5pcdna3.1his/cypa基因構(gòu)建cypa的pcr擴(kuò)增，m:dl2000marker，1.cypa基因的擴(kuò)增；

圖6pcdna3.1his/betatrcp-cypa和pcdna3.1his/cypa的表達(dá)的westernblotting鑒定圖，nc:空載體組，1：pcdna3.1his/betatrcp-cypa，2：pcdna3.1his/cypa；

圖7westernblot分析betatrcp-cypa對hiv-1gag的降解分析，1.betatrcp-cypa組轉(zhuǎn)染pcdna3.1his/betatrcp-cypa質(zhì)粒2μg，pspax20.4μg，2.cypa對照組轉(zhuǎn)染pcdna3.1his/cypa2μg，pspax2質(zhì)粒0.4μg，3.對照組轉(zhuǎn)染pcdna3.1his2μg，pspax2質(zhì)粒0.4μg；

圖8elisa法研究betatrcp-cypa對hiv-1的抑制率圖；

圖9熒光素酶活性法研究betatrcp-cypa抑制hiv-1的作用圖，pcdna3.1his：對照組pcdna3.1/his組cypa:pcdna3.1his/cypa組，betatrcp-cypa組d：293t細(xì)胞對照組。

具體實(shí)施方式

所述具有抑制hiv-1作用的融合基因betatrcp-cypa的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

（1）betatrcp-cypa的抑制hiv-1的融合基因構(gòu)建：利用dnastar等對betatrcp基因n端序列進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后委托上海生工生物工程公司合成，優(yōu)化后用premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增betatrcpn端部分，以cypacdna質(zhì)粒為模版，擴(kuò)增cypa部分，純化后各取1μl作為模板，以外側(cè)引物pcr擴(kuò)增betatrcp-cypa融合基因，雙酶切后克隆入pcdna3.1his載體。送上海生工測序加以確認(rèn)。

（2）westernblot檢測betatrcp-cypa、cypa重組蛋白的表達(dá)培養(yǎng)293t細(xì)胞，用entranster^tm-d4000轉(zhuǎn)染試劑將pcdna3.1his/betatrcp–cypa或pcdna3.1his/cypa2μg(entranster^tm-d4000和質(zhì)粒比例為3∶1)分別轉(zhuǎn)入每孔，pcdna3.1his空載體轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞做對照。48h后收集細(xì)胞后用westernblot檢測。

（3）betatrcp-cypa對hiv-1gag的降解分析轉(zhuǎn)染前一天將293t細(xì)胞接種到六孔板中，以質(zhì)粒pspax2與pcdna3.1his/betatrcp-cypa和質(zhì)粒pcdna3.1his共轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分3組：實(shí)驗(yàn)組pspax20.4μg與pcdna3.1his/betatrcp-cypa2μg；cypa對照組pspax20.4μg與pcdna3.1/cypa2μg，對照組pspax20.4μg與pcdna3.1his2μg，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收細(xì)胞：吸去培養(yǎng)液，用1ml預(yù)冷的pbs洗1次，吸去pbs；在用碧云天的ip及western細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，裂解液中加入pmsf，使pmsf的最終濃度為1mm；取100μl細(xì)胞裂解液與收獲細(xì)胞混勻，4℃12000r/min離心30min后收集上清，bca蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量后用westernblot檢測，同時(shí)作β-actin的內(nèi)參對照。蛋白經(jīng)12％sds-page后，轉(zhuǎn)移至pvdf膜，封閉后，5%脫脂牛奶封閉h后，分別加入hiv-1p24單抗和β-actin單克隆抗體孵育，洗膜后加入偶聯(lián)hrp的羊抗鼠二抗，室溫孵育2h,洗膜后進(jìn)行ecl顯色

（4）elisa法研究betatrcp-cypa抑制hiv-1的研究

培養(yǎng)293t細(xì)胞，以每孔4×l0³個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分4組：（1）betatrcp-cypa組pcdna3.1his/betatrcp-cypa0.15μg,hiv-1骨架質(zhì)粒pnl43luc-r-e-0.05μg；（2）cypa組pcdna3.1his/cypa0.15μg,hiv-1骨架質(zhì)粒pnl43lucr-e-0.05μg；（3）對照組pcdna3.1/his0.15μg,hiv-1骨架質(zhì)粒pnl43luc-r-e-0.05μg，(4)293t細(xì)胞對照組。第二天將entranster^tm-d-4000和質(zhì)粒以3∶1比例分別轉(zhuǎn)入每孔，6h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。48h后，檢測上清中的p24濃度。留下細(xì)胞待裂解后進(jìn)行熒光素酶活性檢測。

(5)上述（4）中的細(xì)胞加入100μl報(bào)告基因細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞（用碧云天的螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒）。加入100微升螢光素酶檢測試劑，用槍打勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測定rlu(relativelightunit)。以報(bào)告基因細(xì)胞裂解液為空白對照，測定熒光值，熒光值越高h(yuǎn)iv-1復(fù)制水平越高，通過與未感染hiv-1細(xì)胞的熒光值相比，該比值可以反應(yīng)hiv-1復(fù)制水平。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)例

實(shí)驗(yàn)例1

pcdna3.1his/betatrcp-cypa構(gòu)建根據(jù)人betatrcp基因n端序列(genbank登陸號(hào):nm_003939)，利用dnastar等對betatrcp基因n端序列進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后委托上海生工生物工程公司合成，用premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，以b1和b2為引物擴(kuò)增betatrcpn端部分，加primestarhsdnapolymerase酶等至50μl體系。擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性15s，再98°c10s，58°c15s，再72°c60s，28個(gè)循環(huán)，以cypacdna質(zhì)粒為模版，以b3和b4為引物擴(kuò)增cypa部分，加primestarhsdnapolymerase酶等至50μl體系。擴(kuò)增條件為：98°c預(yù)變性15s，再98°c10s，58℃15s，再72℃,30s，28個(gè)循環(huán)，結(jié)果分別擴(kuò)增出目的條帶，大小分別約800bp、500bp，如圖3，各取1μl作為模板，以b1'和b4為引物pcr擴(kuò)增betatrcp-cypa融合基因，98°c預(yù)變性15s，再98°c10s，58℃15s，再72℃90s，30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增出目的條帶，大小約1300bp,如圖4分別用ecorii/bamhi雙酶切pcr產(chǎn)物和pcdna3.1his載體克隆入pcdna3.1his載體。送上海生工測序加以確認(rèn)。

pcdna3.1his/cypa構(gòu)建以puc/cypa為模版，以c1和b4為引物擴(kuò)增cypa基因，加primestarhsdnapolymerase酶等至50μl體系。擴(kuò)增條件為：98°c預(yù)變性15s，再98°c10s，58°c15s，再72°c30s，30個(gè)循環(huán)，結(jié)果如圖5所示，分別用ecori/bamhi雙酶切pcr產(chǎn)物和pcdna3.1his載體克隆入pcdna3.1his載體。送上海生工測序加以確認(rèn)。

實(shí)驗(yàn)例2

westernblot檢測betatrcp-cypa、cypa重組蛋白的表達(dá)

培養(yǎng)293t細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天將293t細(xì)胞以1×10⁶個(gè)/孔的密度鋪于6孔板培養(yǎng)。第2天，用entranster^tm-d4000轉(zhuǎn)染試劑將pcdna3.1his/betatrcp–cypa、pcdna3.1his/cypa各2μg(比例為3∶1)分別轉(zhuǎn)入每孔，pcdna3.1his空載體轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞做對照。轉(zhuǎn)染后第2天更換新鮮培養(yǎng)基，48h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。bca蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量后用westernblot檢測。蛋白經(jīng)12％sds-page后，轉(zhuǎn)移至pvdf膜，封閉后，分別加入his-tag單克隆抗體(pcdna3.1his/betatrcp-cypa和pcdna3.1hiscypa含his標(biāo)簽)孵育后，加入hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg孵育、洗膜后，用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。westernblot結(jié)果表明，betatrcp-cypa和cypa蛋白在相對分子質(zhì)量分別為約52kd、21kd處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，而對照組293t細(xì)胞蛋白則未見此條帶(見圖6)。

實(shí)驗(yàn)例3

betatrcp-cypa對hiv-1gag的降解分析轉(zhuǎn)染前一天將293t細(xì)胞接種到六孔板中，以質(zhì)粒pspax2與pcdna3.1his/betatrcp-cypa和質(zhì)粒pcdna3.1his共轉(zhuǎn)染。參考entranster^tm-d4000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分3組：（1）實(shí)驗(yàn)組pspax20.4μg與pcdna3.1his/betatrcp-cypa2μg；（２）cypa對照組pspax20.4μg與pcdna3.1/cypa2μg，（3）對照組pspax20.4μg與pcdna3.1his2μg，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收細(xì)胞：吸去培養(yǎng)液，用1ml預(yù)冷的pbs洗1次，吸去pbs；在用碧云天的ip及western細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，裂解液中加入pmsf，使pmsf的最終濃度為1mmol/l；取100μl細(xì)胞裂解液與收獲細(xì)胞混勻，4℃12000r/min離心30min后收集上清，bca蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量后用westernblot檢測，同時(shí)作β-actin的內(nèi)參對照。蛋白經(jīng)12％sds-page后，轉(zhuǎn)移至pvdf膜，封閉后，5%脫脂牛奶封閉h后，分別加入hiv-1p24單抗和β-actin單克隆抗體孵育，洗膜后加入偶聯(lián)hrp的羊抗鼠二抗，室溫孵育2h,洗膜后進(jìn)行ecl顯色。

western印跡分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染betatrcp-cypa的實(shí)驗(yàn)組，hiv-1gag蛋白量明顯減弱(見圖7)，說明betatrcp-cypa確實(shí)可以降低hiv-1gag的穩(wěn)定性。cypa似乎對hiv-1gag有一定的保護(hù)作用（條帶增大）。

實(shí)驗(yàn)例4

elisa法研究betatrcp-cypa抑制hiv-1的研究

培養(yǎng)293t細(xì)胞，以每孔4×l0³個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分4組：（1）betatrcp-cypa組pcdna3.1his/betatrcp-cypa0.15μg,hiv-1骨架質(zhì)粒pnl43luc-r-e-(pnl43lucr-e-(從美國國立衛(wèi)生院(nih)aidsresearchandreferencereagentprogram獲得)0.05μg；（2）cypa組pcdna3.1his/cypa0.15μg，hiv-1骨架質(zhì)粒pnl43lucr-e-0.05μg；（3）對照組pcdna3.1/his0.15μg,hiv-1骨架質(zhì)粒pnl43luc-r-e-0.05μg，（4）293t細(xì)胞組，每組3個(gè)復(fù)孔，第二天用entranster^tm-d4000轉(zhuǎn)染試劑將entranstertm-d-4000和質(zhì)粒以3∶1比例分別轉(zhuǎn)入每孔，6h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。48h后，檢測上清中的p24濃度。留下細(xì)胞待裂解后進(jìn)行熒光素酶活性檢測。具體步驟如下：

1)．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將包被板從密封袋中取出，根據(jù)所需數(shù)量在板架上放好微孔板條。設(shè)空白對照2孔，hiv-1不同濃度校準(zhǔn)品a、b、c、d、e各2復(fù)孔。

2)．加結(jié)合物1：每孔加入結(jié)合物125μl。

3)．加樣：依次分別加入樣品、校準(zhǔn)品75μl。

4)．溫育：用微量震蕩器充分振蕩混勻，用封板膜封蓋反應(yīng)板，37℃溫育60分鐘；

5)．洗板：取出微孔板，吸干微孔板中所有液體，每孔加入稀釋好的洗滌液400μl，浸泡至少10秒，吸干。如此洗板

次，最后在干凈的吸水紙上拍干。

6)．加酶：空白孔除外，每孔加入結(jié)合物2100μl。

7)．溫育：用新的封板膜封蓋反應(yīng)板，37℃溫育30分鐘。

8)．洗板：取出微孔板，如上述洗板方法洗滌5次，最后在干凈的吸水紙上拍干。

9)．加底物液：每孔先加入底物顯色液a50μl（或1滴），再加入底物顯色液b50μl（或1滴）。

10).溫育：用微量振蕩器充分振蕩混勻，用封板膜封蓋反應(yīng)板，37℃溫育15分鐘；

11).加終止液：每孔加入終止液50μl（或1滴），輕輕振蕩混勻。

12).讀數(shù)：設(shè)定酶標(biāo)儀波長于450nm處，用空白孔調(diào)零點(diǎn)后測定各孔a值。

以hiv-1標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值平均值為縱軸，hiv-1標(biāo)準(zhǔn)品的濃度平均值為橫軸，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將測得的樣品吸光值在上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得樣品hiv-1p24的濃度。

（pcdna3,1his組濃度-實(shí)驗(yàn)組p24濃度）/pcdna3,1his組p24濃度×100%算出抑制率。

結(jié)果betatrcp-cypa體現(xiàn)出較好的抑制效果，抑制效果達(dá)70%多。說明betatrcp-cypa具有良好的抗hiv-1活性。cypa組也有一定抑制率可能是由于cypa抑制了p24的分泌，使細(xì)胞內(nèi)的p24反而增加(見圖8)。

實(shí)驗(yàn)例5

熒光素酶活性betatrcp-cypa抑制hiv-1的研究

上述5中的細(xì)胞加入100μl報(bào)告基因細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞（用碧云天的螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒）。加入100μl螢光素酶檢測試劑，用槍打勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測定rlu(relativelightunit)。以報(bào)告基因細(xì)胞裂解液為空白對照，測定熒光值，熒光值越高h(yuǎn)iv-1復(fù)制水平越高，通過與未感染hiv-1細(xì)胞的熒光值相比，該比值可以反應(yīng)hiv復(fù)制水平。結(jié)果betatrcp-cypa體現(xiàn)出較好的抑制效果(見圖9)，說明betatrcp-cypa具有良好的抗hiv-1活性。

sequencelisting

<110>河南科技大學(xué)

<120>一種具有抑制hiv-1作用的融合基因betatrcp-cypa及其構(gòu)建方法

<130>1

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1293

<212>dna

<213>人

<400>1

atggacccagcagaagcagtgcttcaggagaaggctctcaagtttatgaactcctccgag60

agggaggactgcaacaacggcgagcctcctaggaagatcatcccagagaagaactccctg120

cgccagacctacaacagctgtgcccgcctttgccttaaccaggagaccgtctgtttggct180

tcaaccgctatgaagaccgagaactgcgtggccaagacaaagctcgccaacggaactagc240

tccatgatcgtgcctaagcagagaaagctcagcgcctcttacgagaaggagaaggaactg300

tgcgtcaagtacttcgagcagtggagcgagagcgaccaggtggagttcgtggagcacttg360

atctcccagatgtgccactaccagcacggacacatcaactcctacctcaagcctatgctc420

cagagggacttcatcactgccctgccagctagagggttggaccatatcgccgaaaacatc480

ctgagctacctggatgccaagagcctgtgcgctgcagaattggtgtgcaaagagtggtac540

agagtcacaagcgatggcatgctgtggaagaaactgattgagcggatggtcaggacagat600

tctctgtggaggggactggccgagagaagaggatgggggcaatatctgtttaagaacaag660

ccacctgatgggaatgctccacctaacagtttctacagagccctgtaccccaagattatt720

caggatattgagacaattgagtcaaactggagatgcggaagacacagtggctcaggatca780

ggctcaggatcaggctcaatggtcaaccccaccgtgttcttcgacattgccgtcgacggc840

gagcccttgggccgcgtctcctttgagctgtttgcagacaaggtcccaaagacagcagaa900

aattttcgtgctctgagcactggagagaaaggatttggttataagggttcctgctttcac960

agaattattccagggtttatgtgtcagggtggtgacttcacacgccataatggcactggt1020

ggcaagtccatctatggggagaaatttgaagatgagaacttcatcctaaagcatacgggt1080

cctggcatcttgtccatggcaaatgctggacccaacacaaatggttcccagtttttcatc1140

tgcactgccaagactgagtggttggatggcaagcatgtggtgtttggcaaagtgaaagaa1200

ggcatgaatattgtggaggccatggagcgctttgggtccaggaatggcaagaccagcaag1260

aagatcaccattgctgactgtggacaactcgaa1293

<210>2

<211>798

<212>dna

<213>人

<400>2

atggacccagcagaagcagtgcttcaggagaaggctctcaagtttatgaactcctccgag60

agggaggactgcaacaacggcgagcctcctaggaagatcatcccagagaagaactccctg120

cgccagacctacaacagctgtgcccgcctttgccttaaccaggagaccgtctgtttggct180

tcaaccgctatgaagaccgagaactgcgtggccaagacaaagctcgccaacggaactagc240

tccatgatcgtgcctaagcagagaaagctcagcgcctcttacgagaaggagaaggaactg300

tgcgtcaagtacttcgagcagtggagcgagagcgaccaggtggagttcgtggagcacttg360

atctcccagatgtgccactaccagcacggacacatcaactcctacctcaagcctatgctc420

cagagggacttcatcactgccctgccagctagagggttggaccatatcgccgaaaacatc480

ctgagctacctggatgccaagagcctgtgcgctgcagaattggtgtgcaaagagtggtac540

agagtcacaagcgatggcatgctgtggaagaaactgattgagcggatggtcaggacagat600

tctctgtggaggggactggccgagagaagaggatgggggcaatatctgtttaagaacaag660

ccacctgatgggaatgctccacctaacagtttctacagagccctgtaccccaagattatt720

caggatattgagacaattgagtcaaactggagatgcggaagacacagtggctcaggatca780

ggctcaggatcaggctca798

<210>3

<211>498

<212>dna

<213>人

<400>3

atggtcaaccccaccgtgttcttcgacattgccgtcgacggcgagcccttgggccgcgtc60

tcctttgagctgtttgcagacaaggtcccaaagacagcagaaaattttcgtgctctgagc120

actggagagaaaggatttggttataagggttcctgctttcacagaattattccagggttt180

atgtgtcagggtggtgacttcacacgccataatggcactggtggcaagtccatctatggg240

gagaaatttgaagatgagaacttcatcctaaagcatacgggtcctggcatcttgtccatg300

gcaaatgctggacccaacacaaatggttcccagtttttcatctgcactgccaagactgag360

tggttggatggcaagcatgtggtgtttggcaaagtgaaagaaggcatgaatattgtggag420

gccatggagcgctttgggtccaggaatggcaagaccagcaagaagatcaccattgctgac480

tgtggacaactcgaataa498

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggaattcgccaccatggacccagcagaagcagtg34

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tgagcctgatcctgagcctgat22

<210>6

<211>74

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctggagatgcggaagacacagtggctcaggatcaggctcaggatcaggctcaatggtcaa60

ccccaccgtgttct74

<210>7

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

atcaggctcaggatcaggctcaatggtcaaccccaccgtgttc43

<210>8

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cgggatccttcgagttgtccacagtcagca30

<210>9

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

ggaattcgccaccatggtcaaccccaccgtgttc34