本發(fā)明屬于化學(xué)制藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有ns3絲氨酸蛋白酶抑制活性的化合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃病毒屬(flaviviridea)是一類具有包膜的單正鏈rna病毒，包括丙型肝炎病毒(hcv)、登革熱病毒(denv)、黃熱病毒(yfv)、西尼羅病毒(wnv)、流行性乙型腦炎病毒(jev)和森林腦炎病毒(tbev)，可在世界范圍內(nèi)引起多種流行性感染疾病。在我國(guó)主要流行的黃病毒有乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒和登革熱病毒。

黃病毒屬病毒的基因組具有相似的結(jié)構(gòu)，均由一段非編碼區(qū)和開放閱讀框組成。開放閱讀框架編碼的多聚蛋白前體由不同的結(jié)構(gòu)蛋白和相似的非結(jié)構(gòu)蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5)組成，非結(jié)構(gòu)蛋白(ns3)在病毒多聚蛋白裂解和病毒基因組的復(fù)制中發(fā)揮著重要的作用。ns3蛋白由位于n末端區(qū)的ns3蛋白酶(serineprotease)，也稱絲氨酸蛋白酶區(qū)域(ns3p)，以及c末端的解旋酶區(qū)域(ns3h)組成。ns3p與ns3h在病毒基因組復(fù)制的不同階段起到了不同的作用，而且可以增強(qiáng)彼此的作用。ns3p絲氨酸蛋白酶由180-200個(gè)氨基酸構(gòu)成，是一種序列相對(duì)保守的多功能蛋白酶；當(dāng)ns3p與位于ns4a的21-34位區(qū)域結(jié)合時(shí)，可形成活性的ns3/ns4a絲氨酸蛋白酶復(fù)合物，裂解多聚蛋白間形成的連接。

研究表明，抑制ns3/ns4a絲氨酸蛋白酶的結(jié)合活性可以有效的抑制黃病毒屬病毒的復(fù)制與增殖，因此，ns3絲氨酸蛋白酶成為了抗丙型肝炎病毒藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。然而迄今為止，仍無令人滿意的能有效抑制ns3絲氨酸蛋白酶活性的化合物被合成出來。

目前已開發(fā)的ns3/ns4a絲氨酸蛋白酶抑制劑，可根據(jù)其與ns3/ns4a絲氨酸蛋白酶的結(jié)合模式分為共價(jià)結(jié)合與非共價(jià)結(jié)合兩類抑制劑。本發(fā)明提供一種新型的非共價(jià)結(jié)合的ns3/ns4a絲氨酸蛋白酶，并發(fā)現(xiàn)該類結(jié)構(gòu)具有良好的活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是在于提供一種具有ns3絲氨酸蛋白酶抑制活性的苯并二氫吡喃類化合物，以開發(fā)成為一種新型的ns3絲氨酸蛋白酶抑制劑，應(yīng)用于因丙型肝炎病毒、登革熱病毒或西尼羅河病毒等病毒感染引起的相關(guān)疾病治療的領(lǐng)域中。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

如通式(ⅰ)所示的一種具有ns3絲氨酸蛋白酶抑制活性的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、內(nèi)消旋體、外消旋體、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體或其混合物：

其中，各自獨(dú)立地選自單鍵或雙鍵；

d、e、f和g各自獨(dú)立地選自ch或n；

x選自氫原子或鹵素；

y選自雜原子；

n為0或1；

r1選自r4、-c(o)-r4、-c(s)-r4、-s(o)-r4或-s(o)2-r4；

r2選自氫原子、鹵素、硝基、氰基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；

r3選自芳基或雜芳基；

r4選自芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基。

如上所述的化合物，包括其通式如式(ⅱ)或(ⅲ)所示的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、內(nèi)消旋體、外消旋體、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體或其混合物：

其中，x為鹵素。

優(yōu)選的：

所述鹵素選自f、cl、br或i；

所述雜原子選自氧原子、氮原子或硫原子；

所述烷基、烯基、炔基各自獨(dú)立地選自含1-16個(gè)碳原子組成的直鏈、支鏈、單環(huán)狀、雙環(huán)狀或螺環(huán)狀的脂肪族烴基團(tuán)；

所述雜烷基選自包含氮、氧和硫中的一個(gè)原子或多個(gè)原子組合成的芳烷基或烷基；

所述芳基選自苯環(huán)、萘環(huán)及其取代衍生物，或者選自飽和環(huán)與芳環(huán)的衍生環(huán)狀取代基；

所述雜芳基選自包含氮、氧和硫中的一個(gè)原子或多個(gè)原子組合成的含5-12個(gè)原子的芳環(huán)，或者選自飽和環(huán)與雜芳環(huán)的衍生環(huán)狀取代基；

所述芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、雜烷基各自獨(dú)立地任選被一個(gè)或多個(gè)選自氫原子、鹵素、硝基、氰基、羥基、＝o、＝s、烷基、雜烷基、烯基、炔基、鹵代烯基、鹵代炔基、鹵代烷基、雜烷基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、環(huán)烷基雜烷基、雜環(huán)烷基雜烷基、芳基雜烷基、羥基烷基、烷氧基、烷氧烷基、烷氧芳基、烯氧基、炔氧基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、芳烷氧基、羧基、酰基、磺?；?、-c(o)or5、-oc(o)r5、-cor5、-nhs(o)r5、-nhs(o)2r5、-nhc(o)r5、-nhc(o)or5、-sh、-sr5、-nr6r7、-oc(o)nr6r7所取代；

r5、r6、r7各自獨(dú)立地選自氫原子、芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基或雜烷基，其中所述芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基或雜烷基任選被一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、羥基、羥烷基、烷氧基、酰基所取代；

r6、r7為獨(dú)立取代，或者連接成環(huán)。

更優(yōu)選的，r1選自-c(o)me、

更優(yōu)選的，其特征在于，r2選自h、f、cl或br。

更優(yōu)選的，r3選自

更優(yōu)選的，x為cl，y為o。

更優(yōu)選的，上述化合物為以下任意一個(gè)化合物：或其藥學(xué)上可接受的鹽、內(nèi)消旋體、外消旋體、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體或其混合物。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包括所述的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、內(nèi)消旋體、外消旋體、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體或其混合物。

本發(fā)明還提供了上述化合物和/或上述藥物組合物在制備用于預(yù)防、處理、治療由黃病毒屬病毒引起的病毒感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述黃病毒屬病毒選自丙型肝炎病毒、登革熱病毒、西尼羅病毒中至少一種。

本發(fā)明還涉及了如通式(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示化合物的制備、分離和純化的方法。

前面所述內(nèi)容只概述了本發(fā)明的某些方面，但并不限于這些方面。這些方面及其他方面將在下面做更加具體完整的描述。

本發(fā)明將會(huì)把確定的具體化的內(nèi)容所對(duì)應(yīng)的文獻(xiàn)詳細(xì)列出，實(shí)施例都伴隨有結(jié)構(gòu)式和化學(xué)式的圖解。本發(fā)明有預(yù)期地涵蓋所有的選擇余地、變體和同等物，這些可能像權(quán)利要求所定義的那樣包含在現(xiàn)有發(fā)明領(lǐng)域。所述領(lǐng)域的技術(shù)人員將識(shí)別許多類似或等同于在此所描述的方法和物質(zhì)，這些可以應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)踐中去。本發(fā)明絕非限于方法和物質(zhì)的描述。有很多文獻(xiàn)和相似的物質(zhì)與本發(fā)明申請(qǐng)相區(qū)別或抵觸，其中包括但絕不限于術(shù)語的定義，術(shù)語的用法，描述的技術(shù)，或像本發(fā)明申請(qǐng)所控制的范圍。

像本發(fā)明所描述的，本發(fā)明的化合物可以任選地被一個(gè)或多個(gè)取代基所取代，如上面的通式化合物，或者像實(shí)施例里面特殊的例子，子類，和本發(fā)明所包含的一類化合物。應(yīng)了解“任選取代的”這個(gè)術(shù)語與“取代或非取代的”這個(gè)術(shù)語可以交換使用。一般而言，術(shù)語“任選地”不論是否位于術(shù)語“取代的”之前，表示所給結(jié)構(gòu)中的一個(gè)或多個(gè)氫原子被具體取代基所取代。除非其他方面表明，一個(gè)任選的取代基可以有一個(gè)取代基在基團(tuán)各個(gè)可取代的位置進(jìn)行取代。當(dāng)所給出的結(jié)構(gòu)式不只一個(gè)位置能被為具體基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各個(gè)位置取代。其中所述的取代基可以是，但并不限于，鹵代烷基、羥基、氨基、鹵素、氰基、芳基、雜芳基、烷氧基、烷氨基、烷硫基、烷基、烯基、炔基、雜環(huán)基、巰基、硝基、芳氧基、雜芳氧基、氧代(＝o)、硫代(＝s)、羧基、羥基取代的烷氧基、羥基取代的烷基、羰基等等。

本發(fā)明使用的術(shù)語“脂肪族基團(tuán)”，表示直鏈、支鏈、單環(huán)狀、雙環(huán)狀或螺環(huán)狀，取代或非取代的完全飽和或含有一個(gè)或多個(gè)不飽和度的烴鏈或烴環(huán)。除非另外詳細(xì)說明，脂肪族基團(tuán)含有1-16個(gè)碳原子，其中一些實(shí)施例是，脂肪族基團(tuán)含有1-10個(gè)碳原子，另外一些實(shí)施例是，脂肪族基團(tuán)含有1-8個(gè)碳原子，另外一些實(shí)施例是，脂肪族基團(tuán)含有1-6個(gè)碳原子，另外一些實(shí)施例是，脂肪族基團(tuán)含有1-4個(gè)碳原子，另外一些實(shí)施例是，脂肪族基團(tuán)含有1-3個(gè)碳原子。合適的脂肪族基團(tuán)包括，但不限于，直鏈、支鏈、單環(huán)狀、雙環(huán)狀或螺環(huán)狀，取代或非取代的烷基、烯基或炔基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、已基、異丁基、仲丁基、乙烯基等。

本發(fā)明使用的術(shù)語“烷基”包括1-20個(gè)碳原子，或1-10個(gè)碳原子，或1-6個(gè)碳原子，或1-4個(gè)碳原子，或1-3個(gè)碳原子的單價(jià)烴基，其中烷基可以獨(dú)立任選地被一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所描述的取代基所取代。烷基更進(jìn)一步的實(shí)例包括，但并不限于，甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、正庚基、正辛基等等。術(shù)語“烷基”在此處使用，表示從直鏈、支鏈或環(huán)狀的飽和碳鏈。

本發(fā)明使用的術(shù)語“環(huán)烯基”，或“烯基”表示2-12個(gè)碳原子，或2-8個(gè)碳原子，或2-6個(gè)碳原子，或2-4個(gè)碳原子直鏈或支鏈的一價(jià)烴基，其中至少一個(gè)位置為不飽和狀態(tài)，即一個(gè)c-c為sp²雙鍵，其中“烯基”可以獨(dú)立任選的被一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所描述的取代基所取代，包括基團(tuán)有“反”“正”或“e”“z”的定位，其中具體的實(shí)施例包括，但并不限于，乙烯基(-ch＝ch2)、丙烯基(-ch＝ch2ch3)、烯丙基(-ch2ch＝ch2)等等。

本發(fā)明使用的術(shù)語“炔基”表示2-12個(gè)碳原子，或2-8個(gè)碳原子，或2-6個(gè)碳原子，或2-4個(gè)碳原子直鏈或支鏈的一價(jià)烴基，其中至少一個(gè)位置為不飽和狀態(tài)，即一個(gè)c-c為sp雙鍵，其中炔基基團(tuán)可以獨(dú)立任選的被一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所描述的取代基所取代，具體的實(shí)施例包括，但并不限于，乙炔基(-ch≡ch2)、炔丙基(-ch2ch≡ch2)等等。

本發(fā)明使用的術(shù)語“鹵代烷基”，或“鹵代烯基”，或“鹵代炔基”表示脂肪族基團(tuán)，或烯基，或炔基被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的鹵原子所取代，其中烷基、烯基和炔基均具有本發(fā)明所述的含義，鹵原子即f、cl、br或i，這樣的實(shí)例包括，但并不限于三氟乙基、三氟甲氧基、2-氯-乙烯基、2-溴炔丙基等等。

本發(fā)明使用的術(shù)語“烷氧基”，涉及到烷基，像本發(fā)明所定義的，通過氧原子(“烷氧基”)連接到主要的碳鏈上，這樣的實(shí)例包括，但并不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。并且所述烷氧基可以是取代或非取代的，其中取代基可以是，但并不限于，羥基、氨基、鹵素、氰基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、巰基、硝基等等。

本發(fā)明使用的術(shù)語“芳基”可以單獨(dú)使用或作為“芳烷基”“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”的一大部分，表示共含有6-14元環(huán)的單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)的碳環(huán)體系，其中，至少一個(gè)環(huán)體系是芳香族的，其中每一個(gè)環(huán)體系包含3-7元環(huán)，且至少一個(gè)附著點(diǎn)與分子的其余部分相連。術(shù)語“芳基”可以和術(shù)語“芳香環(huán)”交換使用，如芳香環(huán)可以包括苯基、萘基和蒽。并且所述芳基可以是取代或非取代的，其中取代基可以是，但并不限于，鹵代烷基、羥基、氨基、鹵素、氰基、芳基、雜芳基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、雜環(huán)基、巰基、硝基、芳氧基、羥基取代的烷氧基、羧基烷氧基等等。

本發(fā)明使用的術(shù)語“雜芳基”可以單獨(dú)使用或作為“雜芳基烷基”或“雜芳基烷氧基”的一大部分，表示共含有5-14元環(huán)的單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)體系，其中，至少一個(gè)環(huán)體系是芳香族的，且至少一個(gè)環(huán)體系包含一個(gè)或多個(gè)雜原子，其中每一個(gè)環(huán)體系包含3-7元環(huán)，且至少一個(gè)附著點(diǎn)與分子的其余部分相連。術(shù)語“雜芳基”可以和術(shù)語“芳雜環(huán)”或“雜芳族化合物”交換使用。并且所述雜芳基可以是取代或非取代的，其中取代基可以是，但并不限于，鹵代烷基、羥基、氨基、鹵素、氰基、芳基、雜芳基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、雜環(huán)基、巰基、硝基、芳氧基、羥基取代的烷氧基、羧基烷氧基等等。

本發(fā)明使用的術(shù)語“芳氧基”或“芳烷氧基”，包括任選取代的芳基，如本發(fā)明所定義的，連接到氧原子上，并且由氧原子與分子其余部分相連，其中芳基基團(tuán)具有如本發(fā)明所述的含義，這樣的實(shí)例包括，但并不限于苯氧基、甲苯氧基、乙苯氧基等等。

本發(fā)明使用的術(shù)語“羧基”，無論是單獨(dú)使用還是和其他術(shù)語連用，如“羧烷基”，表示-co2h；術(shù)語“羰基”或“?；保瑹o論是單獨(dú)使用還是和其他術(shù)語連用，如“氨基羰基”、“酰胺基”或“酰氧基”，表示-(c＝o)-。

本發(fā)明使用的術(shù)語“磺?；?，無論是單獨(dú)使用還是和其他的術(shù)語如“烷基磺?；边B用，分別表示二價(jià)的基團(tuán)-so2-；術(shù)語“烷基磺?；笔侵竿榛〈幕酋；鶊F(tuán)，形成烷基磺酰基(-so2ch3)；術(shù)語“胺磺?！?、“胺基磺酰基”表示氨基取代的磺?；鶊F(tuán)，形成胺磺?；?-so2nh2)。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的化合物是一類新型的具有ns3絲氨酸蛋白酶抑制活性的化合物，制備過程操作簡(jiǎn)單安全；經(jīng)過抗病毒活性實(shí)驗(yàn)測(cè)定，表明該類化合物具有良好的ns3絲氨酸蛋白酶抑制活性，具有開發(fā)成為一種新型的ns3絲氨酸蛋白酶抑制劑的潛力，可應(yīng)用于預(yù)防、處理和治療因丙型肝炎病毒、登革熱病毒或西尼羅河病毒等黃病毒屬病毒感染引起的相關(guān)疾病。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例只是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行修改或者對(duì)部分技術(shù)特征進(jìn)行同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明保護(hù)的范圍中。

在下列實(shí)施例中，除非另有指明外，所有溫度單位為攝氏度。使用的各種起始原料和試劑均來自市售，除非另有指明，市售原料和試劑均不經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用；玻璃器皿用烘箱干燥和/或加熱干燥。

薄層層析用硅膠板規(guī)格為0.15-0.2mm，柱層析用硅膠的規(guī)格為200-300目；質(zhì)譜是用ms儀測(cè)定得到，離子化方式可為esi或apci。

一般地，本發(fā)明的化合物可以通過本發(fā)明所描述的方法制備得到，也通過本領(lǐng)域技術(shù)人員的常用技術(shù)手段制備得到，除非有進(jìn)一步的說明，其中取代基的定義如式(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示。下面的反應(yīng)方案和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。

所屬技術(shù)領(lǐng)域人員將認(rèn)識(shí)到：本發(fā)明所描述的化學(xué)反應(yīng)可以用來合適地制備許多本發(fā)明的其他化合物，且用于制備本發(fā)明的化合物的其他方法都被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，根據(jù)本發(fā)明那些非例證的化合物的合成可以成功地被所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通過修飾方法完成，如適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)干擾基團(tuán)，通過利用其他已知的試劑除了本發(fā)明所描述的，或?qū)⒎磻?yīng)條件做一些常規(guī)的修改。另外，本發(fā)明所公開的反應(yīng)或已知的反應(yīng)條件也公認(rèn)地適用于本發(fā)明其他化合物的制備。

實(shí)施例1

合成路線：

第一步：中間體1c的合成

往250ml的圓底燒瓶中加入化合物1a(3g，0.022mol)、化合物1b(2.36g，0.022mol)、30％(mg/vol)氫氧化鈉乙醇溶液50ml，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h；反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液倒入冰水中，用鹽酸將反應(yīng)液的ph調(diào)節(jié)至2-3，過濾，收集固體；將固體溶于二氯甲烷中，依次用飽和碳酸鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌，然后加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，過濾，濾液減壓濃縮，再用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到3.5g化合物1c。

第二步：中間體1d的合成

往100ml的圓底燒瓶中加入化合物1c(3g，0.013mol)、醋酸30ml，120℃攪拌反應(yīng)24h后，減壓濃縮，得到固體；將固體溶于二氯甲烷中，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌，然后加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，過濾，濾液減壓濃縮；進(jìn)行硅膠柱層析，洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯(1:1)，得到2.1g化合物1d。

第三步：產(chǎn)物ni-h-0461的合成

往100ml的圓底燒瓶中加入化合物1d(200mg，0.89mol)、化合物1e(162mg，0.98mol)和乙醇8ml，于75℃反應(yīng)過夜；反應(yīng)完畢后，待反應(yīng)液溫度降到室溫，過程中有固體析出，過濾，收集固體并用冰乙醇重結(jié)晶，得198mg化合物ni-h-0461。

實(shí)施例2

按照實(shí)施例1所述方法合成的化合物，如表1所示。

表1合成的化合物

實(shí)施例3

合成路線：

第一步：中間體2a的合成

往100ml的圓底燒瓶中加入化合物1d(1g，0.0044mol)，無水dmf10ml，混勻，然后往里面緩慢滴加三氯氧磷(1.68g，0.011mol)，在室溫下攪拌反應(yīng)過夜；反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液倒入冰水中，過濾，收集固體；將固體溶于二氯甲烷中，依次用飽和碳酸鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌，然后加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，過濾，濾液減壓濃縮，再用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到841mg化合物2a。

第二步：產(chǎn)物ni-h-00576的合成

于微波反應(yīng)瓶中加入化合物2a(200mg，0.738mol)、2b(158mg，0.738mol)和3ml乙醇，在90℃下微波反應(yīng)30min；反應(yīng)完畢后，過濾，收集固體，再用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到231mg化合物ni-h-00576。

實(shí)施例4

按照實(shí)施例3所述方法合成的化合物，如表2所示。

表2合成的化合物

實(shí)施例5ns3絲氨酸蛋白酶抑制活性實(shí)驗(yàn)

1、配制反應(yīng)緩沖液，反應(yīng)緩沖液成分為：hepes50mm,nacl150mm,甘油15％，tritonx-1000.15％，dtt10mm，peg80000.1％,ph7.5。

2、用dmso將受試化合物稀釋成10μm及100μm。

3、然后在96孔板中加入ns3絲氨酸蛋白酶、緩沖液和上述配置好的受試化合物，使反應(yīng)終體積為100ul。混勻，室溫預(yù)孵30min；設(shè)2組反應(yīng)體系，每組設(shè)三次重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照。

4、在上述反應(yīng)體系中分別加入hcvns3/ns4特異性熒光多肽底物或wnv(西尼羅河病毒)ns3/ns4特異性熒光多肽底物，使其終濃度為100nm，混勻后在室溫下孵育1h，再加入100μl,500mm的嗎啉乙磺酸終止反應(yīng)。

5、采用酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為340nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)為615nm，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表3部分受試化合物對(duì)hcvns3絲氨酸蛋白酶的抑制活性

注：受試化合物對(duì)hcvns3絲氨酸蛋白酶的抑制活性用抑制率表示

如表3結(jié)果顯示，當(dāng)受試化合物的濃度設(shè)為10μm時(shí)，表格中所示化合物對(duì)hcvns3絲氨酸蛋白酶的抑制率為5％～65％；當(dāng)受試化合物的濃度設(shè)為100μm時(shí)表格所示化合物對(duì)hcv的ns3絲氨酸蛋白酶的抑制率均有所增強(qiáng)，抑制率達(dá)31％～100％。其中，編號(hào)為ni-h-00509、ni-h-00514和ni-h-0528的抑制活性最好。

表4部分受試化合物對(duì)wnvns3絲氨酸蛋白酶的抑制活性

注：受試化合物對(duì)wnvns3絲氨酸蛋白酶的抑制活性用抑制率表示

如表4結(jié)果顯示，當(dāng)受試化合物的濃度設(shè)為10μm時(shí)，表格中所示化合物對(duì)wnvns3絲氨酸蛋白酶的抑制率均低于20％；當(dāng)受試化合物的濃度設(shè)為100μm時(shí)，表格中所示化合物對(duì)wnvns3絲氨酸蛋白酶具有較強(qiáng)的抑制活性，抑制率為49％～55％。其中，編號(hào)為ni-h-00504的化合物抑制活性最好。

表1以及表2中其他化合物在濃度為100μm時(shí)，對(duì)hcv以及wnvns3蛋白酶的抑制率均低于20％。

實(shí)施例6抗病毒活性實(shí)驗(yàn)

1、抗丙型肝炎病毒(hcv)活性實(shí)驗(yàn)

(1)將含有hcvgenotype2(jfh1)的亞基因組rna復(fù)制子的細(xì)胞株huh7.5.1接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為2×10⁴個(gè)，置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入dmso溶解的受試化合物，置于co2培養(yǎng)箱中孵育48h后，測(cè)定化合物的ec50值。表4為部分化合物的ec50值。

(2)將含有hcvgenotype1的亞基因組rna復(fù)制子的bm4-5細(xì)胞系細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為2×10⁴個(gè)，置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入采用dmso梯度稀釋后的受試化合物，置于co2培養(yǎng)箱中孵育48h后，測(cè)定化合物的ec50值。表4為部分化合物的ec50值。

2、抗登革熱病毒(denv)活性實(shí)驗(yàn)

將bhk-21細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為5×10⁴個(gè)，置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入含有海腎熒光素酶(rluc)報(bào)告基因的denv基因轉(zhuǎn)染bhk-21細(xì)胞，加入dmso溶解的受試化合物，置于co2培養(yǎng)箱中孵育48h后，測(cè)定化合物的ec50。表4為部分化合物的ec50。

3、抗西尼羅河病毒(wnv)活性實(shí)驗(yàn)

將vero細(xì)胞系細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為8×10⁴個(gè)，置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，加入含有海腎熒光素酶(rluc)報(bào)告基因的復(fù)制子全長(zhǎng)wnv基因轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞，加入dmso溶解的受試化合物，置于co2培養(yǎng)箱中孵育24h后，測(cè)定化合物的ec50。表4為部分化合物的ec50。

4、受試化合物對(duì)病毒孵育細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞株huh7.5.1、bm4-5細(xì)胞系細(xì)胞、bhk-21細(xì)胞和vero細(xì)胞系細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量依次設(shè)為2×10⁴個(gè)、2×10⁴個(gè)、5×10⁴個(gè)和8×10⁴個(gè)，置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，將96孔板內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)基吸去，加入用培養(yǎng)基梯度稀釋后的受試化合物，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行mtt細(xì)胞活性測(cè)試，測(cè)定化合物的cc50值。cc50為50％的細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)的藥物濃度，部分化合物的cc50值見表4。

表5通式ⅱ部分化合物針對(duì)bm4-5的ec50及cc50值

如表5結(jié)果顯示，受試化合物對(duì)hcvgenotype1基因型具有一定的抑制作用(ec50<10μm),但其對(duì)bm4-5的細(xì)胞毒性較大。

表6通式ⅲ部分化合物在不同細(xì)胞系中的活性數(shù)據(jù)

注：n/d為尚未檢測(cè)；

如表6結(jié)果顯示，受試化合物抑制丙肝病毒的ec50<50μm，而對(duì)西尼羅河病毒以及登革熱病毒具有較好的抑制活性，可以在極低濃度(納摩爾級(jí)別)抑制病毒的復(fù)制且對(duì)病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒活性較小(cc50>600μm)，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。