本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大豆油體蛋白基因GmOLEO1及其編碼蛋白與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物體內(nèi)的油脂在植物細(xì)胞分裂，生長(zhǎng)及發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。植物油脂不僅是人類的重要食物之一，也是一種可再生的環(huán)保生物質(zhì)能源，是人類生產(chǎn)生活的重要能量來源。

植物種子中油脂的合成可以分為三個(gè)階段：第一階段是在質(zhì)體中以蔗糖作為主要碳源合成脂肪酸，第二階段是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成三酰甘油，第三階段是生成的三酰甘油與油體蛋白結(jié)合形成油體。油體是植物種子中儲(chǔ)存三酰甘油的亞細(xì)胞器，其內(nèi)部?jī)?chǔ)藏有液態(tài)的三酰甘油，外部由磷脂單分子層和嵌入其內(nèi)的油體蛋白(oleosin)組成的半單位膜所包裹。在油料作物種子如大豆、花生和油菜中都含有大量的油體及油體蛋白。油體蛋白是高度疏水的堿性小分子量蛋白，對(duì)維持油體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定極為重要。在植物種子中油體的大小及含油量與油體蛋白的含量是直接相關(guān)的。利用RNAi抑制大豆油體蛋白異構(gòu)體A的表達(dá)后，產(chǎn)生了新的直徑約為50nm的小油體，它們逐漸合并產(chǎn)生比野生型大豆體積更大的油體(Schmidt and Herman,2008)。在油菜和擬南芥中，高含油量種子相比于低含油量種子來說，其油體蛋白的水平高約20％(Parthibane et al.,2012)。分析擬南芥油體蛋白基因的缺失突變體發(fā)現(xiàn)，種子中的油脂含量有所降低(Siloto et al.,2006)。

大豆是最重要的糧油兼用作物，大豆油占全球植物油產(chǎn)量的28％，居世界植物油產(chǎn)量第一位。因此，提高大豆種子的油脂含量對(duì)人類健康以及解決我國(guó)經(jīng)濟(jì)能源問題有重要意義。隨著目前技術(shù)的進(jìn)步，國(guó)內(nèi)外已開發(fā)DGAT2A、SLC1、AtDGAT1等基因用以增加大豆油脂含量及提高油質(zhì)。然而關(guān)于油體蛋白基因?qū)Υ蠖褂椭康男?yīng)這方面的研究尚為空白。

綜合以上分析認(rèn)為，研究油體蛋白基因?qū)Υ蠖褂椭康挠绊懀l(fā)掘大豆油體蛋白基因?qū)ε嘤哂椭看蠖蛊贩N具有重要意義，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、發(fā)明要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明的目的是提供一種大豆油體蛋白基因GmOLEO1。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該基因所編碼的蛋白。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述基因的載體。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供上述基因或載體在培育高油脂大豆品種中的應(yīng)用。

2、技術(shù)方案

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種大豆油體蛋白基因GmOLEO1，其核苷酸序列如序列表Seq ID NO.1所示，編碼了由147個(gè)氨基酸組成的蛋白。

本發(fā)明還提供了一種大豆油體蛋白基因GmOLEO1所編碼的蛋白，其氨基酸序列如序列表Seq ID NO.2所示，該蛋白的分子量為15.76kDa，等電點(diǎn)為7.81。

應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。因而，本發(fā)明的油體蛋白基因GmOLEO1還包括由Seq ID NO.1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到編碼上述蛋白的核苷酸序列。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列(Seq ID NO.2)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發(fā)明編碼蛋白還包括Seq ID NO.2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有同等活性由Seq ID NO.2所示蛋白質(zhì)衍生得到的蛋白質(zhì)。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種含有該大豆油體蛋白基因GmOLEO1的載體，是將大豆油體蛋白基因GmOLEO1插入pCAMBIA3300植物過量表達(dá)載體中而成的重組表達(dá)載體pCAMBIA3300-GmOLEO1。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述大豆油體蛋白基因GmOLEO1或所述載體在培育高油脂大豆品種中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種用油體蛋白基因GmOLEO1進(jìn)行大豆轉(zhuǎn)化的方法，該方法是利用重組表達(dá)載體pCAMBIA3300-GmOLEO1，將權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)，再將轉(zhuǎn)化后的大豆細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因植株。

3、有益效果

⑴本發(fā)明首次從大豆基因組中克隆得到一種大豆油體蛋白基因GmOLEO1。利用植物表達(dá)載體，將本發(fā)明的GmOLEO1基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得油脂含量增加的轉(zhuǎn)基因植株。過量表達(dá)本發(fā)明GmOLEO1基因的大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆相比，其種子油脂含量顯著提高，說明GmOLEO1基因在提高植物種子特別是大豆種子油脂含量方面起著重要作用。

⑵利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明GmOLEO1基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得種子油脂含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因植株。

⑶使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型的啟動(dòng)子或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如可加入植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，也可不加入任何選擇性標(biāo)記基因，直接以表型篩選轉(zhuǎn)化植株。

⑷攜帶有本發(fā)明GmOLEO1的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培養(yǎng)成植株。被轉(zhuǎn)化的宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。

⑸本發(fā)明成果可運(yùn)用于通過生物技術(shù)調(diào)節(jié)大豆油體蛋白基因的表達(dá)，從而培育在種子油脂含量方面有顯著提高的大豆新品種，對(duì)培育高油脂含量大豆品種具有重要意義，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為大豆轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pCAMBIA3300-GmOLEO1載體圖譜。

注：載體用bar基因作為轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記，pCAMBIA3300-GmOLEO1載體用35S啟動(dòng)子后接全長(zhǎng)GmOLEO1cDNA，用于轉(zhuǎn)基因后可獲得超表達(dá)GmOLEO1的轉(zhuǎn)基因植株。

圖2為陽性轉(zhuǎn)基因大豆植株的驗(yàn)證結(jié)果圖。

注：A圖為轉(zhuǎn)基因大豆的草丁膦葉片涂抹法檢測(cè)結(jié)果，黑色標(biāo)記的半片葉子表示未涂除草劑；主脈另一邊的葉片涂有200mg/L Basta除草劑；B圖為轉(zhuǎn)基因大豆的PCR驗(yàn)證電泳圖，M為2000bp Marker，C為空白對(duì)照，+為質(zhì)粒陽性對(duì)照，1-10代表獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系1-10號(hào)樣品；C圖為試紙條檢測(cè)bar基因的表達(dá)結(jié)果圖。WT為非轉(zhuǎn)基因大豆，1-10為10個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系。

圖3為T1代轉(zhuǎn)基因大豆的Southern blot結(jié)果分析圖。

注：M，Marker；+，目的基因GmOLEO1的DNA片段；-，非轉(zhuǎn)基因大豆，1-4為GmOLEO1基因超表達(dá)的4個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系。

圖4為轉(zhuǎn)GmOLEO1基因大豆株系的種子中油脂含量測(cè)定結(jié)果分析圖。

注：WT為非轉(zhuǎn)基因大豆，OE1-4為4個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。

下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1：大豆油體蛋白基因GmOLEO1的克隆和植物表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)設(shè)計(jì)引物，提取RNA，反轉(zhuǎn)cDNA：

用植物總RNA提取試劑盒(DP432，天根)提取大豆威廉姆斯82葉片總RNA，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性；cDNA的合成參照TaKaRa Primer Script ^TMRT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒說明操作。設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因GmOLEO1的引物序列如下:

Seq ID NO.3：GmOLEO1-F 5’-CCTACCACATTAATTACTCACTCTTCACTCA-3’；

Seq ID NO.4：GmOLEO1-R 5’-TCAACTTTAACGCTCATTCCTGCATTCAT-3’。

(2)PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：

步驟一：按照以下組份順序配制PCR反應(yīng)液(50μl體系)：10×PCR Buffer(25μl)，ddH₂O(9μl)，dNTP(10μl)，GmOLEO1-F(1.5μl)，GmOLEO1-R(1.5μl)，cDNA(2μl)，KOD FX酶(1μl)；

步驟二：反應(yīng)在BIO-RAD PTC-200型PCR儀上進(jìn)行，設(shè)定反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性2min；再98℃10sec，55℃30sec，68℃30sec，共33個(gè)循環(huán)；然后68℃延伸7min；4℃保存；

步驟三：PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)連接PMD19-T載體(TaKaRa)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、藍(lán)白斑篩選、搖菌、測(cè)序，序列如Seq ID NO.1所示。

(3)植物表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)同源重組接頭引物，以上述(2)中獲得的含GmOLEO1基因的T載體為模板，擴(kuò)增出帶重組接頭的GmOLEO1全長(zhǎng)片段，通過無縫克隆技術(shù)將GmOLEO1基因正向?qū)氲酱蠖贡磉_(dá)載體pCAMBIA3300中，構(gòu)建成重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-GmOLEO1(如圖1所示)。pCAMBIA3300載體在T-DNA區(qū)域帶有一個(gè)選擇標(biāo)記基因bar，該基因編碼草丁膦乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶(PAT)，可催化草丁膦的自由氨基乙?；瑥亩钩輨┎荻§⑹Щ?；無縫克隆所用的引物序列如下：

Seq ID NO.5：

上游引物5’-TTTGGAGAGAACACGTATGGCTGAGCTTCACTACCAAC-3’；

Seq ID NO.6：

下游引物5’-TCGGGGAAATTCGGGGTTAAGAAGCCTGCACCCCACTG-3’。

實(shí)施例2：GmOLEO1基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因大豆的培育

(1)種子的消毒與萌發(fā)

大豆種子的表面消毒采用氯氣干法滅菌。挑選成熟飽滿、無病斑、無硬實(shí)的干凈種子，單層排列在90*15mm的培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿開蓋放入干燥器中，干燥器內(nèi)放置一個(gè)500ml的玻璃燒杯，用100ml量筒量取75ml的商用漂白水加入燒杯中，用10ml量筒量取3ml的12M HCl，沿著杯壁緩緩加入；蓋上干燥器的蓋子，保證器皿密封，靜置過夜，10～16小時(shí)，滅菌完成后，將培養(yǎng)皿加蓋轉(zhuǎn)移到無菌超凈臺(tái)上，打開培養(yǎng)皿的蓋子，強(qiáng)風(fēng)吹25～40分鐘除去殘留氯氣；將消毒后的種子種臍朝下播種在萌發(fā)培養(yǎng)基(GM)上，將培養(yǎng)皿疊放，用保鮮膜包好，放在生物培養(yǎng)箱中24℃，黑暗培養(yǎng)16～24小時(shí)。

(2)農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備

抽取重組載體pCAMBIA3300-GmOLEO1質(zhì)粒DNA，通過電轉(zhuǎn)化的方法，將重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，貯制于50％甘油中；轉(zhuǎn)基因前2天，吸取50μl含載體的農(nóng)桿菌甘油菌至5ml添加了抗生素(1/1000)的YEP液體培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸膏，5g/L氯化鈉，pH 7.0)中，28℃，250rpm，振蕩培養(yǎng)24～36小時(shí)；吸取0.2～1ml飽和菌液至添加了抗生素(1/2000)的250ml YEP液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD650nm＝0.8～1.0；將菌液分裝到若干個(gè)50ml無菌離心管中，離心(4000rpm，10min，25℃)，收集菌落，用25～50ml液體共培養(yǎng)基(LCCM)輕輕吹打，重懸沉淀后備用；LCCM培養(yǎng)液含1/10的B5大量、微量和維生素(Gamborg et al.,1968)、3％蔗糖、有機(jī)緩沖劑2(N-嗎啉)乙醇磺酸(MES)3.9g/L，pH5.4，120℃滅菌20min，在無菌環(huán)境下加入赤霉素(GA3)0.25mg/L、6-芐基腺嘌呤(BAP)1.67mg/L、半胱氨酸(Cys)400mg/L、二硫蘇糖醇(DTT)154.2mg/L、乙酰丁香酮(As)200μmol/L。

(3)外植體的準(zhǔn)備與共培養(yǎng)

將吸脹的大豆種子置于無菌吸水紙上，沿著種臍用手術(shù)刀縱向切割種子，將子葉和下胚軸均勻分開兩瓣，去除種皮后備用；將農(nóng)桿菌重懸液倒入潔凈的無菌培養(yǎng)皿中，放入大約50個(gè)外植體，室溫侵染20～30分鐘，期間經(jīng)常攪動(dòng)菌液，使外植體充分接觸新鮮菌液；侵染結(jié)束后，將外植體取出，用無菌吸水紙吸干后置于放有無菌濾紙的共培養(yǎng)基(CM)上，每皿7～10個(gè)外植體，近軸面朝上，水平放置；CM培養(yǎng)基配方與LCCM相同，另加5g/L的瓊脂(Difco Agar，Noble公司)。將培養(yǎng)皿疊放，用保鮮膜封好后在Percival培養(yǎng)箱中，23℃，黑暗共培養(yǎng)3～5天。

(4)篩選與再生

共培養(yǎng)3～5天后，切去伸長(zhǎng)的下胚軸留取約0.5cm，30～45°斜角插在加有篩選劑的芽誘導(dǎo)(SI)培養(yǎng)基上，SI培養(yǎng)基含B5大量、微量和維生素、蔗糖30g/L、MES 0.59g/L、和瓊脂8g/L(Sigma,USA)，120℃滅菌20min后，在無菌條件下加入BAP 1.67mg/L、替卡西林(Tic)250mg/L、頭孢霉素(Cef)100mg/L。用3M透氣膠帶封口并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室(24℃，18/6光照強(qiáng)度140μmoles/m²/sec)，培養(yǎng)4周，每?jī)芍芨鼡Q一次新鮮的SI培養(yǎng)基。叢生芽誘導(dǎo)篩選4周后，切除殘余子葉，并轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)(SE)培養(yǎng)基上，SE培養(yǎng)基含MS大量、微量和維生素(Murashige and Skoog，1962)、蔗糖30g/L、MES 0.59g/L、瓊脂(Sigma，USA)8g/L，pH5.8，120℃滅菌20min后，在無菌條件下加入GA 30.5mg/L、L-天冬酰胺(L-Asp)50mg/L、谷氨酰胺(Glu)50mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1mg/L、玉米素(ZR)1mg/L、Tic 250mg/L和Cef 100mg/L，培養(yǎng)條件同叢生芽誘導(dǎo)過程，培養(yǎng)2～8周，每2周更換一次新鮮的SE培養(yǎng)基。將伸長(zhǎng)3-4厘米的幼芽切下，在吲哚丁酸(IBA)中蘸30s～1min后插入生根培養(yǎng)基(RM)中，RM培養(yǎng)基含MS大量、微量和維生素、蔗糖20g/L、MES 0.59g/L、瓊脂(Sigma,USA)8g/L、IBA 0.1mg/L、L-Asp 50mg/L、Glu 50mg/L、Tic 250mg/L、Cef 100mg/L。1～2周后待根長(zhǎng)約2-3厘米時(shí)，將生根苗從培養(yǎng)基中取出，洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入土中移至溫室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為24℃，18/6光照強(qiáng)度140μmoles/m²/sec。

實(shí)施例3：轉(zhuǎn)基因材料驗(yàn)證

由于轉(zhuǎn)基因所用載體中有編碼草丁膦乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶(PAT)，可催化草丁膦的自由氨基乙酰化，從而使除草劑草丁膦失活。鑒定用除草劑Basta，原液稀釋1000倍后(濃度為200mg/L)，對(duì)轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)行噴灑，陰性植株枯萎死亡，陽性植株表現(xiàn)出明顯抗性，保持良好生長(zhǎng)。取除草劑檢測(cè)存活的陽性植株的葉片提取DNA(采用CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒：鐘鼎公司，貨號(hào)DN14-100T)，利用PCR檢測(cè)標(biāo)記bar基因進(jìn)一步篩選陽性材料。bar基因引物序列如下：

Seq ID NO.7：上游引物5’-ATGAGCCCAGAACGACGC-3’；

Seq ID NO.8：下游引物5’-ACGTCATGCCAGTTCCCGT-3’。

最終獲得8個(gè)T₀代獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系。將收獲的轉(zhuǎn)基因材料T₁代種子盆栽于滅過菌的混合營(yíng)養(yǎng)土中(營(yíng)養(yǎng)土:蛭石＝2:1)，放置于溫室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24℃，18/6光照強(qiáng)度140μmoles/m²/sec。用200mg/L草丁膦+0.1％Tween-20的組合用棉簽對(duì)T₁代大豆轉(zhuǎn)化植株的葉片進(jìn)行涂抹，以主脈為界，涂在半片大豆葉片上，在另一半葉片上用記號(hào)筆做上標(biāo)記表示未涂除草劑的對(duì)照，3-5天后觀察葉片。如圖2A所示，如果涂有除草劑的一半葉片相比于對(duì)照有明顯的枯萎現(xiàn)象表示該樣品為陰性；如果葉片正常則表示該樣品為陽性。取草丁膦檢測(cè)為陽性植株的葉片提取DNA，利用PCR擴(kuò)增bar基因片段進(jìn)一步篩選陽性材料。如圖2B所示，轉(zhuǎn)基因材料能夠檢測(cè)到bar基因。取以上兩種方法檢測(cè)均為陽性的大豆轉(zhuǎn)基因植株的葉片用試紙條(EnviroLogix Inc.，USA)檢測(cè)PAT/bar蛋白，方法如下：

(1)將樣品葉片組織置于一次性組織提取管的蓋子與管身之間，迅速蓋住蓋子，得到圓形葉片組織，用杵將葉片置于提取管的底部；

(2)將杵插入管中，旋轉(zhuǎn)杵碾攪碎葉片，持續(xù)按壓20～30秒，加入0.5mL提取緩沖液；

(3)重復(fù)碾碎步驟使樣品與緩沖液充分接觸混合，拿掉杵棒；

(4)反應(yīng)管保持直立，將試紙插入反應(yīng)管，樣品液會(huì)沿試紙上升，反應(yīng)10分鐘后讀取結(jié)果。

如圖2C所示，一個(gè)樣品中試紙條如果同時(shí)顯示兩條紅線意味著bar基因的編碼產(chǎn)物(PAT)可以在翻譯水平被檢測(cè)到，同時(shí)意味著此樣品為陽性的轉(zhuǎn)基因材料。

實(shí)施例4：轉(zhuǎn)基因材料的Southern blot雜交分析

4個(gè)T₁代植株(表現(xiàn)為草丁膦抗性，PCR和試紙條檢測(cè)陽性)的DNA被用于Southern分析，檢測(cè)目的基因插入基因組拷貝數(shù)。具體方法如下：

(1)探針制備

制備GmOLEO1基因探針的引物序列如下:

Seq ID NO.9：GmOLEO1-PF 5’-GCTACTCCACTCAGGTCGTC-3’；

Seq ID NO.10：GmOLEO1-PR 5’-CACCCCACTGATTTGCTG-3’。

步驟一：采用PCR制備探針模板，按照以下組份配制PCR反應(yīng)液(50μl體系)：10×buffer(plus Mg²⁺)(5μl)，dUTP標(biāo)記混合物(5μl)，GmOLEO1-PF(1μl)，GmOLEO1-PR(1μl)，Taq酶(1μl)，DNA(1μl)，ddH₂O(36μl)；

步驟二：反應(yīng)在BIO-RAD PTC-200型PCR儀上進(jìn)行，設(shè)定反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；再94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35個(gè)循環(huán)；然后72℃復(fù)性7min；4℃保存；

步驟三：PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(鐘鼎公司，貨號(hào)DR01-50T)回收對(duì)照DNA，測(cè)序正確后待用。

(2)基因組DNA的提取酶切

對(duì)組織樣品進(jìn)行基因組DNA提取，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后對(duì)基因組進(jìn)行酶切，照以下組份配制酶切體系：10×M buffer(60μl)，Hind III(30μl)，基因組(10μg)，滅菌水(補(bǔ)足至600μl)。內(nèi)切酶分兩次加入，第一次加10μl，溫和攪拌，37℃消化2h，再加入10μl，溫和攪拌，37℃消化過夜(約16h)，次日再加入10μl，繼續(xù)反應(yīng)4h。各取5μl，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。酶切后的DNA用等體積酚：氯仿抽提，產(chǎn)物溶于50μl去離子水。

(3)電泳

將制備好的樣品進(jìn)行0.7％的瓊脂糖凝膠電泳，25V恒壓、低溫、過夜。

(4)轉(zhuǎn)膜

步驟一：將膠置于平皿、用蒸餾水沖洗一次后，加入數(shù)倍體積變性液室溫振蕩45min；

步驟二：用蒸餾水沖洗2次，加入中和液室溫振蕩2×15min；

步驟三：用蒸餾水沖洗2次，加入2×SSC以平衡凝膠和帶正電荷的尼龍膜5min；

步驟四：向上毛細(xì)管法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜20h，取下膜作好標(biāo)記，在2×SSC中漂洗一次，80℃烘烤固定2h。

(5)雜交

步驟一：預(yù)雜交：取10.0ml Hyb-100，加入雜交管中，37℃預(yù)雜交2h；

步驟二：探針變性：探針在PCR儀中100℃變性10min，立即放冰水浴冷卻5min；

步驟三：雜交：排盡預(yù)雜交液，在10.0ml Hyb-100中加入20μl新變性好的探針，混勻，37℃雜交過夜。

(6)洗膜、信號(hào)檢測(cè)

步驟一：雜交后室溫下，20ml 2×SSC/0.1％SDS洗膜2×5min；

步驟二：65℃，20ml 1×SSC/0.1％SDS洗滌2×15min；

步驟三：再將膜置于20ml洗滌緩沖液中平衡2-5min；

步驟四：將膜在10ml封閉液中封閉30min(在搖床上輕輕搖動(dòng))；

步驟五：Anti-Dig-AP在10000rpm下離心5min，離心后將Anti-Dig-AP用封閉液稀釋(1∶5000)，2.0μl Anti-Dig-AP加入10ml封閉液混勻；

步驟六：封閉完成后倒出封閉液，加入稀釋好的10ml抗體溶液，浸膜至少30min；

步驟七：去除抗體溶液，用20ml洗滌緩沖液緩慢洗膜2次，每次15min；

步驟八：在膜的正面(核酸面)滴加1ml的CSPD，隔絕空氣15-25℃反應(yīng)5min，去除多

余的液體，37℃孵育10min；

步驟九：在暗房用X-ray film曝光，顯影，定影，洗片，曝光記錄結(jié)果。

如圖3所示，非轉(zhuǎn)基因大豆具有四個(gè)拷貝，由于目的基因是大豆的內(nèi)源基因并且大豆是古四倍體植物，與非轉(zhuǎn)基因大豆相比，T1代轉(zhuǎn)基因植株展現(xiàn)出相同的T-DNA整合模式，并且轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)很低，每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系僅包含一個(gè)拷貝的插入。

實(shí)施例5：大豆種子的油脂含量測(cè)定

使用近紅外光譜籽粒分析儀(波通型號(hào)DA7200，瑞典)對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆和GmOLEO1過表達(dá)大豆植株種子的油脂含量進(jìn)行測(cè)定。定標(biāo)曲線由農(nóng)業(yè)部谷物及其產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心制作。該曲線是基于900份不同籽粒油脂含量的大豆樣品制作而成。曲線方程的決定系數(shù)R²為0.96，標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.50。每個(gè)樣品裝入60毫米的杯子進(jìn)行旋轉(zhuǎn)掃描，每個(gè)樣品掃描3次。測(cè)定結(jié)果顯示在大豆中過表達(dá)油體蛋白基因GmOLEO1后，導(dǎo)致種子油脂含量顯著升高。如圖4所示，非轉(zhuǎn)基因大豆的油脂含量約為17.84％，而四個(gè)過表達(dá)株系的油脂含量分別約為20.13％、20.17％、20.07％、19.76％，相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因大豆，分別提高了12.86％、13.06％、12.52％、10.79％。

<110> 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 大豆油體蛋白基因GmOLEO1及其編碼蛋白與應(yīng)用

<160> 10

<210> 1

<211> 444

<212> DNA

<213> 大豆（Glycine max L.）

<220>

<223>大豆油體蛋白基因GmOLEO1

<400> 1

atggctgagc ttcactacca acaacaacac caataccctc accgataccc taatgatcca 60

tacgaacaac aaactagcta ctccactcag gtcgtcaagg cggccaccgc cgtcaccgcg 120

ggcggctccc tcttgatcct cgcctcgttg atccttgccg gcaccatcat cgccctcacc 180

atcgtcacac caccgctcgt catcttcagt ccggttctcg tccccgcggt gatcaccgtc 240

gcgctgctga gcctggggtt ccttgcctcc ggcgggttcg gtgtggcggc gatcacggtg 300

ctggcgtgga tctacaggta cgtcaccggg aagtacccac ctggcgcgga tcagttggac 360

agcgcgcctc acaagatcat ggacaaggcg cgtgagatca aggactatgg acagcagcaa 420

atcagtgggg tgcaggcttc ttaa 444

<210> 2

<211> 147

<212> PRT

<213> 大豆（Glycine max L.)

<220>

<223>大豆油體蛋白基因GmOLEO1編碼的蛋白質(zhì)

<400> 2

Met Ala Glu Leu His Tyr Gln Gln Gln His Gln Tyr Pro His Arg Tyr

1 5 10 15

Pro Asn Asp Pro Tyr Glu Gln Gln Thr Ser Tyr Ser Thr Gln Val Val

20 25 30

Lys Ala Ala Thr Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Ile Leu Ala

35 40 45

Ser Leu Ile Leu Ala Gly Thr Ile Ile Ala Leu Thr Ile Val Thr Pro

50 55 60

Pro Leu Val Ile Phe Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Val Ile Thr Val

65 70 75 80

Ala Leu Leu Ser Leu Gly Phe Leu Ala Ser Gly Gly Phe Gly Val Ala

85 90 95

Ala Ile Thr Val Leu Ala Trp Ile Tyr Arg Tyr Val Thr Gly Lys Tyr

100 105 110

Pro Pro Gly Ala Asp Gln Leu Asp Ser Ala Pro His Lys Ile Met Asp

115 120 125

Lys Ala Arg Glu Ile Lys Asp Tyr Gly Gln Gln Gln Ile Ser Gly Val

130 135 140

Gln Ala Ser

145

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>基因GmOLEO1擴(kuò)增上游引物

<400> 3

cctaccacat taattactca ctcttcactc a 31

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>基因GmOLEO1擴(kuò)增下游引物

<400> 4

tcaactttaa cgctcattcc tgcattcat 29

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>無縫克隆上游引物

<400> 5

tttggagaga acacgtatgg ctgagcttca ctaccaac 38

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>無縫克隆下游引物

<400> 6

tcggggaaat tcggggttaa gaagcctgca ccccactg 38

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223> bar基因擴(kuò)增上游引物

<400> 7

atgagcccag aacgacgc 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223> bar基因擴(kuò)增下游引物

<400> 8

acgtcatgcc agttcccgt 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223> GmOLEO1基因探針制備上游引物

<400> 9

gctactccac tcaggtcgtc 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223> GmOLEO1基因探針制備下游引物

<400> 10

caccccactg atttgctg 18