本發(fā)明涉及一種基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序裝置，具體是涉及一種基于焦磷酸測(cè)序的基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序裝置及系統(tǒng)，屬于基因檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

一、焦磷酸測(cè)序概況

焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing)是于1987年發(fā)展起來(lái)的、基于DNA合成過(guò)程中釋放的焦磷酸(PPi)檢測(cè)的測(cè)序技術(shù)，焦磷酸測(cè)序反應(yīng)在一系列酶的催化作用下的，其過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生與脫氧三磷酸核苷(dNTP)的聚合數(shù)目成比例的可見光，通過(guò)對(duì)可見光檢測(cè)可達(dá)到測(cè)定DNA序列的目的。焦磷酸測(cè)序有兩種實(shí)現(xiàn)方法：液相焦磷酸測(cè)序法(Liquid Phase Pyrosequencing)和固相焦磷酸測(cè)序法(Solid Phase Pyrosequencing)。

液相焦磷酸測(cè)序是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，其原理是：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sμLfurylase)、熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)協(xié)同作用下，將引物DNA上每一個(gè)dNTP的聚合與熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的(馬永平等，焦磷酸測(cè)序技術(shù)及其在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè)2003，25(2):115-117)。

液相焦磷酸測(cè)序的反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測(cè)單鏈、特異性測(cè)序引物和酶構(gòu)成，反應(yīng)底物為5’-磷酰硫酸(APS)和熒光素(1uciferin)。液相焦磷酸測(cè)序反應(yīng)過(guò)程是一個(gè)向反應(yīng)體系中輪流加入4種dNTP參與反應(yīng)的過(guò)程，每輪反應(yīng)只有一種dNTP參加。如果加入的dNTP剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則其在DNA聚合酶的作用下被添加到測(cè)序引物的3’末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)；在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi和APS結(jié)合形成ATP；在熒光素酶的作用下，生成的ATP又和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。如果加入的這種dNTP剛好能和DNA模板的下面連續(xù)n個(gè)相同堿基匹配，根據(jù)反應(yīng)方程式可知，釋放出的可見光強(qiáng)度應(yīng)是只有1個(gè)堿基匹配時(shí)的n倍，也即反應(yīng)過(guò)程中釋放的光強(qiáng)度與相匹配的堿基數(shù)目成比例關(guān)系。如果加入的dNTP和DNA模板的下一個(gè)堿基不匹配，則上述反應(yīng)不會(huì)發(fā)生，也沒有可見光的釋放。未參加反應(yīng)的dNTP和ATP在核苷酸降解酶Apyrase的作用下降解。

每輪反應(yīng)釋放出的可見光通過(guò)微弱光檢測(cè)裝置轉(zhuǎn)化，再被處理為數(shù)字信號(hào)，經(jīng)PC軟件處理即可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低應(yīng)和相匹配的堿基數(shù)目成比例關(guān)系。

待上一輪反應(yīng)結(jié)束后，加入另一種dNTP，重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)。最終可根據(jù)獲得的光強(qiáng)度峰值圖即可讀取的待測(cè)DNA序列信息。

需要注意的是：dATP的降解產(chǎn)物脫氧單磷酸鳥苷(dAMP)是熒光素酶的抑制劑，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，其濃度會(huì)越來(lái)越高，會(huì)阻礙焦磷酸測(cè)序化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行。這也是焦磷酸測(cè)序法測(cè)序長(zhǎng)度較短(通常為20bp～30bp)的主要原因(Shendure J，et a1.Advanced sequencing technologies:Methods and goals，Nat.Rev Genet.，2004，5(5):335-44)。

固相焦磷酸測(cè)序是由3種酶催化的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，與液相焦磷酸測(cè)序相比，沒有三磷酸腺苷雙磷酸酶參加。固相焦磷酸測(cè)序反應(yīng)過(guò)程如下：結(jié)合了引物的DNA模板被固定于支撐物上并在反應(yīng)過(guò)程中保持位置不變；加入一種dNTP后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和熒光素酶協(xié)同作用下發(fā)生反應(yīng)，除了沒有降解反應(yīng)發(fā)生，其他反應(yīng)與液相焦磷酸測(cè)序完全相同；在加入下一種dNTP前有一個(gè)沖洗步驟(washing step)將上輪反應(yīng)殘留物完全沖走，不會(huì)有抑制性產(chǎn)物的堆積。

通常情況下，人們所說(shuō)的焦磷酸測(cè)序法指的是液相焦磷酸測(cè)序法，因?yàn)槠渌拿阜磻?yīng)系統(tǒng)使得焦磷酸測(cè)序可以很方便地在單管中實(shí)現(xiàn)。

Ronaghi等利用dATPαS替代dATP提高焦磷酸測(cè)序的信噪比(Ronaghi M.et a1.Real-time DNA sequencing using detection of PPi release；Anal.Biochem，1996，242(1):84-89)。因?yàn)閐ATPαS可以比dATP被DNA聚合酶更有效地利用，更有利于閱讀富含T的區(qū)域。dATPαS是兩種異構(gòu)體Sp-dATPαS和Rp-dATPαS的混合物，聚合酶只能利用Sp-dATPαS。為了得到最佳反應(yīng)效率，必須在反應(yīng)體系中保持最佳濃度的Sp-dATPαS，與此同時(shí)Rp-dATPαS的濃度也在增加。dATPαS被Apyrase降解后仍會(huì)產(chǎn)生熒光素酶的抑制物，因此dATPαS的加入并沒有提高讀序能力。

Gharizadeh等人對(duì)此進(jìn)行了改進(jìn)，他們?cè)诜磻?yīng)中只加入純的Sp-dATPαS，而不加入無(wú)用的Rp-dATPαS，提高了反應(yīng)的效率，大大降低了抑制產(chǎn)物的濃度，使得熒光素酶能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間的活性，使焦磷酸測(cè)序法的測(cè)序長(zhǎng)度增加到50bp～100bp，測(cè)序長(zhǎng)度的增加也使得焦磷酸測(cè)序技術(shù)有了許多新的應(yīng)用(Gharizadeh B.et al.，Long-read pyrosequencing using pure 2’-deoxyadenosine-5’-0’-(1-thiotriphosphate)Sp-isomer；Anal Binchem，2002.301:82-90)。

在2000年舉辦的第十二屆基因組測(cè)序和分析會(huì)議(12th International Genome Sequencing and Analysis Conference)上，Ronaghi等人提出了一種移除抑制產(chǎn)物、減小稀釋效應(yīng)的方法，將測(cè)序長(zhǎng)度增加到200bp。

與sanger雙脫氧鏈終止測(cè)序法相比，焦磷酸測(cè)序法具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、實(shí)時(shí)檢測(cè)的特點(diǎn)；它不需要凝膠電泳，也不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，具有很高的可重復(fù)性；能實(shí)現(xiàn)高度的并行性和高度的自動(dòng)化。

二、焦磷酸測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

1在單核苷酸多態(tài)性研究中的應(yīng)用

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)是近年來(lái)出現(xiàn)的第三代遺傳標(biāo)記，它指在基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最少的一種在群體的頻率不小于1％。SNPs是生物的基因組中最為常見的遺傳多態(tài)型，它可以在任何一個(gè)待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標(biāo)記；而正是這種基因組中的多態(tài)性，即基因組序列的差異構(gòu)成了不同個(gè)體與群體對(duì)疾病的易感性、對(duì)藥物與環(huán)境因子不同反應(yīng)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

SNP的研究主要包括兩個(gè)方面：一是SNP數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建，主要是發(fā)現(xiàn)特定種類生物基因組的全部或部分SNP。二是SNP功能研究，發(fā)現(xiàn)SNP只是SNP研究的第一步，SNP功能的研究才是SNP研究的目的。Sanger測(cè)序技術(shù)已成為大規(guī)模、準(zhǔn)確、快速發(fā)現(xiàn)SNP的主流技術(shù)。而對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已有SNP進(jìn)行序列驗(yàn)證分析和頻率分析，擅長(zhǎng)短序列測(cè)序和驗(yàn)證的焦磷酸測(cè)序技術(shù)是很好的選擇，采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)進(jìn)行SNP研究，更可以節(jié)約時(shí)間并降低消耗。

Nordfors等分別采用Taqman熒光定量法和焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)高達(dá)1022個(gè)樣本進(jìn)行SNP基因分型研究，獲得了相同的結(jié)果，此對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明焦磷酸測(cè)序技術(shù)是進(jìn)行高通量、大樣本的SNPs的高效、高準(zhǔn)確度的方法。Wasson等利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)來(lái)進(jìn)行DNA池(DNA pools)的SNP等位基因頻率分析。Rickert等采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)4倍體馬鈴薯進(jìn)行基因型研究，在對(duì)94個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)中，有76個(gè)等位基因位點(diǎn)可用焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別，有效率達(dá)81％。蔣思文等利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)進(jìn)行了鑒別豬線粒體細(xì)胞色素b基因單倍型的工作。袁建林等利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)進(jìn)行HLA-DRB基因型分析研究，實(shí)驗(yàn)表明，將焦磷酸測(cè)序結(jié)果與HLA數(shù)據(jù)庫(kù)的基因序列比較后可準(zhǔn)確進(jìn)行基因分型，該方法可應(yīng)用于臨床器官移植的供體/受體篩查。

2在病原微生物快速鑒定中的應(yīng)用

Jonasson等用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)病原菌16S rRNA基因，快速鑒定出臨床標(biāo)本中抗生素抵抗菌。Monstein等用焦磷酸測(cè)序技術(shù)成功檢測(cè)幽門螺桿菌16S rRNA基因易變的V1和V3區(qū)序列，證明該技術(shù)可滿足對(duì)臨床病原菌標(biāo)本的快速鑒定和分型。Unnerstad等利用該技術(shù)對(duì)106株不同血清型的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行了分型，利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)完成大量的樣本測(cè)序，其并行性和高效率非常顯著。Gharizadeh等用此技術(shù)對(duì)67個(gè)人乳頭瘤病毒樣品進(jìn)行了鑒定和分型，證明該技術(shù)也非常適于HPV等病原體的大規(guī)模鑒定、分型和突變的研究。程紹輝等從感染人SARS病毒的Vero-6細(xì)胞中提取病毒RNA，采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)多個(gè)堿基突變位點(diǎn)測(cè)序和突變頻率分析。通過(guò)測(cè)序分析多個(gè)可能出現(xiàn)突變的位點(diǎn)，確定了該病毒為北京流行株。

3在病因?qū)W研究中的應(yīng)用

Kittles等利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，對(duì)尼日利亞人、歐洲裔美國(guó)人和非洲裔美國(guó)人三個(gè)不同種群的CYPl7基因多態(tài)性進(jìn)行分析，研究非洲裔美國(guó)人的CYPl7基因多態(tài)性與前列腺癌之間的關(guān)系和臨床表現(xiàn)。研究結(jié)果表明，序列為CC的CYPl7基因型的非洲裔美國(guó)人比序列為TT的CYPl7基因型非洲裔美國(guó)人患前列腺癌的幾率要高，證明這類人群中的堿基為C的CYPl7基因多態(tài)性與前列腺癌的發(fā)病率關(guān)系密切，為高危人群。眾多線索表明，位于染色體22q11的COMT基因與精神分裂癥的發(fā)病存在重要聯(lián)系，而科學(xué)家的研究工作一直沒能提出有力的證據(jù)；Shifman等提出了一種有效的方法，他們利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，對(duì)大樣本的德系猶太人群進(jìn)行相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性分析，證實(shí)精神分裂癥的發(fā)生與CMOT基因之間存在高度的關(guān)聯(lián)。這種方法也能適用于其他疾病的基因分析研究。

4在法醫(yī)鑒定中的應(yīng)用

用Sanger測(cè)序法對(duì)線粒體DNA(mtDNA)變異分析，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)由含有污染物、多個(gè)個(gè)體DNA等組成的mtDNA混合物的精確量化分析，而Andreasson等提出了一種針對(duì)mtDNA混合分析的基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的新穎的量化方法，可以很容易地從法庭證物混合樣本中快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出主要的和次要的mtDNA成分。Balitzki-Korte利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)線粒體12SrRNA基因進(jìn)行測(cè)序分析，在149bp長(zhǎng)度的基因片斷上進(jìn)行長(zhǎng)度為20bp的檢測(cè)，通過(guò)參考數(shù)據(jù)庫(kù)序列，就能夠充分確定對(duì)象的生物學(xué)起源，比如說(shuō)，能夠確定一塊皮膚組織究竟是來(lái)自失蹤人員還是動(dòng)物身上。

三、焦磷酸分析裝置及發(fā)展

焦磷酸測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用依賴于焦磷酸分析裝置的研究與開發(fā)。不論何種焦磷酸分析裝置，其主要結(jié)構(gòu)都應(yīng)包含兩個(gè)部分：反應(yīng)器部分和微弱光檢測(cè)部分。反應(yīng)器提供反應(yīng)進(jìn)行的場(chǎng)所，微弱光檢測(cè)部分負(fù)責(zé)檢測(cè)反應(yīng)發(fā)出的可見光。在人們對(duì)焦磷酸測(cè)序技術(shù)的研究和應(yīng)用過(guò)程中，設(shè)計(jì)和使用的反應(yīng)器主要可以分為3類：微量板反應(yīng)器、微流控芯片反應(yīng)器和微陣列芯片反應(yīng)器。

而商業(yè)化的焦磷酸測(cè)序儀在國(guó)外已面世，然而國(guó)內(nèi)相關(guān)儀器本身研究的報(bào)道甚少，更無(wú)相應(yīng)的產(chǎn)品問(wèn)世。國(guó)外產(chǎn)品的一個(gè)典型代表是Pyrosequencing AB公司的PSQ96，它是該公司2001年推出的產(chǎn)品，系統(tǒng)能夠同時(shí)進(jìn)行96路或者384路DNA樣本的獨(dú)立測(cè)序，當(dāng)測(cè)序長(zhǎng)度不超過(guò)300bp時(shí)一般所用時(shí)間在1小時(shí)45分鐘，準(zhǔn)確性和可靠性達(dá)到99％，具有高通量、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)。PSQ96系統(tǒng)已經(jīng)廣泛用在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床分子診斷當(dāng)中。

國(guó)外儀器研究另外一個(gè)代表是美國(guó)454Life Science公司2005年推出的Genome Sequencer20(GS20)。它走向了有著更高技術(shù)含量的微型化方向，即利用MEMS技術(shù)將微濾腔作為焦磷酸測(cè)序反應(yīng)的反應(yīng)環(huán)境，將驚人的上百萬(wàn)數(shù)目的反應(yīng)陣列集成進(jìn)7cm×8cm的面積內(nèi)，并使每個(gè)反應(yīng)艙能獨(dú)立同時(shí)進(jìn)行測(cè)序級(jí)聯(lián)反應(yīng)，儀器具有的高靈敏度和分辨率的CCD能夠捕捉到每個(gè)單反應(yīng)艙產(chǎn)生的微弱熒光信號(hào)，最終能夠得到每個(gè)標(biāo)本DNA的序列信息。GS20僅需4.5個(gè)小時(shí)即可實(shí)現(xiàn)高密度測(cè)序反應(yīng)，經(jīng)過(guò)并行計(jì)算得到每個(gè)標(biāo)本的序列信息。優(yōu)點(diǎn)是可以節(jié)省反應(yīng)試劑的消耗，降低測(cè)序成本，為基因組大規(guī)模測(cè)序提供可能。

目前國(guó)內(nèi)的儀器研究剛剛起步，國(guó)產(chǎn)化的道路漫長(zhǎng)，面對(duì)方方面面的問(wèn)題，在權(quán)衡測(cè)序系統(tǒng)所需要的各種硬件條件后，發(fā)現(xiàn)首要面對(duì)的問(wèn)題和挑戰(zhàn)是微量加樣子系統(tǒng)的研制問(wèn)題。

四、焦磷酸測(cè)序中加樣系統(tǒng)的重要性

焦磷酸測(cè)序技術(shù)及其產(chǎn)品為大通量、低成本、適時(shí)、快速、直觀地進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性研究和臨床檢驗(yàn)提供了非常理想的技術(shù)操作平臺(tái)，是后基因組時(shí)代進(jìn)行基因序列分析研究的有力工具。焦磷酸測(cè)序技術(shù)正被越來(lái)越多的研究人員接受和采用，隨著國(guó)際上焦磷酸測(cè)序技術(shù)應(yīng)用的興起和商品化焦磷酸測(cè)序儀器的發(fā)展，我國(guó)的焦磷酸測(cè)序技術(shù)應(yīng)用方興未艾。但是在現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)焦磷酸測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用和推廣存在幾個(gè)制約因素：(1)現(xiàn)有的商品化焦磷酸測(cè)序儀器如PSQ96、GS20價(jià)格昂貴；(2)商業(yè)化的焦磷酸測(cè)序服務(wù)等待時(shí)間長(zhǎng)且很不方便；(3)雖然目前有些實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行諸如焦磷酸測(cè)序芯片等裝置的研究，一些實(shí)驗(yàn)室有自制的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的焦磷酸測(cè)序試驗(yàn)裝置，但國(guó)內(nèi)沒有面向低端的、價(jià)格便宜的、商品化的基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的序列檢測(cè)儀器，是制約焦磷酸測(cè)序技術(shù)應(yīng)用發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。

焦磷酸測(cè)序系統(tǒng)是在微量環(huán)境中進(jìn)行的，通常反應(yīng)體系僅在50μL，所需的反應(yīng)底物、DNA模板以及脫氧核苷酸等試劑的量非常微??；同時(shí)，單次加樣量的多少直接影響循環(huán)反應(yīng)的可持續(xù)性，過(guò)大的單次加樣量會(huì)使反應(yīng)溶液體積迅速變大，因此造成模板濃度下降過(guò)快。由于擴(kuò)散作用產(chǎn)生的反應(yīng)延遲非線性增加，得到的微弱熒光信號(hào)在時(shí)間軸上延伸，強(qiáng)度在縱坐標(biāo)上降低，最終導(dǎo)致嚴(yán)重縮短核酸的可測(cè)序長(zhǎng)度。一般認(rèn)為由于后續(xù)加樣造成的反應(yīng)體系增加如果在10％之內(nèi)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響是在可以接受的范圍內(nèi)。假如要對(duì)一段20bp長(zhǎng)度的DNA片斷進(jìn)行測(cè)序，那么在50μL的反應(yīng)體系中，允許的單次加樣量只能不超過(guò)0.3μL。

此外，除了加樣精度，加樣間隔的時(shí)間準(zhǔn)確性也同樣重要。只有在等時(shí)間間隔內(nèi)加入單循環(huán)所需的dNTP，才能使每次的殘留dNTP的降解程度相當(dāng)，那么對(duì)下次反應(yīng)造成的影響也將相等。等時(shí)間段才能給每個(gè)周期的信號(hào)提供基準(zhǔn)，便于后續(xù)根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算核苷酸結(jié)合數(shù)目的自動(dòng)化分析。

雖然國(guó)產(chǎn)化的加樣設(shè)備已比較豐富，但是國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的微量加樣裝置都有不足。比如上海復(fù)日的加樣平臺(tái)，作為大型自動(dòng)化樣本池處理設(shè)備，能夠進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)96孔板的加樣、振蕩、清洗工作，但是這套系統(tǒng)由于噴嘴加工工藝的限制，加樣微精度最小只有1μL，無(wú)法滿足焦磷酸測(cè)序要求的nL級(jí)別。經(jīng)過(guò)調(diào)研，限制于國(guó)內(nèi)應(yīng)用和制造水平，國(guó)產(chǎn)化的加樣裝置都無(wú)法滿足焦磷酸測(cè)序中對(duì)加樣量以及重復(fù)精度的高要求。

東南大學(xué)葛健徽等公開了一種以微弱光檢測(cè)模塊和微量dNTP加樣模塊為關(guān)鍵模塊的液相焦磷酸分析裝置，其中公開了一氣壓控制微量dNTP加樣模塊，可實(shí)現(xiàn)96路dNTP溶液的同時(shí)加樣，最小加樣量為1.2μL，最大誤差為13％；但信號(hào)噪聲較大，仍需更一步改進(jìn)(葛健徽等，基于焦磷酸測(cè)序的基因檢測(cè)裝置的研制，東南大學(xué)，碩士學(xué)位論文，2006)。

王春林等公開了一種采用壓電陶瓷噴頭的焦磷酸核酸測(cè)序儀中微量加樣系統(tǒng)，該可以在步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)下，對(duì)96孔標(biāo)準(zhǔn)板樣本分別進(jìn)行4種dNTP試劑的輪流加樣，加樣重復(fù)精度大于95％，單次加樣最小量能達(dá)到0.lμL。上述兩類較佳的焦磷酸核酸測(cè)序儀中所用的微量加樣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，且加樣針易堵，dNTP通過(guò)不同的方式噴入測(cè)序反應(yīng)液內(nèi)并不與反應(yīng)液接觸使得與反應(yīng)液混合不充分反應(yīng)不完全，對(duì)dNTP要求量也較高且數(shù)據(jù)易不準(zhǔn)確；此外，拆裝麻煩，成本高且不利于特殊條件下應(yīng)用。

焦磷酸測(cè)序(preosequencing)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的DNA序列分析技術(shù)，它通過(guò)核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)。是一個(gè)理想的遺傳分析技術(shù)平臺(tái)，既可進(jìn)行DNA序列分析，又可進(jìn)行基于序列分析的單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)及等位基因頻率測(cè)定等，該項(xiàng)技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物等各個(gè)領(lǐng)域。

焦磷酸測(cè)序是由DNA聚合酶(DNA polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和雙磷酸酶(apyrase)4種酶催化同一反應(yīng)體系的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，反應(yīng)底物為5’-磷酰硫酸(adenosine 5’phosphosulfate，APS)和熒光素。反應(yīng)體系還包括待測(cè)序DNA單鏈和測(cè)序引物。在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，加入1種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。硫酸化酶催化ASP和PPi形成ATP，后者驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號(hào)，并由Pyrogram^TM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值，其高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。根據(jù)加入dNTP類型和熒光信號(hào)強(qiáng)度就可實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用α-硫化的三磷酸腺苷(dATPαS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合酶利用，而不被蟲熒光素識(shí)別。由于SpdATPαS可以降低dATPαS降解產(chǎn)物的濃度，近年來(lái)，單鏈DNA結(jié)合蛋白(single starnd DNA binding portein，SSBP)和純化Spisomer dATPaS的使用dATPαS降解產(chǎn)物抑制雙磷酸酶活性的這一問(wèn)題得到較好解決，使得測(cè)序長(zhǎng)度可達(dá)10bp，拓展了該技術(shù)在遺傳學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

焦磷酸測(cè)序中，通過(guò)使用階段性互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，檢測(cè)發(fā)光，從而來(lái)確定DNA序列。將含有由互補(bǔ)鏈合成產(chǎn)生的焦磷酸和剩余的核酸底物的反應(yīng)液從而進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成的反應(yīng)槽移動(dòng)到另外的反應(yīng)槽，進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，并在反應(yīng)液移動(dòng)的過(guò)程中通過(guò)固定有分解剩余的核酸底物的酶的區(qū)域，將剩余的核酸底物分解后，使焦磷酸轉(zhuǎn)化為ATP，導(dǎo)入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)槽。但現(xiàn)有技術(shù)的弊端是必須加入大量的底物和酶進(jìn)行反應(yīng)，以保證反應(yīng)可以完全進(jìn)行，之后需要再反應(yīng)掉多余的底物后清洗，這不僅增加了反應(yīng)過(guò)程，增大了每一步的清洗及反應(yīng)難度，還會(huì)對(duì)底物等試劑造成很嚴(yán)重的浪費(fèi)，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，浪費(fèi)人力物力，無(wú)形中降低了焦磷酸測(cè)序在市場(chǎng)中的推廣和使用潛力。

目前應(yīng)用于焦磷酸測(cè)序的儀器多為部分廠家壟斷制造和銷售，儀器與試劑均為配套銷售，測(cè)序時(shí)成本十分昂貴，檢測(cè)維修過(guò)程均需依賴于特定的技術(shù)人員，周期長(zhǎng)成本高，反應(yīng)所需的體積較大，更加大了反應(yīng)的成本，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)精度低。因此設(shè)計(jì)自主研發(fā)開發(fā)一款適用于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序儀是十分有必要的。

五、DNA單鏈分離技術(shù)概況

DNA單鏈分離技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最常見的分離技術(shù)之一，適用于不同核酸樣品的DNA各種規(guī)模測(cè)序及探針設(shè)備，廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、食品與衛(wèi)生、能源與化工、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及醫(yī)學(xué)診斷與檢測(cè)等領(lǐng)域。此外，DNA單鏈的吸附、提取與分離技術(shù)在水質(zhì)、水源、生物材料、生物體液(如血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、淚液、汗液、消化液、精液、分泌液、組織液、嘔吐物、糞便)、組織/細(xì)胞和微生物裂解液、不同來(lái)源的蛋白、核酸等生物、化學(xué)分子以及藥物等的分析檢測(cè)、分離和純化以及寡核苷酸、多肽、先導(dǎo)化合物和藥物的合成等方面被廣為應(yīng)用，與人們的日常生活息息相關(guān)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有舉足輕重的地位。

生物醫(yī)藥領(lǐng)域中常用的DNA單鏈分離方法并存在的不足如下：

1.熱變性或堿處理。該種方法主要是將雙鏈PCR產(chǎn)物進(jìn)行加熱或堿處理，由于DNA雙鏈在高溫或一定程度的堿性環(huán)境下氫鍵會(huì)斷裂，使得DNA變?yōu)閱捂湣ｋm然該種方法原理可行，操作簡(jiǎn)單，但該種方法由于其分離率和純度較低而逐漸不作為單鏈DNA的純化，多用于DNA的雙鏈分離。

2.T7逆轉(zhuǎn)錄法。該種方法是在一條PCR引物5’端加上T7啟動(dòng)子，以純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用T7RNA聚合酶體外逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈RNA(Hughes,et.al.,Nat.Biotechnol.,2001,19:342-347)。該種方法雖然原理可行，DNA單鏈分離率較高，且獲得的DNA單鏈純度較高，但整個(gè)分離過(guò)程需分為兩大步驟完成，操作不便，時(shí)間較長(zhǎng)，而且需嚴(yán)格控制RNA酶的污染，故具有一定的局限性。

3.核酸外切酶法(Higuchi and Ochman,Nucleic.Acids Res.,1989,17:5865)。由于一條PCR引物被磷酸化，PCR產(chǎn)物在用核酸外切酶消化時(shí)，被磷酸化的引物擴(kuò)增鏈不被切割，消化后酶被加熱滅活。該種方法也需純化PCR產(chǎn)物，分離程序冗長(zhǎng)，操作亦十分不便，而且DNA單鏈獲得率依賴于外切酶的活性，不可控因素過(guò)強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性不夠；因此，該種方法的推行率不廣，通用性不高。

4.變性高效液相色譜法(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)。在部分變性的條件下，通過(guò)雜合與純合二倍體在柱中保留時(shí)間的差異，發(fā)現(xiàn)DNA突變。異源DNA雙鏈與同源DNA雙鏈的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯(cuò)配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時(shí)間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來(lái)，在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。由于一條PCR引物被生物素標(biāo)記，其PCR擴(kuò)增鏈在DHPLC時(shí)，會(huì)與另一條普通鏈分開(Dickman and Hornby,Anal.Biochem.,2000,284:164-167)。該方法可以在15min內(nèi)直接從雙鏈PCR產(chǎn)物中獲得所需的DNA單鏈，但該種方法的實(shí)施需要配套十分昂貴的儀器，故始終難以普及。

5.磁珠捕獲法。運(yùn)用納米技術(shù)對(duì)超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識(shí)別和高效結(jié)合。利用氧化硅納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場(chǎng)的作用下，能從血液、動(dòng)物組織、食品、病原微生物等樣本中的DNA和RNA分離出來(lái)，然后用NaOH處理得到目標(biāo)單鏈。該種方法操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短，整個(gè)提取流程分為四步，大多可以在36-40分鐘內(nèi)完成，且安全無(wú)毒，不使用傳統(tǒng)方法中的苯、氯仿等有毒試劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的傷害減少，符合現(xiàn)代環(huán)保理念，磁珠與DNA單鏈的特異性結(jié)合使得提取的DNA單鏈純度高、濃度大，但該種方法中使用的包被磁珠較為昂貴，且需要依靠磁力架分離，不僅分離成本較高，還不方便，故在一定程度上限制了該技術(shù)的推廣。

6.不對(duì)稱PCR。以上方法均需在PCR后進(jìn)行額外的處理，而不對(duì)稱PCR可在PCR擴(kuò)增的同時(shí)制備DNA單鏈。常規(guī)不對(duì)稱PCR使用兩條不等量的引物，在開始的循環(huán)里進(jìn)行正常擴(kuò)增。隨著循環(huán)的增加，量少的引物被逐漸耗盡，而超量的引物可繼續(xù)直線擴(kuò)增生成DNA單鏈(Gyllensten and Erlich,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85:7652-7656)。該種方法具有較高的雜交靈敏度和特異性，且操作簡(jiǎn)便性更強(qiáng)，但其引物的比例需要優(yōu)化，而且非特異擴(kuò)增的機(jī)會(huì)增加，此外，DNA單鏈分離過(guò)程需要依靠電泳，分離程序復(fù)雜，且電泳時(shí)?？梢姀浬l帶，其耗時(shí)和不便是顯而易見的。

上述幾種分離方法均具有一定的局限性，因此，為了滿足對(duì)DNA單鏈分離的可操作性及經(jīng)濟(jì)性要求，現(xiàn)有技術(shù)中的DNA單鏈采用的是集成化的提取工作站，將帶有鏈親和素的親和連接體與DNA雙鏈結(jié)合，工作站具有抽濾針及配套的泵，結(jié)合后的DNA親和連接體通過(guò)抽濾吸附在抽濾針內(nèi)濾膜下部，工作站配有軌道及相關(guān)系統(tǒng)，抽濾結(jié)束后將抽濾針移至盛有NaOH的盤中，通過(guò)堿處理解雙螺旋，得到DNA單鏈，再次抽濾后清洗收集。抽濾針一般24根(4*6)為一組，使用時(shí)必須保證有足夠量的樣品或試劑以保證工作站的正常運(yùn)行，因此這種DNA單鏈的收集方式十分的不靈活，只能以固定量加入工作站進(jìn)行工作，且大量的損失在多次的抽濾及轉(zhuǎn)移過(guò)程中產(chǎn)生，這對(duì)微量收集十分不利，并且抽濾針組需要同時(shí)進(jìn)行工作，這對(duì)工作站各部件都具有一定的體積要求，整個(gè)工作站占用空間很大。龐大的系統(tǒng)使得在DNA單鏈分離操作過(guò)程中，微分離柱需要來(lái)回反復(fù)移液，操作十分繁瑣，不僅分離周期長(zhǎng)、效率低，且整體設(shè)備價(jià)格較貴，導(dǎo)致DNA單鏈分離的費(fèi)用高，還需要耗費(fèi)大量的試劑及其他資源，極不經(jīng)濟(jì)。此外，該工作站中抽濾針為金屬材質(zhì)，價(jià)格昂貴，往往是處理后再重復(fù)使用，故易導(dǎo)致殘留物之間的交叉污染，可靠性不高，對(duì)分離及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性均會(huì)造成一定的干擾和影響。且溶液抽取過(guò)程中會(huì)有部分殘余溶液貼壁，使得一定量的目的DNA單鏈不能被微分離柱吸附，導(dǎo)致獲得的DNA單鏈比例降低，影響了分離率，造成了浪費(fèi)。因此，用于焦磷酸測(cè)序的高質(zhì)量高效率的DNA單鏈分離問(wèn)題亟待解決。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)的基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序裝置及系統(tǒng)。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序裝置，包括樣品區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)；

所述樣品區(qū)包括可旋轉(zhuǎn)的分離盤，所述分離盤位于反應(yīng)區(qū)的上方，所述分離盤包括至少一個(gè)DNA分離區(qū)，所述分離區(qū)包括內(nèi)部設(shè)有濾膜的中空的過(guò)濾柱，連有親和連接體的DNA單鏈和未連接親和連接體的DNA單鏈經(jīng)所述濾膜過(guò)濾后分離；

所述反應(yīng)區(qū)包括加樣部和樣品槽，所述加樣部包括dNTP試劑槽、加樣針架和安裝于其上的多個(gè)加樣針，所述分離盤位于試劑槽的側(cè)上方；所述加樣針架位于樣品槽上；所述樣品槽上設(shè)有多個(gè)槽位；

所述檢測(cè)區(qū)包括生物發(fā)光檢測(cè)裝置，所述槽位與生物發(fā)光檢測(cè)裝置連接；

所述樣品區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)安裝在分析臺(tái)上，所述分析臺(tái)的側(cè)面設(shè)有用于操作的機(jī)械手。

作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：

優(yōu)選地，濾膜設(shè)于過(guò)濾柱的一端。換言之，濾膜構(gòu)成了過(guò)濾柱的底端，DNA分離區(qū)的過(guò)濾面設(shè)于分離柱底，也就是說(shuō)分離后的單鏈DNA在濾膜上。

進(jìn)一步，作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，過(guò)濾柱的外徑等于收集管的內(nèi)徑，通過(guò)摩擦力可使過(guò)濾柱與收集管保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，不需要外加結(jié)構(gòu)為過(guò)濾柱進(jìn)行限位固定。

另一種優(yōu)選的方式，所述分離盤設(shè)有多個(gè)收集管，所述過(guò)濾柱安裝于收集管中，所述濾膜位于過(guò)濾柱的非端部。

進(jìn)一步，所述濾膜為高分子納米微球結(jié)構(gòu)，所述高分子納米微球間的孔徑小于親和連接體的直徑。

進(jìn)一步，所述收集管設(shè)有可拆卸的上蓋，所述上蓋通過(guò)連接帶與收集管連接。

分離后的單鏈DNA在濾膜上為連接有親合體的單鏈，需要該條鏈可對(duì)濾膜進(jìn)行洗脫，濾液中含有不帶親和連接體的另一條互補(bǔ)鏈，需要反向測(cè)序時(shí)可對(duì)濾液內(nèi)的單鏈DNA進(jìn)行收集。當(dāng)需要收集濾膜上的帶親和連接體的一條鏈的時(shí)候，收集管可采用回收的收集管，此時(shí)收集管僅起到回收廢液的作用，回收使用降低成本，并且環(huán)保減少白色污染的產(chǎn)生。

優(yōu)選地，所述試劑槽設(shè)有多個(gè)反應(yīng)位，所述試劑槽的側(cè)下方設(shè)有底物供給部，所述底物供給部通過(guò)輸送管道向反應(yīng)位輸送dNTP的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種核酸底物。

優(yōu)選地，所述加樣針架為圓盤形，所述加樣針架通過(guò)移動(dòng)部可沿試劑槽和樣品槽之間做往復(fù)運(yùn)動(dòng)；所述加樣針架通過(guò)轉(zhuǎn)軸做旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。

優(yōu)選地，所述移動(dòng)部包括通過(guò)安裝架固定在分析臺(tái)上方的滑軌以及所述加樣針架底端的滑塊。

優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)軸設(shè)有驅(qū)動(dòng)電機(jī)。

優(yōu)選地，所述加樣針為實(shí)心針，所述加樣針固定于加樣針架的通孔中。

優(yōu)選地，所述加樣部還包括干燥槽和清洗槽。

優(yōu)選地，所述槽位沿樣品槽的圓心呈一系列同心圓均勻排列，所述槽位由透明材質(zhì)構(gòu)成，所述槽位延伸入生物發(fā)光檢測(cè)裝置。

優(yōu)選地，所述生物發(fā)光檢測(cè)裝置包括固定殼和相機(jī)，所述相機(jī)可旋轉(zhuǎn)的位于固定殼中，所述相機(jī)位于所有槽位圍設(shè)的中軸線上。相機(jī)通過(guò)旋轉(zhuǎn)可以拍攝所有槽位中的反應(yīng)情況。

本發(fā)明的目的還在于提供了一種基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序系統(tǒng)，包括上述的測(cè)序裝置，以及用于控制測(cè)序裝置的控制區(qū)；所述控制區(qū)包括微型計(jì)算機(jī)、光控制系統(tǒng)、位置控制系統(tǒng)、環(huán)境控制系統(tǒng)、活性檢測(cè)系統(tǒng)和驅(qū)動(dòng)控制系統(tǒng)；所述環(huán)境控制系統(tǒng)包括對(duì)溶液濃度和PH值的控制。

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序裝置及系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是：

(1)將DNA單鏈通過(guò)過(guò)濾離心的方式來(lái)進(jìn)行提取，實(shí)現(xiàn)了一樣品一收集的經(jīng)濟(jì)化小型化收集，提供了一種高效低損失的快速DNA單鏈分離方法及裝置。本方法簡(jiǎn)單易操作，獲取目標(biāo)樣品時(shí)間短效率高，可用于痕量DNA單鏈的收集與提取，樣品損失幾乎可以忽略，使用試劑少、對(duì)設(shè)備的要求低，在分離過(guò)程無(wú)需抽水泵，大大簡(jiǎn)化了設(shè)備配置，降低了設(shè)備總成本，有效簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了操作時(shí)間，降低了工作強(qiáng)度，提高了工作效率；采用與常規(guī)離心管配套的過(guò)濾柱不僅保證了分離的質(zhì)量及效率，也使得分離過(guò)程簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)，過(guò)濾柱的濾膜通過(guò)物理方式對(duì)DNA單鏈進(jìn)行分離，降低了分離的難度及條件要求。濾膜由均質(zhì)的材料以相同結(jié)構(gòu)組成，可雙向調(diào)換使用，增大了過(guò)濾柱的設(shè)計(jì)可能性，不僅可以制作為一端帶有濾膜的中空結(jié)構(gòu)，豐富DNA單鏈分離裝置的結(jié)構(gòu)及種類，在確保相同功能的前提下，增加了本發(fā)明的DNA單鏈分離裝置的運(yùn)用場(chǎng)合，避免了產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一，適應(yīng)性顯著增強(qiáng)；而且可以采用上下對(duì)稱結(jié)構(gòu)，可上下調(diào)換配合使用。本DNA單鏈分離裝置采用價(jià)格低廉的PC塑料，經(jīng)濟(jì)且實(shí)用，漏斗形內(nèi)腔的設(shè)計(jì)，有利于反應(yīng)液的聚集與引導(dǎo)，使得反應(yīng)液分離更充分更完全，獲得了較高比例的目的DNA單鏈，保證了較高的分離率，避免了浪費(fèi)。此外，本DNA單鏈分離裝置還適用于市售離心管，標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)，使得本DNA單鏈分離裝置通用性極強(qiáng)，適用面極廣，因此其應(yīng)用前景十分廣闊。

(2)本發(fā)明采用一結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的加樣針即可實(shí)現(xiàn)dNTP試劑的微量給樣，摒棄了傳動(dòng)的中空針管抽噴式的給樣方式，僅通過(guò)所述加樣針的加樣針與液體間的吸附力及其在不同液體中的移動(dòng)速度差異的控制即可實(shí)現(xiàn)微量取樣加樣，且僅通過(guò)加樣針在測(cè)序反應(yīng)液內(nèi)上下運(yùn)動(dòng)數(shù)次即可實(shí)現(xiàn)攪拌使得酶反應(yīng)更為完全結(jié)果準(zhǔn)確，本加樣方法及其裝置適用于任何檢測(cè)裝置中，拆卸簡(jiǎn)便，清洗簡(jiǎn)單便捷，且不會(huì)發(fā)生堵針等多種現(xiàn)有技術(shù)中的加樣裝置的不足，加樣重復(fù)精度大于95％，且最小加樣量可達(dá)0.1μL，加樣均一性好，測(cè)序時(shí)間大為縮短且結(jié)果準(zhǔn)確性極高；此外可通過(guò)所聯(lián)用的檢測(cè)裝置對(duì)樣品核酸序列進(jìn)行定性定量檢測(cè)；因此其應(yīng)用前景十分廣闊。

(3)本發(fā)明的基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序裝置，采用機(jī)械手操控整個(gè)過(guò)程，無(wú)感染，準(zhǔn)確率高，提高了了效率和精度。

總之，本發(fā)明提供的基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序裝置及系統(tǒng)減少了底物及酶系的用量，檢測(cè)準(zhǔn)確，反應(yīng)速度快，集成化高，且可以同時(shí)檢測(cè)一至多個(gè)SNP位點(diǎn)以及單鏈DNA片段，酶系及底物均打破了部分生產(chǎn)商的壟斷，價(jià)格大大下降，分析裝置結(jié)構(gòu)精密，對(duì)待測(cè)DNA片段及底物的用量要求低，降低了焦磷酸測(cè)序的檢測(cè)成本，擴(kuò)大了焦磷酸測(cè)序的使用范圍。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是本發(fā)明控制區(qū)的控制示意圖。

圖3是本發(fā)明提供的用于焦磷酸的DNA分離區(qū)的一使用優(yōu)選實(shí)施例。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中過(guò)濾柱的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例2中過(guò)濾柱的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例3中過(guò)濾柱的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例4中過(guò)濾柱的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖8為本發(fā)明提供的用于焦磷酸測(cè)序系統(tǒng)的加樣裝置結(jié)構(gòu)中的加樣針示意圖。

圖9為實(shí)施例中采用本發(fā)明提供的用于焦磷酸測(cè)序系統(tǒng)的加樣裝置測(cè)得的序列譜圖。

圖中標(biāo)號(hào)說(shuō)明：

1、輸送管道；2、分離盤；21、過(guò)濾柱；211、分離通道；22、濾膜；23、收集管；231、上蓋；232、連接帶；3、樣品槽；31、槽位；4、加樣針架；41、加樣針；42、轉(zhuǎn)軸；5、生物發(fā)光檢測(cè)裝置；51、固定殼；6、分析臺(tái)；61、安裝架；62、滑軌；7、試劑槽；71、干燥槽；72、清洗槽；73、底物供給部；74、反應(yīng)位。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說(shuō)明。

實(shí)施例1

圖1至圖3示出了本發(fā)明基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序系統(tǒng)的第一種實(shí)施方式。本發(fā)明基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序裝置，可用于焦磷酸測(cè)序檢測(cè)分析DNA序列，待測(cè)序的DNA序列為靶序列，將靶DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

本實(shí)施例的基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序系統(tǒng)包括DNA測(cè)序裝置和控制區(qū)，DNA測(cè)序裝置包括樣品區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)。樣品區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)安裝在分析臺(tái)6上，樣品區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)通過(guò)控制區(qū)監(jiān)測(cè)、控制。整個(gè)分析過(guò)程采用機(jī)械手操作。

進(jìn)行焦磷酸測(cè)序之前，需要先對(duì)帶測(cè)序的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，以達(dá)到擴(kuò)增要求的DNA濃度。擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)時(shí)，擴(kuò)增引物上帶有親和連接體，親和連接體優(yōu)選為生物素，親和連接體優(yōu)選地標(biāo)記在靶DNA的一端引物上，PCR擴(kuò)增采用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行即可。

樣品區(qū)包括分離盤2。分離盤2位于反應(yīng)區(qū)的上方，在靶DNA擴(kuò)增后，靶DNA為雙鏈DNA，焦磷酸測(cè)序需要單鏈DNA，分離盤2包括至少一個(gè)DNA分離區(qū)，DNA分離區(qū)采用物理過(guò)濾的方式，分離區(qū)包括內(nèi)部設(shè)有濾膜22的中空的過(guò)濾柱211，濾膜22為高分子納米微球結(jié)構(gòu)，由于高分子納米微球間的孔徑小于親和連接體的直徑，將帶有親和連接體標(biāo)記的DNA單鏈留在膜上，根據(jù)測(cè)序需要收集帶標(biāo)記的DNA單鏈或其互補(bǔ)鏈，用于焦磷酸測(cè)序。

本實(shí)施例中，分離盤2設(shè)有多個(gè)收集管23，過(guò)濾柱21安裝于收集管23中，濾膜22位于過(guò)濾柱21的一端的端部。過(guò)濾柱21下段的外徑與收集管23的內(nèi)徑相同。

雙鏈DNA在堿解后將待親和連接體的一條鏈留在濾膜22上，收集該條鏈只需在過(guò)濾柱21內(nèi)加入收集液后收集；如需收集互補(bǔ)鏈，可將濾液收集后對(duì)濾液中的互補(bǔ)鏈進(jìn)行收集。

如圖3所示，收集管23用于收集離心時(shí)產(chǎn)生的廢液，每個(gè)步驟后需要及時(shí)傾倒以防止交叉污染，收集管23的上端管身為圓柱體、下端為圓錐體，底部為球面狀。作為另一種優(yōu)選的實(shí)施方式，收集管23配置上蓋231，上蓋231通過(guò)連接帶232可拆卸地連接在收集管23上，由于連接帶232的連接，裝入過(guò)濾柱21后上蓋231也可緊密扣合在過(guò)濾柱21或收集管23上，上蓋231的作用是在液體離心時(shí)防止液體飛濺出過(guò)濾柱21造成損失及污染。

本實(shí)施例中所優(yōu)選的濾膜22材料為聚乙烯微球，其微球間孔隙優(yōu)選為10μm，小于親和連接體的直徑，可直接通過(guò)物理過(guò)濾將帶有親和連接體的單鏈留在膜上，濾去未連接親和連接體的一條鏈，其吸附洗脫效果好，DNA回收率高，原料價(jià)格低廉環(huán)保。

如圖4所示，為了本實(shí)施例中的濾膜22在吹打或離心過(guò)程中不發(fā)生移動(dòng)，本實(shí)施例中還優(yōu)選的在濾膜22上方設(shè)有壓膜裝置，壓膜裝置包括墊片和/或壓膜架。待分離純化的液體先通過(guò)墊片后與濾膜22接觸，墊片優(yōu)選為纖維材料，可耐受酸堿和大部分有機(jī)溶劑，對(duì)大部分的生物分子不會(huì)產(chǎn)生吸附。

優(yōu)選地在墊片的上方，不與濾膜22接觸的一側(cè)，還設(shè)有壓膜架，壓膜架與過(guò)濾柱21體材料相同，通過(guò)機(jī)械壓力壓緊濾膜22，使濾膜22不會(huì)在吹打或離心等使用過(guò)程中發(fā)生移動(dòng)，造成收集損失。

反應(yīng)區(qū)包括加樣部和樣品槽3，加樣部依次包括dNTP試劑槽7、干燥槽71、清洗槽72、加樣針架4和安裝于加樣針架4上的多個(gè)加樣針411。分離盤2位于試劑槽7的側(cè)上方。加樣針架4為圓盤形，加樣針架4通過(guò)移動(dòng)部可沿試劑槽7和樣品槽3之間做往復(fù)運(yùn)動(dòng)。移動(dòng)部包括通過(guò)安裝架61固定在分析臺(tái)6上方的滑軌62以及加樣針架4底端的滑塊。干燥槽71為真空干燥區(qū)。

試劑槽7設(shè)有四個(gè)反應(yīng)位74，試劑槽7的側(cè)下方設(shè)有底物供給部73，底物供給部73通過(guò)輸送管道1向反應(yīng)位74輸送dNTP的不同核酸底物。待測(cè)反應(yīng)位74用于盛放待測(cè)序的DNA序列，底物供給部提供dNTP，與靶DNA雜交反應(yīng)，為雜交反應(yīng)提供環(huán)境基礎(chǔ)。用于焦磷酸測(cè)序的dNTP包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種核酸底物，底物用于與靶DNA雜交，并且需要在反應(yīng)體系中加入相關(guān)酶系催化反應(yīng)進(jìn)行，具體為DNA聚合酶，進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)，在互補(bǔ)鏈合成時(shí)得到的副產(chǎn)物焦磷酸轉(zhuǎn)化成ATP，在螢光素酶存在下使ATP和螢光素反應(yīng)，進(jìn)行發(fā)光。如果發(fā)生互補(bǔ)鏈合成，則產(chǎn)生焦磷酸，結(jié)果發(fā)光，因此通過(guò)對(duì)其進(jìn)行監(jiān)視，可以得知產(chǎn)生互補(bǔ)鏈合成，即組入的堿基種類，由此確定DNA序列。

加樣針架4通過(guò)轉(zhuǎn)軸43做旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，轉(zhuǎn)軸43設(shè)有驅(qū)動(dòng)電機(jī)。加樣針411為實(shí)心針，用于轉(zhuǎn)移dNTP試劑，加樣針411固定于加樣針架4的通孔中。將DNA單鏈按照反應(yīng)體系的需要量轉(zhuǎn)移至反應(yīng)位74中，加入酶系后依次加入dNTP，加入順序不限，對(duì)于每個(gè)位點(diǎn)，四種底物各加入一次，底物由底物供給部73提供。

檢測(cè)區(qū)包括生物發(fā)光檢測(cè)裝置5，槽位31與生物發(fā)光檢測(cè)裝置5連接。反應(yīng)后如合成互補(bǔ)鏈，則發(fā)光，生物發(fā)光檢測(cè)裝置5用于檢測(cè)判斷該位點(diǎn)是否進(jìn)行反應(yīng)并發(fā)光，進(jìn)而判斷出該位點(diǎn)的堿基序列。

加樣針架4位于樣品槽3上；樣品槽3上設(shè)有多個(gè)槽位31，槽位31中有測(cè)序反應(yīng)液。槽位31沿樣品槽3的圓心呈一系列同心圓均勻排列，槽位31由透明材質(zhì)構(gòu)成，槽位31延伸入生物發(fā)光檢測(cè)裝置5。生物發(fā)光檢測(cè)裝置5包括固定殼51和相機(jī)，相機(jī)可旋轉(zhuǎn)的位于固定殼51中，相機(jī)位于所有槽位31湊成的中軸線上。相機(jī)為市售iKon-M深度制冷影像CCD相機(jī)，且連接電腦并呈現(xiàn)檢測(cè)的譜圖。

如圖8所示，加樣針41的端面為半圓體；采用上述的加樣裝置檢測(cè)已知序列的樣品(序列為CAATATTCGCCAGGT)，其中加樣針41直徑為1.5mm，表面光潔度為Ra 0.8；加樣方法包括：步驟a，通過(guò)加樣針41插入樣品槽3的dNTP試劑使得加樣針41外周附著所述dNTP試劑；步驟b，將附著所述dNTP試劑的加樣針41插入槽位31中，再使加樣針41離開測(cè)序反應(yīng)液；所述步驟a中所述加樣針41離開所述dNTP試劑液時(shí)的移動(dòng)速度為10cm/s，所述步驟b中所述加樣針41離開所述測(cè)序反應(yīng)液時(shí)的移動(dòng)速度為1cm/s，在測(cè)序反應(yīng)液內(nèi)上下運(yùn)動(dòng)8次后離開測(cè)序反應(yīng)液。

圖9為本實(shí)施例的用焦磷酸核酸測(cè)序檢測(cè)裝置所得的測(cè)序譜圖，由圖9可知，其中依次加入dNTP的順序TCATATTCGCCAGT，其中首次加入T時(shí)未出峰，以及后續(xù)與實(shí)際序列不符的dNTP試劑液也未出峰(圖9中用圓圈標(biāo)出，即T、T、C)，其測(cè)得的序列為CAATATTCGCCAGGT，與樣品實(shí)際序列完全一致，精確度為100％，檢測(cè)單個(gè)堿基的時(shí)間小于1.5分鐘，此序列大約耗時(shí)25分鐘，且最小加樣量可達(dá)0.1μL。

本發(fā)明的基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序系統(tǒng)的設(shè)置方式可以更好地傳遞底物與DNA，減少傳遞過(guò)程中的損耗。

反應(yīng)區(qū)的形狀不限，分析裝置內(nèi)的具體結(jié)構(gòu)可以根據(jù)檢測(cè)的需要進(jìn)行設(shè)計(jì)調(diào)整，任何可能實(shí)現(xiàn)焦磷酸測(cè)序的結(jié)構(gòu)形狀及相對(duì)位置均應(yīng)認(rèn)為落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

底物加樣至反應(yīng)區(qū)中，此時(shí)反應(yīng)區(qū)中已加入待測(cè)DNA單鏈及其他所需反應(yīng)體系內(nèi)試劑，以檢測(cè)所需5ul的量計(jì)算，反應(yīng)體系如下：

酶混合物包括：

底物混合物包括：

APS 0.4mg/L；

螢火蟲熒光素 0.4mmol/L。

反應(yīng)過(guò)程中，在每一步選擇對(duì)酶活性而言最適宜的pH值進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后需要對(duì)反應(yīng)體系內(nèi)的pH值進(jìn)行調(diào)整以適應(yīng)其他反應(yīng)，具體反應(yīng)體系中的反應(yīng)條件本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)得出。例如，當(dāng)洗滌步驟中包含腺苷三磷酸雙磷酸酶以去除過(guò)量核苷酸種類和ATP時(shí)，因?yàn)樘幚聿襟E的連續(xù)性，緩沖液可與腺苷三磷酸雙磷酸酶一起使用，其pH能使腺苷三磷酸雙磷酸酶潔性水平最佳化。然后，在下一個(gè)核苷酸摻入步驟中使用聚合酶，可使用具有對(duì)聚合酶而言的最佳PH條件的不同緩沖液，以便使聚合酶潔性最佳化。另外，每種最佳緩沖液可包括對(duì)于每種酶而言的優(yōu)選抗衡離子，例如對(duì)于腺苷三磷酸雙磷酸酶緩沖液而言的Ca²⁺和對(duì)于聚合酶緩沖液而言的Mg²⁺。

如圖9所示，反應(yīng)體系中，檢測(cè)序列為CAATATTCGCCAGGT，其中依次加入dNTP的順序?yàn)門CATATTCGCCAGT，其中首次加入T時(shí)未出峰，以及后續(xù)與實(shí)際序列不符的dNTP試劑也未出峰，其測(cè)得的序列為CAATATTCGCCAGGT，與樣品實(shí)際序列完全一致，精確度為100％；檢測(cè)單個(gè)堿基的時(shí)間小于1.5分鐘，此序列大約耗時(shí)25分鐘，且最小加樣量可達(dá)0.1μL。

測(cè)序結(jié)果通過(guò)生物發(fā)光來(lái)進(jìn)行判斷，其他可以檢測(cè)生物發(fā)光的裝置均可使用為檢測(cè)裝置，在此不做限制。

本發(fā)明所述實(shí)施例中的基于焦磷酸測(cè)序的基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序裝置，還包括各樣品存儲(chǔ)裝置之間的液體供給及排出通道，液體供給通道用于輸送待反應(yīng)的試劑及樣品，液體排出通道用于將反應(yīng)結(jié)束后或者經(jīng)過(guò)離心后的液體排出至收集部件。

控制區(qū)包括微型計(jì)算機(jī)、光控制系統(tǒng)、位置控制系統(tǒng)、環(huán)境控制系統(tǒng)、活性檢測(cè)系統(tǒng)和驅(qū)動(dòng)控制系統(tǒng)。環(huán)境控制系統(tǒng)包括對(duì)溶液濃度和PH值的控制。

本發(fā)明的分析裝置中在反應(yīng)中，需要保證各部操作均在最適宜的環(huán)境下進(jìn)行，酶系需要在活性最高的反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，以保證反應(yīng)完全，因此控制區(qū)中設(shè)有可以保證這些反應(yīng)能夠高效有序進(jìn)行的若干組件，包括離心機(jī)、pH計(jì)、加溫組件、控制信號(hào)傳遞組件等測(cè)序設(shè)備的常備結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明所述實(shí)施方案的系統(tǒng)和方法可包括使用計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)進(jìn)行一些設(shè)計(jì)、分析或其它操作，這樣的介質(zhì)存儲(chǔ)有用于在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上執(zhí)行的指令。例如，處理所檢測(cè)信號(hào)和/或分析用測(cè)序結(jié)果系統(tǒng)和方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的一些實(shí)施方案，其中處理和分析實(shí)施方案是在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上執(zhí)行的。

用于本發(fā)明的控制區(qū)的一個(gè)示例性實(shí)施方案可包括任何類型的計(jì)算機(jī)平臺(tái)，例如工作站、個(gè)人計(jì)算機(jī)、服務(wù)器或任何其它現(xiàn)有或未來(lái)的計(jì)算機(jī)。計(jì)算機(jī)通常包括己知部件，例如處理器、操作系統(tǒng)、系統(tǒng)存儲(chǔ)器、記憶存儲(chǔ)裝置(memory storage device)、輸入輸出控制器、輸入一輸出裝置和顯示器。相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解，有許多可能的計(jì)算機(jī)配置和部件，并且還可包括高速存儲(chǔ)器、數(shù)據(jù)各份單元和許多其它裝置。

顯示器可包括提供可視信息的顯示器，這樣的信息通常邏輯地和/或物理地組織成為像素陣列。也可包括界面控制器，其中可包括任何不同的己知或未來(lái)的軟件程序，用于提供輸入和輸出界面。例如，界面可包括所謂的"圖形用戶界面(Graphical User Interfaces，通常稱為GU I)"，其可為用戶提供一種或多種圖像顯示。使用相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員己知的選擇或輸入方式，界面通常能夠接受用戶輸入。

在相同或替代實(shí)施方案中，在計(jì)算機(jī)上的應(yīng)用可使用包括所謂“命令行界面”(通常稱為CLI)在內(nèi)的界面。CLI通常提供基于應(yīng)用與用戶間相互作用的文本。通常，命令行界面通過(guò)顯示器以文本行形式顯示輸出并接收輸入。例如，某些執(zhí)行過(guò)程可包括所謂的"命令行解釋程序(shell)"例如相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員己知的Unix命令行解釋程序(Unix Shell)，或使用面向?qū)ο笮统绦蝮w系結(jié)構(gòu)的Microsoft Windows Powershell，例如Microsoft.NET框架。

相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)知道，界面可包括一種或多種GUI、CLI或其組合。

處理器通常執(zhí)行操作系統(tǒng)，操作系統(tǒng)可選擇現(xiàn)有技術(shù)中的任何操作系統(tǒng)，只要本領(lǐng)域技術(shù)人員可用于處理檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)等工作均認(rèn)為可以納入保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明中的基于焦磷酸測(cè)序的基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序系統(tǒng)可以廣泛地用于DNA序列的確定、診斷、檢查，SNP位點(diǎn)的確定、診斷等，可實(shí)現(xiàn)一定樣本的同時(shí)測(cè)序，原理對(duì)測(cè)序的條件要求低，不需要額外增加激發(fā)光源及熒光劑等昂貴的實(shí)驗(yàn)試劑，可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便廉價(jià)的DNA測(cè)序工作，并且檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，準(zhǔn)確率高，克服了以往設(shè)備不能充分進(jìn)行或者互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)先過(guò)度進(jìn)行的弊端，反應(yīng)體積小，可以在更短的時(shí)間內(nèi)完成反應(yīng)階段的工作。

采用本發(fā)明提供的基于焦磷酸測(cè)序的DNA測(cè)序裝置及系統(tǒng)的分析方法，包括以下步驟，其中未公開部分可參照現(xiàn)有技術(shù)：

(1)結(jié)合：將經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后的DNA片段與瓊脂糖珠結(jié)合，DNA片段的長(zhǎng)度為10～20kb，DNA最小上樣量應(yīng)不小于500ng，瓊脂糖珠直徑為30μm，表面覆有生物素及鏈霉親和素，擴(kuò)增后的DNA片段與鏈霉親和素包被的瓊脂糖珠自發(fā)地特異性結(jié)合；

(2)離心：吸取結(jié)合后的DNA雙鏈至過(guò)濾柱21中，過(guò)濾柱21預(yù)先裝入收集管23中，放入離心機(jī)后以12000rmp離心1min，去除多余溶劑；其中收集管23為1.5mL離心管；過(guò)濾柱21為上端開口、下端半封閉的圓柱體，過(guò)濾柱21上端開口外緣設(shè)有凸臺(tái)，以固定在收集管23上，過(guò)濾柱21下端內(nèi)置有過(guò)濾膜22，過(guò)濾柱21直徑為4.5mm，濾膜22直徑為4.7mm，通過(guò)將濾膜22強(qiáng)行壓入過(guò)濾柱21中使之緊密貼合不留縫隙；

(3)洗滌：在加入適量70～80％的乙醇，洗去殘留的Taq酶等擴(kuò)增試劑，輕輕吹打混勻后12000rmp離心1min；

(4)堿解：加入0.4M NaOH與1M NaCl解開雙鏈螺旋，輕輕吹打混勻后12000rmp離心1min；

(5)調(diào)pH值：加入適量洗脫buffer或超純水清洗，洗去殘留的NaOH，平衡pH值至中性，輕輕吹打混勻后12000rmp離心1min；

(6)收集：加入收集液如超純水等，加入后輕輕吹打至DNA單鏈完全懸浮，吸出后用于焦磷酸測(cè)序或4℃密封保存。

(7)加樣：通過(guò)加樣針41蘸取任一一種dNTP試劑使得所述加樣針41外周附著所述dNTP試劑；

(8)反應(yīng)：將附著所述dNTP試劑的加樣針41插入測(cè)序反應(yīng)液中，再使所述加樣針41離開所述測(cè)序反應(yīng)液；

(9)結(jié)論：生物發(fā)光檢測(cè)裝置5連接一電腦，拍照并呈現(xiàn)檢測(cè)的譜圖。

其中，為實(shí)現(xiàn)完成測(cè)序，優(yōu)選為將4種dNTP試劑任一或多個(gè)依待測(cè)序列而定以何種順序加入測(cè)序反應(yīng)液中，例如：僅檢測(cè)單個(gè)堿基是否變異時(shí)，可根據(jù)已知的前后序列先確定待測(cè)堿基位置后，依次重復(fù)上述步驟4次加樣(加入4種dNTP試劑)，分別加入同一測(cè)序反應(yīng)液中檢測(cè)該堿基。

由于親和連接體的直徑大于DNA單鏈分離裝置的濾膜22直徑，因此在DNA單鏈通過(guò)濾膜22時(shí)，未結(jié)合親和連接體的DNA單鏈及其他雜質(zhì)可以通過(guò)濾膜22，而結(jié)合親和連接體的單鏈被留在了膜上而無(wú)法通過(guò)，這種過(guò)濾是物理性的。

本實(shí)施例中的DNA分離過(guò)程中所涉及的溶液、參數(shù)及其他分離條件，均為本實(shí)施例中的優(yōu)選實(shí)施方案，任何參照現(xiàn)有技術(shù)可以起到相應(yīng)作用的實(shí)驗(yàn)條件、參數(shù)及溶液均可用于本發(fā)明中所涉及的分離純化過(guò)程，本實(shí)施例中的具體參數(shù)及溶液選擇不應(yīng)作為對(duì)本發(fā)明的限制。

本實(shí)施例所得測(cè)序譜圖及其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)(測(cè)序時(shí)間、加樣重復(fù)精度、均一性)與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)為理論誤差范圍內(nèi)的一致性，其加樣重復(fù)精度為96％。

實(shí)施例2

由于收集在濾膜22上的一條鏈需要將其吸出或倒出，這樣的收集方式可能造成一定的收集損失，因此發(fā)明人優(yōu)選地將過(guò)濾柱21設(shè)置為兩頭調(diào)換使用的雙頭結(jié)構(gòu)，濾膜22設(shè)于過(guò)濾柱21的非端面，需要收集時(shí)，將過(guò)濾柱21兩頭進(jìn)行調(diào)換后采用常規(guī)方式，如離心等，可將濾膜22上的全部DNA單鏈洗脫下來(lái)，減少樣品損失。

如圖5所示，本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于，實(shí)施例2中的過(guò)濾柱21為上下對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中空狀圓柱體，濾膜22垂直位于中空柱體中部，該過(guò)濾柱21可兩端調(diào)換使用，中空柱體的內(nèi)徑為4.5mm，濾膜22直徑為4.7mm，通過(guò)將濾膜22強(qiáng)行壓入過(guò)濾柱21中使之緊密貼合不留縫隙，柱體內(nèi)加設(shè)濾膜22限位壓膜機(jī)構(gòu)(圖中未示出)，以固定濾膜22無(wú)法進(jìn)行位移。由于該DNA單鏈分離裝置無(wú)論是在結(jié)構(gòu)上還是在功能上兩端均相同，故該DNA單鏈分離裝置無(wú)需區(qū)分進(jìn)液端與出液端，在使用時(shí)兩端可任意擇一使用。

在經(jīng)過(guò)步驟(4)洗去多余的NaOH之后，調(diào)換過(guò)濾柱21的兩端，加入收集液，靜止1mins以上，無(wú)需吹打即可進(jìn)行洗脫步驟，洗脫時(shí)離心機(jī)轉(zhuǎn)速不超過(guò)10000rpm，至少離心2min。收集后可通過(guò)nanodrop檢測(cè)DNA濃度，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

本實(shí)施例所得測(cè)序譜圖及其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)(測(cè)序時(shí)間、加樣重復(fù)精度、均一性)與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)為理論誤差范圍內(nèi)的一致性，其加樣重復(fù)精度為95％。

實(shí)施例3

如圖6所示，本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于，實(shí)施例3中DNA單鏈分離裝置的過(guò)濾柱21采用空間圓臺(tái)型結(jié)構(gòu)，濾膜22設(shè)置在兩圓臺(tái)型過(guò)濾柱21的公共頂面處，圓臺(tái)型過(guò)濾柱21的頂面直徑與濾膜22的直徑一致，濾膜22兩側(cè)設(shè)有壓膜機(jī)構(gòu)(圖中未示出)，以固定濾膜22無(wú)法進(jìn)行位移。圓臺(tái)形過(guò)濾柱的開口下端的側(cè)壁上設(shè)有凸臺(tái)，保證在兩端對(duì)調(diào)時(shí)可固定在收集管23的凸臺(tái)上。

使用本實(shí)施例中所屬的分離裝置的分離方法與實(shí)施例1中所述的步驟相同，與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：在經(jīng)過(guò)步驟(4)洗去多余的NaOH之后，調(diào)換過(guò)濾柱21的兩端，加入收集液，靜止1mins以上，無(wú)需吹打即可進(jìn)行洗脫步驟，洗脫時(shí)離心機(jī)轉(zhuǎn)速不超過(guò)10000rpm，至少離心2min。收集后可通過(guò)nanodrop檢測(cè)DNA濃度，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

本實(shí)施例所得測(cè)序譜圖及其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)(測(cè)序時(shí)間、加樣重復(fù)精度、均一性)與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)為理論誤差范圍內(nèi)的一致性，其加樣重復(fù)精度為95％。

實(shí)施例4

如圖7所示，本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于，為了更好的聚集與引導(dǎo)反應(yīng)液，使反應(yīng)液分離更充分更完全，規(guī)避過(guò)濾死角，該實(shí)施例在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上增設(shè)了一分離通道211，所述分離通道211設(shè)置在兩過(guò)濾柱21之間并與二者連通，兩個(gè)過(guò)濾柱21與分離通道211共中心軸線，濾膜22設(shè)置在分離通道211的對(duì)稱面上，濾膜22兩側(cè)設(shè)有壓膜機(jī)構(gòu)(圖中未示出)，以固定濾膜22無(wú)法進(jìn)行位移，兩個(gè)過(guò)濾柱21的中部設(shè)有凸臺(tái)，保證兩端對(duì)調(diào)時(shí)可以固定在收集管23的凸臺(tái)上。

過(guò)濾柱21與分離通道211相連接的一端為倒圓臺(tái)狀，二者共同構(gòu)成一漏斗狀空間結(jié)構(gòu)，倒圓臺(tái)端的底面直徑與過(guò)濾柱21內(nèi)徑一致，頂面直徑與分離通道211的直徑一致，該種結(jié)構(gòu)的設(shè)置有利于反應(yīng)液的聚集與引導(dǎo)，使得反應(yīng)液分離更充分更完全。因此，該實(shí)施例中的DNA單鏈分離裝置在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上使得DNA單鏈過(guò)濾分離更徹底，分離效率顯著提高。

使用本實(shí)施例中所屬的分離裝置的分離方法與實(shí)施例1中所述的步驟相同，與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：在經(jīng)過(guò)步驟(4)洗去多余的NaOH之后，調(diào)換過(guò)濾柱21的兩端，加入收集液，靜止1mins以上，無(wú)需吹打即可進(jìn)行洗脫步驟，洗脫時(shí)離心機(jī)轉(zhuǎn)速不超過(guò)10000rpm，至少離心2min。收集后可通過(guò)nanodrop檢測(cè)DNA濃度，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

本實(shí)施例所得測(cè)序譜圖及其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)(測(cè)序時(shí)間、加樣重復(fù)精度、均一性)與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)為理論誤差范圍內(nèi)的一致性，其加樣重復(fù)精度為95％。

實(shí)施例5

本實(shí)施例與實(shí)施例4的區(qū)別僅在于，濾膜22可垂直于分離通道211置于其中任一位置，兩個(gè)過(guò)濾柱21為中空的不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，濾膜22的直徑略大于分離通道211，濾膜22兩側(cè)設(shè)有壓膜機(jī)構(gòu)(圖中未示出)，以固定濾膜22無(wú)法進(jìn)行位移。

引物設(shè)計(jì)時(shí)，也可選擇生物素-親和素結(jié)合的親和連接體標(biāo)記，任何可以進(jìn)行DNA標(biāo)記的連接體均可用于固定在膜上，在此不做贅述。

如使用帶有親和素的親和連接體，則DNA單鏈分離的膜系也可以選擇帶有親和吸附的膜系，用于分離DNA單鏈。具有親和吸附作用的膜系包括硅膜基質(zhì)膜、磁性顆粒膜、陰離子交換材料膜、硝酸纖維素膜或聚酰胺膜，以及經(jīng)修飾、包被的磁珠和/或二氧化硅膜等，在此不做限制。

本發(fā)明中的雙鏈DNA分離也可采用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)收集方式，例如DNA單鏈分離試劑盒等，只要可以起到DNA單鏈分離收集的結(jié)構(gòu)及方法均應(yīng)納入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，在此不做贅述。

本實(shí)施例所得測(cè)序譜圖及其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)(測(cè)序時(shí)間、加樣重復(fù)精度、均一性)與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)為理論誤差范圍內(nèi)的一致性，其加樣重復(fù)精度為95％。

實(shí)施例6

本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：所述加樣針41的端面為平面，直徑為1.5mm，表面光潔度為Ra 3.2，且加樣方法中所述步驟a中所述加樣針41離開所述dNTP試劑液時(shí)的移動(dòng)速度為50cm/s，所述步驟b中所述加樣針41離開所述測(cè)序反應(yīng)液時(shí)的移動(dòng)速度為0.4cm/s，在測(cè)序反應(yīng)液內(nèi)上下運(yùn)動(dòng)5次后離開測(cè)序反應(yīng)液。

本實(shí)施例所得測(cè)序譜圖及其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)(測(cè)序時(shí)間、加樣重復(fù)精度、均一性)與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)為理論誤差范圍內(nèi)的一致性，其加樣重復(fù)精度為96％。

實(shí)施例7

本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：所述加樣針41的端面為圓錐體，直徑為1.6mm，錐度60度，表面光潔度為Ra 9.8，且加樣方法中所述步驟a中所述加樣針41離開所述dNTP試劑液時(shí)的移動(dòng)速度為5cm/s，所述步驟b中所述加樣針41離開所述測(cè)序反應(yīng)液時(shí)的移動(dòng)速度為4.5cm/s，在測(cè)序反應(yīng)液內(nèi)上下運(yùn)動(dòng)12次后離開測(cè)序反應(yīng)液。

本實(shí)施例所得測(cè)序譜圖及其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)(測(cè)序時(shí)間、加樣重復(fù)精度、均一性)與實(shí)施例1所得數(shù)據(jù)為理論誤差范圍內(nèi)的一致性，其加樣重復(fù)精度為95％。

最后有必要在此說(shuō)明的是：以上實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。最后有必要在此說(shuō)明的是：以上實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。