本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域，具體涉及一種中華大蟾蜍溶菌酶。

背景技術(shù)：

抗生素濫用在當今世界引發(fā)的生態(tài)環(huán)境災難以及它們導致的對人類健康的影響已經(jīng)越來越引發(fā)世界的關(guān)注。尋找活性更好和特異性更高的抗生素替代品成為當務(wù)之急的事情，因此，具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)-抗菌肽(amp)成為新的研究熱點，其中，以maganin為代表的兩棲動物源amp尤其引人矚目。兩棲類動物皮膚分泌物的研究多集中在多肽類物質(zhì)的鑒定和功能上。如非洲爪蟾xenopyslaevis的抗菌多肽magainin及中國大蹼鈴蟾bombinamaxima的抗菌多肽maximin在極低濃度就對腫瘤細胞顯示殺傷作用，并且它們可選擇性地作用于腫瘤細胞而對機體正常組織細胞無影響。此外還有更多的兩棲類皮膚分泌多肽在很低濃度水平就顯示強大而廣譜的抗菌活性，如中國大蹼鈴蟾的抗菌肽maximin3在1.5μg/ml的含量水平時就可以完全抑制大腸桿菌、巨大芽孢桿菌bacillusmagaterium以及痢疾桿菌shigelladysenteriae的生長。也有一些肽類對肌體具有一定的副作用，如中國大蹼鈴蟾的maximinh抗菌肽、日本沼蛙的brevinin-1抗菌肽以及東方鈴蟾bombintororientalis的bombininh抗菌肽均具有很強的溶血活性。因此，兩棲類動物的皮膚分泌多肽是一類多樣性極為豐富且功能非常顯著的活性物質(zhì)，極具研究價值和廣闊的應(yīng)用前景。

中華大蟾蜍皮膚分泌物經(jīng)干制后稱為蟾酥，是我國傳統(tǒng)中藥，在我國歷史上長期用于強心、麻醉、抗菌消炎、止咳等用途，進而發(fā)現(xiàn)蟾酥具有抑制腫瘤的功效?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)蟾酥中含有的強心甾體化合物和吲哚生物堿類化合物對腫瘤細胞具有較強的細胞毒性和抑制活性，并陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了蟾毒靈、華蟾毒精等具有抗腫瘤活性的單體化合物。近期，來源自中華大蟾蜍的cathelicidin-bg被報道具有抗革蘭氏陽性細菌活性，這是首次報道來源中華大蟾蜍的活性抗菌多肽。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種中華大蟾蜍溶菌酶，該溶菌酶重組表達產(chǎn)物對兩種革蘭氏陽性細菌、兩種革蘭氏陰性細菌和兩種真菌生長的抑制。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種中華大蟾蜍溶菌酶，其具有seqidno：1所示的核苷酸序列。

該溶菌酶重組表達產(chǎn)物對兩種革蘭氏陽性細菌、兩種革蘭氏陰性細菌和兩種真菌生長具有抑制作用。

其中，所述溶菌酶重組表達產(chǎn)物通過以下步驟合成：

s1、用trlzol試劑法提取中華大蟾蜍的腺體組織的總rna，用revertraaceqpcrrtkit(toyobo，japan)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總rna反轉(zhuǎn)錄為cdna；

s2、用添加酶切位點的引物

5’-ccggaattcaagtatgaaaaatgcgaacttgcta-3’和

5’-cccttcgaattaaagtttgcatccttgagtcca-3’為引物；

以以上步驟合成的cdna為模板擴增中華大蟾蜍溶菌酶功能域編碼序列片段；

s3、將克隆片段用dna純化試劑盒進行純化，純化后的dna片段與pet-28空質(zhì)粒均用ecori和hindiii進行雙酶切，反應(yīng)條件是37℃放置8h；反應(yīng)結(jié)束后將酶切產(chǎn)物再次用dna純化試劑盒進行純化，并將純化后的dna片段和pet-28空質(zhì)粒的片段用t4dna連接酶進行連接。

本發(fā)明具有以下有益效果：

該溶菌酶重組表達產(chǎn)物對兩種革蘭氏陽性細菌、兩種革蘭氏陰性細菌和兩種真菌生長具有抑制作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中溶菌酶的抑菌實驗結(jié)果。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

以下實施例中，所使用的中華大蟾蜍(100-130g)采集自杭州市臨安，將耳后皮膚腺用75％的乙醇進行表面消毒，然后解剖其中的腺體組織。

實施例

用trlzol試劑法提取中華大蟾蜍的腺體組織的總rna，用revertraaceqpcrrtkit(toyobo，japan)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總rna反轉(zhuǎn)錄為cdna；

用添加酶切位點的引物

5’-ccggaattcaagtatgaaaaatgcgaacttgcta-3’和

5’-cccttcgaattaaagtttgcatccttgagtcca-3’為引物，

以以上步驟合成的cdna為模板擴增中華大蟾蜍溶菌酶功能域編碼序列片段。

將克隆片段用dna純化試劑盒進行純化，純化后的dna片段與pet-28空質(zhì)粒均用ecori和hindiii進行雙酶切，反應(yīng)條件是37℃放置8h。反應(yīng)結(jié)束后將酶切產(chǎn)物再次用dna純化試劑盒進行純化，并將純化后的dna片段和pet-28空質(zhì)粒的片段用t4dna連接酶進行連接。

連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)，鋪板于加入硫酸卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基平板，37℃放置12h后，隨機挑取單菌斑，用pcr檢測有插入片段的陽性克隆菌斑。

將含有重組質(zhì)粒的bl21(de3)菌液調(diào)整濃度為od630＝0.2，并加入終濃度為1mm的iptg，置搖床上28℃、210rpm搖菌及誘導溶菌酶表達8h。

將誘導表達后的菌液8000rpm離心5min，棄上清，沉淀用pbs緩沖液重懸浮，并用反復凍融同時超聲裂解的方法裂解細菌細胞，將裂解后的上清液用鎳元素親和柱進行處理以純化其中含有六聚his融合標簽蛋白的融合蛋白。

活性檢測

銅綠假單胞桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌和酵母菌等微生物菌株均購自atcc，四種細菌均用lb培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩種真菌均用改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)。

微生物菌液調(diào)整濃度為od630至0.1-0.2之間，按照每孔100微升的量加入到96孔酶標板，加入濃度分別為0、0.1、1、10、100μg/ml的多肽，37℃培養(yǎng)24h后用酶標儀測定od630的值。

結(jié)果與分析

1溶菌酶成熟肽序列分析

成熟肽編碼核苷酸序列為

aagtatgaaaaatgcgaacttgctagggttctgaaaaagggaggacttggcggcttcagaggttacagtctggaaaattggatttgtaccgcatactatgagagtggcttcaacacagccagcacaaactacaatccacctgacaagagcactgattatggcatttttcaaataaatagtcgatggtggtgcaatgataacaagacccccggaagtaaaaatgcttgcaatatcaactgcaaagtactgttaggtggcgatataagtcaagctataaaatgtgcaaagcgtgttgtgagtgatcccaacggcatgggtgcatgggttgcatggagaaatcactgtaagggcaaaaacttatcaaagtggactcaaggatgcaaactt

肽段序列為

mkwqihilgglllllaiasgkkyekcelarvlkkgglggfrgyslenwictayyesgfntastnynppdkstdygifqinsrwwcndnktpgsknacninckvllggdisqaikcakrvvsdpngmgawvawrnhckgknl5kwtqgckl

2溶菌酶重組表達產(chǎn)物對兩種革蘭氏陽性細菌、兩種革蘭氏陰性細菌和兩種真菌生長的抑制。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。