本發(fā)明涉及基因工程和微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種基于核糖體結(jié)合位點(diǎn)改造的啟動(dòng)子優(yōu)化方法。

背景技術(shù)：

啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的dna序列，是dna分子上被rna聚合酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等識(shí)別并結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的區(qū)域。啟動(dòng)子的保守結(jié)構(gòu)特征有：-10區(qū)、-35區(qū)、兩個(gè)區(qū)之間的間隔距離和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)tss。兩個(gè)識(shí)別區(qū)之間的序列雖然并不保守，但是其間隔距離的保守性對(duì)于rna聚合酶結(jié)合時(shí)的空間幾何構(gòu)象十分重要。之前研究結(jié)果表明，啟動(dòng)子-10位的tata區(qū)和-35位的ttgaca區(qū)是rna聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，能與σ因子相互識(shí)別而具有很高的親和力。原核生物中-10區(qū)同-35區(qū)之間核苷酸數(shù)目的變動(dòng)會(huì)影響基因轉(zhuǎn)錄活性的高低，強(qiáng)啟動(dòng)子一般為17±1bp，當(dāng)間距小于15bp或大于20bp時(shí)都會(huì)降低啟動(dòng)子的活性。同時(shí)，-35區(qū)共有序列5’-ttgaca-3’跟-10區(qū)共有序列5’-tataat-3’高度保守，對(duì)于大多數(shù)啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)，-10區(qū)與-35區(qū)的序列與共有序列的相似程度越高，其啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度越高。啟動(dòng)子上與rna聚合酶核心酶和σ因子互作的功能區(qū)域包括-35區(qū)、-10區(qū)、擴(kuò)展的-10區(qū)(extended-10)、上游增強(qiáng)元件(upelement)和+1區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，一些啟動(dòng)子還存在著與激活蛋白與阻遏蛋白結(jié)合的位點(diǎn)。不同啟動(dòng)子表現(xiàn)出的轉(zhuǎn)錄效率高低，歸根結(jié)底在于功能結(jié)構(gòu)序列的不同，如何通過(guò)對(duì)上述結(jié)構(gòu)的缺失、添加和突變，以得到適用于生產(chǎn)應(yīng)用和理論研究的理想啟動(dòng)子，使目前亟待解決的問(wèn)題。

mrna是生物信息傳遞鏈中的重要一環(huán)，與蛋白質(zhì)翻譯密切相關(guān)，有效的翻譯起始決定蛋白質(zhì)能否順利進(jìn)行翻譯(gold1988)。mrna的5’端非編碼區(qū)存在著一個(gè)重要的功能元件：核糖體結(jié)合位點(diǎn)rbs，也即原核生物中的sd序列。原核生物翻譯需要核糖體與核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子同時(shí)結(jié)合，核糖體的16s序列與rbs互補(bǔ)配對(duì)，起始轉(zhuǎn)運(yùn)rna(trna)與起始密碼子結(jié)合，從而開(kāi)始翻譯蛋白。研究表明mrna的5’端形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于翻譯起始會(huì)產(chǎn)生重要影響，如果sd序列和起始密碼子位于較穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，那么核糖體識(shí)別難度會(huì)大幅增加，導(dǎo)致翻譯起始效率降低，蛋白表達(dá)水平下降。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種用于提高產(chǎn)量的啟動(dòng)子及其制備方法，以增強(qiáng)核糖體識(shí)別能力，提高翻譯起始效率和外源蛋白表達(dá)水平。

本發(fā)明一方面，提供一種基于核糖體結(jié)合位點(diǎn)改造的啟動(dòng)子優(yōu)化方法，s1、具體為將枯草芽胞桿菌中p43啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列擴(kuò)增；s2、再通過(guò)引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增出帶核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的p43啟動(dòng)子，以獲得具有至少一種結(jié)構(gòu)功能的序列。

本發(fā)明第二方面，保護(hù)一種通過(guò)上述方法獲得的啟動(dòng)子。

本發(fā)明第三方木，保護(hù)一種含第二方面所述啟動(dòng)子的載體。

一種基于核糖體結(jié)合位點(diǎn)改造的啟動(dòng)子優(yōu)化方法，其優(yōu)點(diǎn)是：將p43啟動(dòng)子中核糖體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行本發(fā)明的優(yōu)化方法，使得優(yōu)化后的啟動(dòng)子與mrna的結(jié)合水平提高，繼而提高了目的基因的表達(dá)水平。

附圖說(shuō)明

圖1a、1b為啟動(dòng)子p43轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5’端非翻譯區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖示

其中圖1a是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，啟動(dòng)子p43轉(zhuǎn)錄出的序列推測(cè)在5’端會(huì)形成的一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(wangetal1984)；

圖1b為mfold軟件推定的結(jié)構(gòu)；

圖2為擴(kuò)增納豆激酶載體中表達(dá)元件prbs5nk的瓊脂糖凝膠圖；

其中，泳道1為來(lái)源于枯草芽胞桿菌168中啟動(dòng)子p43經(jīng)改造過(guò)后rbs5的條帶(284bp)；泳道2為以對(duì)照菌質(zhì)粒pp43saccnk為模板擴(kuò)增出來(lái)的納豆激酶基因條帶saccnk(1629bp)；泳道3為啟動(dòng)子rbs5和納豆激酶片段saccnk做soe-pcr連接的條帶

rbs5nk(1913bp)，泳道m(xù)為5kdnamarker；

此圖證明了納豆激酶載體中表達(dá)元件的擴(kuò)增均成功；

圖3為重組載體轉(zhuǎn)化地衣芽胞桿菌bl10菌落pcr驗(yàn)證圖；

其中，泳道1-5為用引物phy-f/phy-r進(jìn)行不同轉(zhuǎn)化子的菌落pcr驗(yàn)證時(shí)條帶(2184bp)，泳道m(xù)為5kmarker；

圖4為對(duì)照菌株地衣芽胞桿菌bl10(pp43saccnk)和啟動(dòng)子優(yōu)化后的菌株發(fā)酵終點(diǎn)的sds-page圖；

其中，泳道m(xù)為proteinmolecularweightmarker，泳道1為對(duì)照菌bl10(pp43saccnk)的胞外總蛋白濃縮10倍后的發(fā)酵上清液樣，泳道2～6分別為改造菌bl10(prbs1nk)，bl10(prbs2nk)，bl10(prbs3nk)，bl10(prbs4nk)，bl10(prbs5nk)的胞外總蛋白濃縮10倍后的發(fā)酵上清液樣。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明一方面，提供一種基于核糖體結(jié)合位點(diǎn)改造的啟動(dòng)子優(yōu)化方法，s1、具體為將枯草芽胞桿菌中p43啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列擴(kuò)增；s2、再通過(guò)引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增出帶核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的p43啟動(dòng)子，以獲得具有至少一種結(jié)構(gòu)功能的序列。

優(yōu)選地，對(duì)所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列進(jìn)行優(yōu)化的方法為：

s1、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的b.subtilis168基因組序列nz_cp010052.1，找到p43原始序列，具體序列見(jiàn)序列表seqidno:1；利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43-soe-r，以b.subtilis168總dna為模板擴(kuò)增出原始啟動(dòng)子p43；

s2、將步驟s1擴(kuò)增出的啟動(dòng)子p43作為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs1-soe-r，且在設(shè)計(jì)方向引物時(shí)，引物p43rbs1-soe-r后面5個(gè)堿基減掉，并在引物p43rbs1-soe-r的前面添加ttcat這5個(gè)堿基，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs1，使得擴(kuò)增出來(lái)的序列后面多出序列atgaa，其具體序列見(jiàn)序列表seqidno:2。

或者

優(yōu)選地，對(duì)所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列進(jìn)行優(yōu)化的方法為：

s1、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的b.subtilis168基因組序列nz_cp010052.1，找到p43原始序列，具體序列見(jiàn)序列表seqidno:1；利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43-soe-r，以b.subtilis168總dna為模板擴(kuò)增出原始啟動(dòng)子p43；

s2、以步驟s1擴(kuò)增出的啟動(dòng)子p43為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs2-soe-r，將兩個(gè)堿基c和a從p43頸環(huán)結(jié)構(gòu)上去除，并且將rbs結(jié)合區(qū)由gtaagagagg變?yōu)間aaaggagg，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs2，其具體序列見(jiàn)序列表seqidno:3。

或者

優(yōu)選地，對(duì)所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列進(jìn)行優(yōu)化的方法為：

s1、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的b.subtilis168基因組序列nz_cp010052.1，找到p43原始序列，具體序列見(jiàn)序列表seqidno:1；利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43-soe-r，以b.subtilis168總dna為模板擴(kuò)增出原始啟動(dòng)子p43；

s2、以步驟s1擴(kuò)增出的啟動(dòng)子p43為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs2-soe-r，將兩個(gè)堿基c和a從p43頸環(huán)結(jié)構(gòu)上去除，并且將rbs結(jié)合區(qū)由gtaagagagg變?yōu)間aaaggagg，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs2；

以啟動(dòng)子rbs2為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs3-soe-r，且在反向引物前面添加5個(gè)堿基ttcat，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs3，其具體序列見(jiàn)序列表seqidno:4。

或者

優(yōu)選地，對(duì)所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列進(jìn)行優(yōu)化的方法為：

s1、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的b.subtilis168基因組序列nz_cp010052.1，找到p43原始序列，具體序列見(jiàn)序列表seqidno:1；利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43-soe-r，以b.subtilis168總dna為模板擴(kuò)增出原始啟動(dòng)子p43；

s2、以步驟s1擴(kuò)增出的啟動(dòng)子p43為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs4-soe-r，將p43莖環(huán)結(jié)構(gòu)右側(cè)的序列g(shù)aagatct刪除，rbs結(jié)合區(qū)gtaagagagg變?yōu)間ggatctgaag，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs4，其具體序列見(jiàn)序列表seqidno:5。

或者

優(yōu)選地，對(duì)所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列進(jìn)行優(yōu)化的方法為：

s1、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的b.subtilis168基因組序列nz_cp010052.1，找到p43原始序列，具體序列見(jiàn)序列表seqidno:1；利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43-soe-r，以b.subtilis168總dna為模板擴(kuò)增出原始啟動(dòng)子p43；

s2、以步驟s3擴(kuò)增出的啟動(dòng)子rbs2為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs5-soe-r，將p43莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列去除，保留p43上的rbs，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs5，其具體序列見(jiàn)序列表為seqidno:6。

進(jìn)一步地，上述pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系、條件分別為：

擴(kuò)增反應(yīng)體系均為：5×fastpfubuffer10ul、dntps(2mm)5ul、primerf1ul、primerr1ul、模板dna1ul、fastpfu酶1ul，ddh2o，所添加的ddh2o使得溶液補(bǔ)至50ul；

擴(kuò)增反應(yīng)條件均為：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸xmin(x值根據(jù)具體片段大小而定，一般1kbp片段延伸1min)，30個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃10min。

本發(fā)明第二方面，保護(hù)一種通過(guò)上述方法獲得的啟動(dòng)子。

本發(fā)明第三方木，保護(hù)一種含第二方面所述啟動(dòng)子的載體。

以下就具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例一：

s1、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的b.subtilis168基因組序列nz_cp010052.1，找到p43原始序列，具體序列見(jiàn)序列表seqidno:1；利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43-soe-r，以b.subtilis168總dna為模板擴(kuò)增出原始啟動(dòng)子p43；

設(shè)計(jì)引物如下：

p43-f：cggaattctgataggtggtatgttttcg

p43-soe-r：cttacctataatggtaccagatctgctatcactttat

s2、將步驟s1擴(kuò)增出的啟動(dòng)子p43作為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs1-soe-r，且在設(shè)計(jì)方向引物時(shí)，引物p43rbs1-soe-r后面5個(gè)堿基減掉，并在引物p43rbs1-soe-r的前面添加ttcat這5個(gè)堿基，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs1，使得擴(kuò)增出來(lái)的序列后面多出序列atgaa，其具體序列見(jiàn)序列表seqidno:2。

設(shè)計(jì)引物如下：

p43-f：cggaattctgataggtggtatgttttcg

p43rbs1-soe-r：

cttacctataatggtaccagatctgctatcactttat

實(shí)施例二

s1、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的b.subtilis168基因組序列nz_cp010052.1，找到p43原始序列，具體序列見(jiàn)序列表seqidno:1；利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43-soe-r，以b.subtilis168總dna為模板擴(kuò)增出原始啟動(dòng)子p43；

設(shè)計(jì)引物如下：

p43-f：cggaattctgataggtggtatgttttcg

p43-soe-r：

cttacctataatggtaccagatctgctatcactttat；

s2、以步驟s1擴(kuò)增出的啟動(dòng)子p43為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs2-soe-r，將兩個(gè)堿基c和a從p43頸環(huán)結(jié)構(gòu)上去除，并且將rbs結(jié)合區(qū)由gtaagagagg變?yōu)間aaaggagg，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs2，其具體序列見(jiàn)序列表seqidno:3。

設(shè)計(jì)引物如下：

p43-f：cggaattctgataggtggtatgttttcg

p43rbs2-soe-r：

cctcctttcctataatgtaccagatctgctatcactttat

實(shí)施例三

s1、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的b.subtilis168基因組序列nz_cp010052.1，找到p43原始序列，具體序列見(jiàn)序列表seqidno:1；利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43-soe-r，以b.subtilis168總dna為模板擴(kuò)增出原始啟動(dòng)子p43；

設(shè)計(jì)引物如下：

p43-f：cggaattctgataggtggtatgttttcg

p43-soe-r：

cttacctataatggtaccagatctgctatcactttat；

s2、以步驟s1擴(kuò)增出的啟動(dòng)子p43為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs2-soe-r，將兩個(gè)堿基c和a從p43頸環(huán)結(jié)構(gòu)上去除，并且將rbs結(jié)合區(qū)由gtaagagagg變?yōu)間aaaggagg，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs2；

設(shè)計(jì)引物如下：

p43-f：cggaattctgataggtggtatgttttcg

p43rbs2-soe-r：

cctcctttcctataatgtaccagatctgctatcactttat

以啟動(dòng)子rbs2為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs3-soe-r，且在反向引物前面添加5個(gè)堿基ttcat，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs3，其具體序列見(jiàn)序列表seqidno:4。

設(shè)計(jì)引物如下：

p43-f：cggaattctgataggtggtatgttttcg

p43rbs3-soe-r：

cctcctttcctataatgtaccagatctgctatcactttat

實(shí)施例四

s1、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的b.subtilis168基因組序列nz_cp010052.1，找到p43原始序列，具體序列見(jiàn)序列表seqidno:1；利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43-soe-r，以b.subtilis168總dna為模板擴(kuò)增出原始啟動(dòng)子p43；

設(shè)計(jì)引物如下：

p43-f：cggaattctgataggtggtatgttttcg

p43-soe-r：

cttacctataatggtaccagatctgctatcactttat；

s2、以步驟s1擴(kuò)增出的啟動(dòng)子p43為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs4-soe-r，將p43莖環(huán)結(jié)構(gòu)右側(cè)的序列g(shù)aagatct刪除，rbs結(jié)合區(qū)gtaagagagg變?yōu)間ggatctgaag，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs4，其具體序列見(jiàn)序列表seqidno:5

設(shè)計(jì)引物如下：

p43-f：cggaattctgataggtggtatgttttcg

p43rbs4-r：

aatcagtctctttttcatattacctcctcagatcccctataatggtacc

實(shí)施例五

s1、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的b.subtilis168基因組序列nz_cp010052.1，找到p43原始序列，具體序列見(jiàn)序列表seqidno:1；利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43-soe-r，以b.subtilis168總dna為模板擴(kuò)增出原始啟動(dòng)子p43；

設(shè)計(jì)引物如下：

p43-f：cggaattctgataggtggtatgttttcg

p43-soe-r：cttacctataatggtaccagatctgctatcactttat；

s2、以步驟s3擴(kuò)增出的啟動(dòng)子rbs2為模板，利用primerprimier5軟件設(shè)計(jì)引物p43-f和p43rbs5-soe-r，將p43莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列去除，保留p43上的rbs，通過(guò)pcr擴(kuò)增出啟動(dòng)子rbs5，其具體序列見(jiàn)序列表為seqidno:6。

設(shè)計(jì)引物如下：

p43-f：cggaattctgataggtggtatgttttcg

p43rbs5-soe-r：

gatccttcctcctttagatctgctatcactttat

上述實(shí)施例一至實(shí)施例五中的擴(kuò)增反應(yīng)體系均為：5×fastpfubuffer10ul、dntps(2mm)5ul、primerf1ul、primerr1ul、模板dna1ul、fastpfu酶1ul，ddh2o，所添加的ddh2o使得溶液補(bǔ)至50ul；

擴(kuò)增反應(yīng)條件均為：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸xmin(x值根據(jù)具體片段大小而定，一般1kbp片段延伸1min)，30個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃10min。

現(xiàn)有啟動(dòng)子p43轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5’端非翻譯區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖以及通過(guò)上述實(shí)施例一至實(shí)施例五方法優(yōu)化后的的啟動(dòng)子發(fā)夾結(jié)構(gòu)如圖1所示。

實(shí)施例六：

對(duì)實(shí)施例一至實(shí)施例五所述方法所制得的rbs1～rbs5功能進(jìn)行檢測(cè)

一、設(shè)計(jì)引物sacc-f和nk-r，以質(zhì)粒physaccnk為模板，通過(guò)pcr擴(kuò)增出含sacc信號(hào)肽序列的納豆激酶基因序列sacc-nk；

二、基于p43啟動(dòng)子改造的納豆激酶分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建

以商用表達(dá)載體phy300plk為初始載體構(gòu)建納豆激酶高效分泌表達(dá)載體，pcr分別出實(shí)施例一至實(shí)施例五中對(duì)應(yīng)的含sacc信號(hào)肽序列的納豆激酶基因片段sacc-nk和rbs1nk～rbs5nk；

擴(kuò)增出與啟動(dòng)子p43對(duì)應(yīng)的帶sacc信號(hào)肽的納豆激酶序列，所用引物為：

saccp43-soe-f：

gaagatctggtaccattataggtaagagaggaatgtacacatgaaaaagagactgattc

saccnk-r：gctctagacgcaataatgccgtcgcactg

擴(kuò)增出與rbs1對(duì)應(yīng)的帶sacc信號(hào)肽的納豆激酶序列，所用引物為：

saccrbs1-soe-f：

gaagatctggtaccattataggtaagagaggaatgtacacatgaaatgaaaaagagact

saccnk-r：gctctagacgcaataatgccgtcgcactg

擴(kuò)增出與rbs2中對(duì)應(yīng)的帶sacc信號(hào)肽的納豆激酶序列，所用引物為：

saccrbs2-soe-f：

gaagatctggtacattataggaaaggaggaatgtaccatgaaaaagagactgattcaag

saccnk-r：gctctagacgcaataatgccgtcgcactg

擴(kuò)增出與rbs3對(duì)應(yīng)的帶sacc信號(hào)肽的納豆激酶序列，所用引物為：

p43rbs3-r：

gaagatctggtacattataggaaaggaggaatgtaccatgaaatgaaaaagagactg

saccnk-r：gctctagacgcaataatgccgtcgcactg

擴(kuò)增出與rbs4對(duì)應(yīng)的帶sacc信號(hào)肽的納豆激酶序列，所用引物為：

p43rbs4-soe-r：

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saccnk-r：gctctagacgcaataatgccgtcgcactg

擴(kuò)增出與rbs5對(duì)應(yīng)的帶sacc信號(hào)肽的納豆激酶序列，所用引物為：

p43rbs5-soe-r：

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saccnk-r：gctctagacgcaataatgccgtcgcactg

將實(shí)施例一至實(shí)施例五中所述方法所制得的rbs1～rbs5啟動(dòng)子序列和步驟二中制備的含sacc信號(hào)肽序列的納豆激酶基因片段sacc-nk及rbs1～rbs5，通過(guò)soe-pcr方法連接以獲得產(chǎn)物p43sacc-nk和rbs1nk～rbs5nk；

所述soe-pcr方法所用條件為：

soe-pcr反應(yīng)條件為：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸xmin(x值根據(jù)具體片段大小定，一般1kbp片段延伸1min)，7個(gè)循環(huán)(此循環(huán)不加引物進(jìn)行)；72℃5min(在此時(shí)間段內(nèi)加入引物)；95℃30s，55℃30s，72℃延伸xmin(x值根據(jù)具體片段大小定，一般1kbp片段延伸1min)，30個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃10min。

再將上述獲得的產(chǎn)物p43sacc-nk和rbs1nk～rbs5nk均通過(guò)ecori/xbai雙酶切(酶切體系為片段80ul，10×mbuffer10ul，ecori5ul，xbai5ul)；混勻后分成20ul一管，37℃酶切3h。將酶切片段產(chǎn)物與同樣經(jīng)過(guò)ecori/xbai雙酶切的phy300plk空質(zhì)粒酶連，酶連溫度為16℃，時(shí)間為8h，酶連產(chǎn)物隨后轉(zhuǎn)化e.colidh5α，挑轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，將pcr驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子挑菌接至含有5mllb培養(yǎng)基的pa瓶中(50ug/ml氨芐抗生素)，抽質(zhì)粒并測(cè)序，重組質(zhì)粒分布命名為prbs1nk～prbs5nk。(如圖2所示)

三、地衣芽胞桿菌基于p43啟動(dòng)子改造的納豆激酶工程菌株bl10(prbs1nk)，bl10(prbs2nk)，bl10(prbs3nk)，bl10(prbs4nk)，bl10(prbs5nk)的構(gòu)建

將構(gòu)建好的納豆激酶表達(dá)載體prbs1nk～prbs5nk分別電轉(zhuǎn)化至地衣芽胞桿菌bl10中(該菌保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號(hào)為cctccno：m2013400，分類(lèi)命名為：地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)bl10，保藏地址為：湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2013年09月10日，且屬于存活狀態(tài))，具體為：

首先做地衣芽胞桿菌bl10感受態(tài)，在平板上活化菌種，然后挑菌至含有5～10mllb的pa瓶中，30～37℃過(guò)夜培養(yǎng)，隨后以3～5％的接種量轉(zhuǎn)接至生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，30～37℃，180～200rpm培養(yǎng)至od600到0.80～0.90，5500～7000rpm離心6～8min收集菌體，用洗滌培養(yǎng)基重懸菌體，5500～7000rpm離心6～8min，重復(fù)三次后加入0.8～1ml洗滌培養(yǎng)基重懸菌體，分裝至滅過(guò)菌的1.5mlep管中，每管分裝80～100ul，-80℃保存。

再將吹干后的電轉(zhuǎn)杯在冰上預(yù)冷10～15min，然后將80～100ul的地衣芽胞桿菌bl10感受態(tài)細(xì)胞與5～10ul重組載體(分別與prbs1nk～prbs5nk)混勻后加入電轉(zhuǎn)杯中，冰上預(yù)冷3～5min后，2.1～2.4kv條件下點(diǎn)擊，電擊時(shí)間4.8-5.2ms，隨后立即加入500～800ul恢復(fù)培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至1.5mlep管中。30～37℃，100～110rpm培養(yǎng)3h后涂lb平板(含20ug/ml四環(huán)抗生素)。待長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后挑菌進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證和抽質(zhì)粒驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后保存菌種，且重組菌株分別命名為bl10(prbs1nk)、bl10(prbs2nk)、bl10(prbs3nk)、bl10(prbs4nk)、bl10(prbs5nk)。

四、重組載體轉(zhuǎn)化地衣芽胞桿菌bl10菌落pcr驗(yàn)證步驟

待電轉(zhuǎn)化涂抗性平板后，將轉(zhuǎn)化子挑至相同的抗性平板上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃靜置培養(yǎng)6h后即可長(zhǎng)出，隨后將若干轉(zhuǎn)化子分別挑部分至1.5mlep管(加有30ul的ddh2o)中，沸水浴煮菌10min，然后12000rpm離心2min，上清液作為菌落pcr驗(yàn)證模板待用。

配置菌落pcr體系：ddh2o7.7ul，dntps5ul，10×easytaqbuffer5ul，phy-f1ul，phy-r1ul，模板10ul，easytaq酶1ul；菌落pcr反應(yīng)條件為：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸2.5min(片段大小2184bp左右)，30個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃10min。

菌落pcr反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖3所示，泳道1～5為不同轉(zhuǎn)化子菌落pcr驗(yàn)證結(jié)果條帶(2184bp)，泳道m(xù)為5kdnamarker(從上到下依次為：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。由圖可知，成功獲得含重組載體的地衣芽胞桿菌bl10(prbs5nk)。

五、地衣芽胞桿菌工程菌產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在平板上活化步驟三獲得的菌種，挑菌接至含有50ml液體lb的250ml三角瓶中，37℃，220rpm培養(yǎng)10h，隨后以1％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，220rpm培養(yǎng)48h。對(duì)照菌株為啟動(dòng)子未經(jīng)改造的納豆激酶表達(dá)菌株bl10(pp43saccnk)(菌保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號(hào)為cctccno：m2014253，分類(lèi)命名為：地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)bl10(pp43saccnk)，保藏地址為：湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2014年06月12日，且屬于存活狀態(tài))。

所述液體lb配方為：10g/l蛋白胨，5g/l酵母浸粉，10g/l氯化鈉，ph7.2-7.4250ml三角瓶裝液量為50ml；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：5-30g/l葡萄糖；1-15g/l大豆蛋白胨；1-15g/l酵母粉；1-15g/l蛋白胨；1-10g/l玉米漿；0.1-10g/l氯化鈉；0.1-6g/l硫酸銨；0.1-3g/l磷酸氫二鉀；ph7.0-7.2；

所述發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度為37℃，250ml三角瓶中裝液量20-50ml，搖床轉(zhuǎn)速150-250r/min，發(fā)酵周期48h；

發(fā)酵液預(yù)處理：取2ml發(fā)酵液于2mlep管中，10000rpm離心5min后上清轉(zhuǎn)移至另外一個(gè)2mlep管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

六、啟動(dòng)子改造對(duì)納豆激酶產(chǎn)量的影響

1、纖維蛋白溶解法測(cè)定步驟五經(jīng)發(fā)酵的納豆激酶的酶活：

樣品吸光度at：向試管中依次加入0.40ml纖維蛋白原溶液(0.72％，w/v)，1.4mltris-hcl(50mm，ph7.8)，37℃溫浴5min，然后加入0.10ml凝血酶溶液(20u/ml)，37℃溫浴10min，再加入0.10ml的稀釋酶樣品，37℃溫浴60min，加入2ml三氯乙酸(0.20m)靜止20min終止反應(yīng)，10000rpm離心10min，取上清于275nm比色測(cè)定吸光度at；

對(duì)照吸光度ab：向試管中依次加入0.40ml纖維蛋白原溶液(0.72％，w/v)，1.40mltris-hcl(50mm，ph7.8)，37℃溫浴5min，然后加入0.10ml凝血酶溶液(20u/ml)，37℃溫浴10min，繼續(xù)37℃溫浴60min，同時(shí)加入0.10ml的稀釋酶樣品和2ml三氯乙酸(0.20m)，10000rpm離心10min，取上清于275nm比色測(cè)定吸光度ab作為對(duì)照。

1個(gè)單位的纖維蛋白降解酶活(fu)相當(dāng)于每分鐘275nm處吸光度增加0.01所需要的酶量。

納豆激酶活性(fu/g或者fu/ml)＝(at－ab)/0.01×1/60×1/0.1×d＝a100/6*d(d：稀釋倍數(shù)；at實(shí)際的od275；ab：空白o(hù)d275)

通過(guò)酶活測(cè)定，對(duì)照菌bl10(pp43saccnk)的納豆激酶酶活是42.95fu/ml，而啟動(dòng)子改造菌bl10(prbs1nk)的納豆激酶酶活是46.23fu/ml，bl10(prbs2nk)的納豆激酶酶活是44.35fu/ml，bl10(prbs3nk)的納豆激酶酶活是15.87fu/ml，bl10(prbs4nk)的納豆激酶酶活是28.54fu/ml，bl10(prbs5nk)的納豆激酶酶活高達(dá)74.31fu/ml。相比較于對(duì)照菌bl10(pp43saccnk)酶活，啟動(dòng)子改造菌bl10(prbs5nk)的納豆激酶酶活提高了73％。

2、蛋白膠檢測(cè)：

樣品預(yù)處理：在1.5mlep管中加入900ul發(fā)酵液上清，與100ul100％tca混勻后，4℃條件下靜置過(guò)夜，10000rpm離心10min，隨后用500ul無(wú)水乙醇洗去tca，重復(fù)三次，待乙醇吹干后加入45ul的2m硫脲和8m尿素的混合溶液，與等量的2*sds-pagebuffer混勻后沸水浴加熱10min，隨后上樣10ul進(jìn)行sds-page檢測(cè)。

如圖4為sds-page檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)樣品條帶的深度及面積，比較啟動(dòng)子改造菌bl10(prbs1nk)～bl10(prbs5nk)與對(duì)照菌bl10(pp43saccnk)的相對(duì)產(chǎn)量。由圖可知，改造菌bl10(prbs1nk)和bl10(prbs5nk)分泌的納豆激酶產(chǎn)量明顯高于對(duì)照菌bl10(pp43saccnk)，說(shuō)明本發(fā)明中啟動(dòng)子序列的優(yōu)化方法可以提高納豆激酶的分泌。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>湖北大學(xué)

<120>一種基于核糖體結(jié)合位點(diǎn)改造的啟動(dòng)子優(yōu)化方法

<130>2016

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<213>枯草芽胞桿菌p43啟動(dòng)子

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<213>枯草芽胞桿菌p43啟動(dòng)子優(yōu)化序列rbs1

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<213>枯草芽胞桿菌p43啟動(dòng)子優(yōu)化序列rbs2

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<213>枯草芽胞桿菌p43啟動(dòng)子優(yōu)化序列rbs4

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<213>枯草芽胞桿菌p43啟動(dòng)子優(yōu)化序列rbs5

<400>6

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