本發(fā)明涉及重組基因技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種表面展示多肽的病毒樣顆粒、其制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多肽已被用于疾病的診斷及治療領(lǐng)域。多肽作為抗原可以用于病毒、細(xì)菌、支原體、螺旋體等微生物的檢測(cè)，用其制備的檢測(cè)試劑檢測(cè)抗體的假陰性率和本底反應(yīng)都很低，易于臨床應(yīng)用。此外，多肽已被用于多種疾病的治療，如戈那瑞林為人工合成的促性腺激素釋放素，屬肽類化合物，為十肽，可用作促排卵藥。

多肽的不穩(wěn)定及制備成本高的問題大大限制了其在臨床及研究中的應(yīng)用?，F(xiàn)在，提高多肽穩(wěn)定性的方法主要有：化學(xué)修飾、轉(zhuǎn)換氨基酸構(gòu)型等。這些方法在一定程度上解決了多肽不穩(wěn)定的問題，但是仍不能解決多肽生產(chǎn)成本高的問題。研究表明，用噬菌體作為載體展示多肽能有效解決多肽不穩(wěn)定及生產(chǎn)成本高的問題。

噬菌體展示肽庫技術(shù)的發(fā)展則為發(fā)現(xiàn)和表征新的配體及對(duì)應(yīng)受體提供了有力的工具，不僅有望實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用于腫瘤的靶向治療，也有助于解釋疾病發(fā)生機(jī)制的理論研究。傳統(tǒng)的噬菌體展示技術(shù)選用dna噬菌體作為載體，通過將特定目的基因片段插入噬菌體基因組中而實(shí)現(xiàn)將特定的多肽或蛋白展示在噬菌體表面的目的。但是，在噬菌體展示技術(shù)中使用的噬菌體仍保留了其完整的基因組，所以應(yīng)用該技術(shù)制備的噬菌體樣顆粒安全性影響了其在臨床中的應(yīng)用。

研究表明，rna噬菌體同樣可以用于展示多肽，且僅將多肽編碼序列插入到其衣殼蛋白基因中即可實(shí)現(xiàn)多肽的展示，且不影響噬菌體樣顆粒的組裝。與以dna噬菌體樣顆粒相比較，以rna噬菌體作為載體時(shí)，僅選用噬菌體的衣殼蛋白基因，而不是整個(gè)基因組，所以不存在整合到人基因組中的可能，安全性更高。

peabody等發(fā)現(xiàn)，rna噬菌體━pp7噬菌體衣殼蛋白可用于展示任意氨基酸構(gòu)成的八肽或十肽。但是，在實(shí)際應(yīng)用過程中，pp7噬菌體衣殼蛋白并不能展示所有任意氨基酸構(gòu)成(小于50個(gè)氨基酸)的多肽。對(duì)此，我們基于欲展示多肽的特點(diǎn)，通過對(duì)多肽進(jìn)行修飾實(shí)現(xiàn)了任意氨基酸構(gòu)成(小于50個(gè)氨基酸)的多肽展示。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)不足，提出一種生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性好，產(chǎn)量高的表面展示多肽的病毒樣顆粒。

為達(dá)到上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種表面展示多肽的病毒樣顆粒，包括噬菌體病毒樣顆粒、多肽和修飾序列，所述多肽展示在所述噬菌體病毒樣顆粒上，所述修飾序列是對(duì)所述多肽進(jìn)行修飾的氨基酸序列，修飾后的多肽為(gan)n(nnn)m(gan)n，其中，所述(gan)n(nnn)m(gan)n的合計(jì)等電點(diǎn)<5，所述n為a、t、c或g，終止密碼子除外。

n為個(gè)數(shù)，該個(gè)數(shù)主要與插入多肽的等電點(diǎn)有關(guān)，當(dāng)(gan)n(nnn)m(gan)n合計(jì)等電點(diǎn)<5時(shí)，即可被該展示載體展示出來，并且插入多肽的等電點(diǎn)與病毒樣顆粒的產(chǎn)量之間有一定關(guān)系。

作為一種改進(jìn)，所述多肽插入在所述噬菌體病毒樣顆粒的衣殼蛋白二聚體的第二個(gè)衣殼蛋白編碼序列的限制性酶切位點(diǎn)kpni之后。(見圖1)

作為一種改進(jìn)，所述噬菌體病毒樣顆粒為pp7噬菌體病毒樣顆粒。所述噬菌體病毒樣顆粒還可以是其他噬菌體，如ms2，r17，fr，ga，qβ，sp，m11，mx1，f4，cb5，cb12r，cb23r，7s，f2等。

作為一種改進(jìn)，1≤m≤50。所述噬菌體病毒樣顆?？梢哉故镜亩嚯牡陌被釘?shù)量為1-50個(gè)(不含修飾多肽的氨基酸數(shù)量)。

作為一種改進(jìn)，所述多肽為tat多肽、a6多肽、戈那瑞林、atn-161多肽、pep2-klak多肽或pap114-128多肽。

一種表面展示多肽的病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟：

(1)檢測(cè)多肽的等電點(diǎn)，在所述多肽的兩端分別添加酸性氨基酸以對(duì)所述多肽進(jìn)行修飾，使修飾后的多肽的等電點(diǎn)<5；

(2)將修飾后的多肽的編碼序列通過重疊pcr技術(shù)插入到噬菌體病毒樣顆粒的衣殼蛋白二聚體的第二個(gè)衣殼蛋白編碼序列的限制性酶切位點(diǎn)kpni之后，得pcr產(chǎn)物；

(3)選用質(zhì)粒載體，對(duì)所述pcr產(chǎn)物和所述質(zhì)粒載體分別進(jìn)行雙酶切，得pcr酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒酶切載體，將所述pcr酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒酶切載體進(jìn)行于16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入dh5α感受態(tài)細(xì)胞，得到重組表達(dá)質(zhì)粒；

(4)將所述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌bl21(de3)中，挑取單克隆菌落接種于lb培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)12h，得到一級(jí)培養(yǎng)液，再將所述一級(jí)培養(yǎng)液接種于lb培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)至a600達(dá)到0.7～0.8，加入誘導(dǎo)劑，在37℃下誘導(dǎo)反應(yīng)8h，驗(yàn)證，再用凝膠過濾層析純化，即得。

作為一種改進(jìn)，所述誘導(dǎo)劑為1mmol/l的異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷。

作為一種改進(jìn)，所述質(zhì)粒載體為petduet-1。

本發(fā)明的另一目的在于：提供一種疫苗，所述疫苗的活性成分為所述的表面展示多肽的病毒樣顆粒。

本發(fā)明提供的表面展示多肽的病毒樣顆粒，其成本低廉，制備周期較短，操作方便，其展示的多肽較好的保留其原有的生物學(xué)活性，且穩(wěn)定性好，由此制備出的病毒樣顆粒產(chǎn)量高，且產(chǎn)品性質(zhì)均一、穩(wěn)定。

附圖說明

圖1是攜帶有多肽的pp7噬菌體衣殼蛋白二聚體編碼基因構(gòu)成；

圖2是菌落pcr篩選攜帶petduet-2pp7-tat-modi質(zhì)粒的陽性菌落結(jié)果；

圖3是tat多肽修飾前后的測(cè)序結(jié)果；

圖4和圖5是sds-page結(jié)果驗(yàn)證攜帶不同多肽的pp7噬菌體樣顆粒的表達(dá)情況；

圖6是透射電鏡驗(yàn)證2pp7-tat-modivlps和2pp7-pep2-klak-modivlps的組裝情況；；

圖7是激光共聚焦顯微鏡驗(yàn)證2pp7-tat-modivlps的穿膜效果。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

tat多肽編碼序列：

修飾前：tatggtcgtaaaaaacgccgacagcgtcgccga。

修飾后：gaggacggtgaagatggcgaggactatggtcgtaaaaaacgccgacagcgtcgccgagacgagggggacgat。

實(shí)施例2

a6多肽編碼序列

修飾前：aaacctagctcgcctccggaagag。

修飾后：gaagacaaacctagctcgcctccggaagag。

實(shí)施例3

戈那瑞林編碼序列

修飾前：gaacactggtcgtacggcctgcgtccgggt。

修飾后：gaggatgaacactggtcgtacggcctgcgtccgggtgaggat。

實(shí)施例4

atn-161多肽編碼序列

修飾前：ccgcactcgtgcaac。

修飾后：gaagacccgcactcgtgcaacgaagac。

實(shí)施例5

pep2-klak多肽編碼序列

修飾前：catctctatgttagtccttggggcggtaaactcgccaaacttgctaaaaagcttgccaaactcgctaaa。

修飾后：gaggatgaagacgaagatcatctctatgttagtccttggggcggtaaactcgccaaacttgctaaaaagcttgccaaactcgctaaagatgac。

實(shí)施例6

pap114-128多肽編碼序列

修飾前：atgagcgccatgaccaatctcgctgccctttttcctcctgaaggc。

修飾后：gagatgagcgccatgaccaatctcgctgccctttttcctcctgaaggcgaa。

實(shí)施例7

表面展示tat多肽的pp7病毒樣顆粒

材料：大腸桿菌菌株[top10和bl21(de3)]均購自北京天根生物技術(shù)公司；pp7噬菌體衣殼蛋白基因(petduet-1pp7)和質(zhì)粒petduet-2pp7由濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系保存；kpni、xhoi、primerstarhsdna聚合酶、dntp、t4dna連接酶、dna膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自大連takara公司；bio-gela-1.5m凝膠購自bio-rad公司；reddye購自英濰捷基公司；fitc購自美國sigma公司；dapi購自碧云天公司。

(1)tat多肽的修飾(修飾結(jié)果見實(shí)施例1)

(2)引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)pp7衣殼蛋白基因序列以及原核表達(dá)載體petduet-1的特性，設(shè)計(jì)引物的合成見表1：

表1引物序列及功能

(3)pp7-tat和pp7-tat-modi片段的pcr擴(kuò)增

以petduet-pp7質(zhì)粒為模板，以2pp7-tat或2pp7-tat-modi為上游引物，以pp7-r為下游引物，以primerstarhs為dna聚合酶進(jìn)行pcr，將獲得的pcr片段用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用dna膠回收試劑盒回收。

(4)petduet-2pp7-tat和petduet-2pp7-tat-modi表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取petduet-2pp7質(zhì)粒，然后用kpni和xhoi對(duì)膠回收獲得的pcr產(chǎn)物和petduet-2pp7載體分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行膠回收，然后用t4dna連接酶將酶切的pcr產(chǎn)物和petduet-2pp7質(zhì)粒于16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆接種入含100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)6h，然后進(jìn)行菌落pcr鑒定，將pcr擴(kuò)增為陽性的菌落進(jìn)行測(cè)序。

為驗(yàn)證pp7衣殼蛋白單鏈二聚體基因片段是否和載體連接成功，首先用pcr篩選出含petduet-2pp7-tat或petduet-2pp7-tat-modi質(zhì)粒的陽性菌落(圖2)。圖2中，m是指dl2000dnamarker；1～5是指含petduet-2pp7-tat-modi質(zhì)粒的不同菌落的pcr鑒定結(jié)果；6～10是指含petduet-2pp7-tat質(zhì)粒的不同菌落的pcr鑒定結(jié)果。

接著用測(cè)序法驗(yàn)證petduet-2pp7-tat-modi質(zhì)粒中插入的tat-modi片段的準(zhǔn)確性，其結(jié)果見圖3，圖3中a是指修飾前的tat多肽編碼序列測(cè)序結(jié)果；b是指修飾后的tat多肽編碼序列測(cè)序結(jié)果，結(jié)果表明兩種質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

(5)pp7vlp的表達(dá)及鑒定

將測(cè)序正確的petduet-2pp7-tat和petduet-2pp7-tat-modi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入e.colibl21(de3)，挑取單克隆菌落接種于5ml含100μg/ml氨芐青霉素的液體lb培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)12h。取5ml接種到500ml含100μg/ml氨芐青霉素的液體lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至a600值為0.7～0.8時(shí)，加入終濃度為1mmol/liptg于37℃誘導(dǎo)8h，4℃、12000rpm離心2min。收集沉淀，將其用超聲緩沖液重懸，用超聲破碎儀裂解，然后于4℃、12000rpm離心10min，收集上清后行sds-page驗(yàn)證。接著用bio-gela-1.5m凝膠過濾層析純化獲得純的2pp7-tatvlp和2pp7-tat-modivlp，并用透射電鏡進(jìn)行鑒定。

將重組表達(dá)質(zhì)粒petduet-2pp7-tat和petduet-2pp7-tat-modi分別導(dǎo)入e.colibl21(de3)誘導(dǎo)表達(dá)，sds-page后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果顯示，在37℃、1mmol/liptg誘導(dǎo)6h，在相對(duì)分子質(zhì)量35kda左右有一明顯的外源蛋白條帶(見圖4和圖5)。圖4中，1.tat修飾前；2.tat修飾后；3.pep2-klak修飾后；4.pep2-klak修飾前；5.a6多肽修飾前；6.a6多肽修飾后；7.戈那瑞林多肽修飾后；8.戈那瑞林多肽修飾前；m.蛋白marker。圖5中，1.atn-161修飾前；2.atn-161修飾后；3.pap114-128修飾前；4.pap114-128修飾后；m.蛋白marker。結(jié)果顯示，在tat修飾前組和pep2-klak修飾前組均未見到明顯的目的條帶；而在其相對(duì)應(yīng)的修飾后組均有明顯的條帶出現(xiàn)；對(duì)于a6、戈那瑞林、atn-161這4種多肽而言，修飾后比修飾前蛋白表達(dá)量明顯上升；對(duì)于pap114-128多肽來說，修飾前后蛋白表達(dá)量無明顯差異性，原因是pap114-128修飾前的等電點(diǎn)已經(jīng)小于5。

同時(shí)，透射電鏡結(jié)果顯示，攜帶修飾的tat和pep-klak多肽的pp7衣殼蛋白二聚體均能組裝成直徑約為30nm的vlps(見圖6)。

(6)2pp7-tat-modivlps穿膜實(shí)驗(yàn)

根據(jù)sigma公司的異硫氰酸酯(fitc)說明書，將透析袋置于含0.1mg/mlfitc的ph9.0的新鮮配制的碳酸鹽緩沖液中，4℃攪拌過夜。然后用bio-gela-1.5m凝膠過濾層析純化獲得純的fitc標(biāo)記的2pp7-tat-modivlps，并對(duì)其熒光效率進(jìn)行檢測(cè)。取10nmfitc標(biāo)記的2pp7-tat-modivlps加入到小鼠前列腺癌細(xì)胞系rm-1中，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,用熒光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中的熒光(見圖7)。在24h后，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均能看到比較明顯的綠色熒光，說明2pp7-tat-modivlps有較高的穿膜效率，進(jìn)一步表明2pp7-tat-modivlps表面展示的tat保留了其原有的穿膜功能。

以上所述本發(fā)明的具體實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思所做出的各種其他相應(yīng)的改變與變形，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。