本發(fā)明屬于分子體外診斷領(lǐng)域，具體涉及特別適用于腫瘤FFPE樣本中基因變異的試劑盒。
背景技術(shù)：
腫瘤組織多采用FFPE(formalin-fixed paraffin-embedded，福爾馬林固定石蠟包埋)樣品的形式進(jìn)行保存。數(shù)量巨大的歸檔FFPE樣本為回顧性研究，闡明疾病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)治療靶標(biāo)和指示預(yù)后提供寶貴的資源。但FFPE樣本研究極具挑戰(zhàn)，首先石蠟包埋的醫(yī)療樣本十分珍貴，每個(gè)樣本總量都很有限且不可替代。其次FFPE樣本在制造的過程中，福爾馬林的固定會使組織中的核酸發(fā)生不同程度的降解和分子間的交聯(lián)，石蠟高溫深入過程進(jìn)一步加速核酸的降解，保存的時(shí)間及環(huán)境對樣品中的核酸也有巨大影響。因此如何從有限的且容易發(fā)生核酸降解的FFPE樣本中成功檢測核酸的變異情況，是用于分子水平回顧性研究的關(guān)鍵。
有研究顯示，腫瘤的產(chǎn)生通常伴隨著核酸的變異。常見的變異類型有SNV(single nucleotide variant，單核苷酸變異)、CNV(Copy Number Variation，拷貝數(shù)變異)及FUSION(融合)等。
隨著新一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)的迅猛發(fā)展，大大的提高了測序速度，同時(shí)測序成本顯著降低。基于新一代測序技術(shù)平臺，臨床上應(yīng)用最廣的方法為在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對引物，能夠同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段的多重PCR測序技術(shù)。
目前，很多公司推出了多重PCR方法富集腫瘤相關(guān)基因區(qū)域的試劑盒，如Qiagen公司的GeneRead DNAseq Colorectal Cancer Panel、Illumina公司的TruSight Tumor 15、Illumina公司的TruSeq Amplicon Cancer Panel等，但是 這些試劑盒只能檢測SNV，對于CNV和FUSION，該類產(chǎn)品均不能準(zhǔn)確檢出，因此，多重PCR方法的適用性受到較大的限制。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測腫瘤FFPE樣本中基因變異的試劑盒，使用該試劑盒進(jìn)行基因檢測，并通過高通量測序平臺進(jìn)行測序，能夠同時(shí)穩(wěn)定的檢出基因SNV、CNV以及FUSION。
本發(fā)明的發(fā)明人為解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在腫瘤FFPE樣本基因變異的檢測方法中，通過使用基因捕獲的探針，即針對SNV區(qū)域設(shè)計(jì)的探針、針對CNV區(qū)域設(shè)計(jì)的探針、針對FUSION區(qū)域設(shè)計(jì)的探針，，公共引物如SEQ ID NO:1所示，標(biāo)簽引物如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:5所示核苷酸序列?？梢酝瑫r(shí)穩(wěn)定的檢出基因SNV、CNV以及FUSION。
即本發(fā)明包括：
1.一種用于檢測腫瘤FFPE樣本中基因變異的試劑盒，其包括用于基因捕獲的探針，所述基因捕獲的探針包括：針對SNV區(qū)域設(shè)計(jì)的探針、針對CNV區(qū)域設(shè)計(jì)的探針、針對FUSION區(qū)域設(shè)計(jì)的探針，公共引物如SEQ ID NO:1所示，以及標(biāo)簽引物如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:5所示核苷酸序列。
2.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其中，所述腫瘤為胃癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌及卵巢癌中的一種或兩種以上。
3.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其中，所述基因捕獲的探針是生物素化的。
4.根據(jù)項(xiàng)1～3中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，所述基因捕獲試劑盒還包括鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠。
5.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括用于提供雜交捕獲反應(yīng)的離子環(huán)境的緩沖液。
6.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括用于洗脫物理吸附或非特異性雜交的清洗液。
7.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其中，所述試劑盒用于在腫瘤相關(guān)基因的基因捕獲測序中進(jìn)行基因捕獲；優(yōu)選地，所述基因捕獲測序用于檢測腫瘤相關(guān)基因的SNV、CNV、以及FUSION。
8.一種腫瘤FFPE樣本中基因變異的檢測方法，其中，使用項(xiàng)1～7中任一項(xiàng)所述試劑盒進(jìn)行基因檢測。
9.一種用于檢測腫瘤FFPE樣本中基因變異的二代測序DNA文庫的構(gòu)建方法，其中，包括對構(gòu)建的文庫進(jìn)行基因捕獲的步驟，其中所述基因捕獲使用項(xiàng)1～7中任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行。
10.一種捕獲探針，其中，所述基因捕獲的探針包括針對SNV區(qū)域設(shè)計(jì)的探針、針對CNV區(qū)域設(shè)計(jì)的探針、和/或針對FUSION區(qū)域設(shè)計(jì)的探針。
有益效果：相對于現(xiàn)有方法，本發(fā)明的試劑盒能夠同時(shí)檢測更多的區(qū)域，同時(shí)檢測出基因SNV、CNV及FUSION。
附圖說明
圖1為實(shí)施例1中樣本1的CNV檢測結(jié)果的示意圖。
發(fā)明的具體實(shí)施方式
本說明書中提及的科技術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義，如有沖突以本說明書中的定義為準(zhǔn)。
一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測腫瘤FFPE樣本中基因變異的試劑盒，其包括用于基因捕獲的探針，所述基因捕獲的探針包括：針對SNV區(qū)域設(shè)計(jì)的探針、針對CNV區(qū)域設(shè)計(jì)的探針、針對FUSION區(qū)域設(shè)計(jì)的探針，公共引物如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列引物(如下表)，以及標(biāo)簽引物如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO 3所示核苷酸序列引物(如下表)。
在這里所述腫瘤為胃癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌及卵巢癌等中一種或兩種以上。
優(yōu)選地，所述用于捕獲探針是生物素化的。這樣，可以使用鏈霉親和素標(biāo)記的固相載體將捕獲了目標(biāo)基因后的探針分離出來，所述固相載體優(yōu)選為磁珠。優(yōu)選地，本發(fā)明的基因捕獲試劑盒還包括鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠。
優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包括用于雜交捕獲反應(yīng)的離子環(huán)境的緩沖液。
優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包括用于洗脫屋里吸附或非特異性雜交的清洗液，它們用于提高基因捕獲的特異性。
優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包括用于對于捕獲到的目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增的引物。
優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒用于在腫瘤FFPE樣本中基因變異檢測中進(jìn)行基因捕獲，更優(yōu)選地，所述基因捕獲測序用于檢測腫瘤FFPE樣本中相關(guān)基因的SNV、CNV、以及FUSION。
本發(fā)明的試劑盒中的各個(gè)組分優(yōu)選獨(dú)立地包裝于容器中，但在不影響使用的前提下，也可以將其中的一些組分合并包裝。
在本說明書中，SNV(single nucleotide variant，單核苷酸變異)是一種體細(xì)胞單核苷酸突變；CNV(Copy Number Variation，拷貝數(shù)變異)是指由 基因組發(fā)生重排而導(dǎo)致的,一般指長度為1kb以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少；FUSION(融合)是指兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)斷裂，重新首尾相連，置于同一套調(diào)控序列。
在本說明書中，腫瘤相關(guān)基因是指可輔助用作診斷腫瘤，指導(dǎo)腫瘤用藥和/或預(yù)測腫瘤預(yù)后的基因。通常認(rèn)為，罹患腫瘤的患者中，基因具有特定的變異結(jié)果，例如，該基因的變異可以為SNV、CNV和FUSION中的一種或兩種或三種。
在本說明書中，所述基因捕獲的探針還可以包括針對目標(biāo)疾病相關(guān)的其他基因的探針。與疾病相關(guān)的其他基因是指：在目標(biāo)疾病中可能發(fā)生各種類型突變的基因，其可用作診斷目標(biāo)疾病、指導(dǎo)目標(biāo)疾病用藥和/或預(yù)測預(yù)后的基因，但在罹患目標(biāo)疾病的患者細(xì)胞的基因組中，該基因的特定的結(jié)構(gòu)變異不常見或不具備臨床意義。
本發(fā)明的基因變異的試劑盒可用于檢測腫瘤FFPE樣本中基因變異的二代測序DNA文庫的構(gòu)建(本發(fā)明的建庫方法)，構(gòu)建的二代測序DNA文庫可用于腫瘤FFPE樣本中基因變異的檢測。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種腫瘤FFPE樣本中基因變異的檢測方法(本發(fā)明方法)，包括對構(gòu)建的文庫進(jìn)行基因捕獲的步驟，其中，基因捕獲使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行。具體包括步驟如下：
步驟A：提取FFPE樣本的基因組DNA，獲得基因組DNA；
步驟B：將提取的基因組DNA進(jìn)行打斷，獲得打斷后的DNA片段；
步驟C：將打斷后的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，得到平末端DNA；
步驟D：將平末端DNA片段進(jìn)行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步驟E：將3'端加A的DNA片段進(jìn)行加接頭，得到加接頭的DNA片段；
步驟F：將加接頭的DNA片段進(jìn)行PCR，得到文庫；
步驟G：利用捕獲探針進(jìn)行雜交，得到雜交產(chǎn)物；
步驟H：將雜交產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雜交后的PCR產(chǎn)物；
步驟I：將雜交后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。
文庫的構(gòu)建、基因捕獲可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行操作。
捕獲的文庫經(jīng)質(zhì)檢后可以進(jìn)行上機(jī)測序，從而得到測序數(shù)據(jù)。測序平臺可以是例如Illumina HiSeq 2500、4000平臺或者NextSeq 550AR平臺(發(fā)明人確認(rèn))。
優(yōu)選地，步驟C和步驟D，步驟D和步驟E，步驟E和步驟F，步驟F和步驟G，步驟G和步驟H，和/或步驟H和步驟I之間具有純化步驟，其純化步驟優(yōu)選使用鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠。
最后，本發(fā)明提供一種捕獲探針，所述基因捕獲的探針包括針對SNV區(qū)域設(shè)計(jì)的探針、針對CNV區(qū)域設(shè)計(jì)的探針、和/或針對FUSION區(qū)域設(shè)計(jì)的探針。優(yōu)選地，所述基因捕獲的探針是生物素化的。
實(shí)施例
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的實(shí)施例是用于解釋本發(fā)明，而非用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例1
1.1腫瘤基因檢測液體芯片的設(shè)計(jì)及合成
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及多個(gè)數(shù)據(jù)庫(NCBI-PDB、PubMed、COSMIC、Clinvar、HGMD、GeneCards、zj-LOVD等)的信息，選擇了用于血液病檢測的目標(biāo)基因，或特定目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的探針與NCBI等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，并且要確保探針的堿基個(gè)數(shù)在60～80nt之間、TM值適中、無回文序列等特殊結(jié)構(gòu)、與序列同源性在50％～80％之間，通過這些數(shù)值以確保探針的特異性。
將設(shè)計(jì)出的探針序列合成為寡核苷酸探針，PCR驗(yàn)證后獲得腫瘤相關(guān)基因捕獲探針克隆庫。
利用生物素標(biāo)記數(shù)量和位置確定的擴(kuò)增引物或接頭元件制備含有利于靶標(biāo)片段抓取的捕獲探針文庫，最終得到已知生物素標(biāo)記數(shù)量和位置的捕獲探針集即帶有生物素標(biāo)記的捕獲探針庫。
1.2DNA提取
樣本取自保存半年的非小細(xì)胞肺癌的FFPE樣本(樣本1)及保存半年的肺癌的FFPE樣本(樣本2)，使用GeneRead DNA FFPE Kit試劑盒(Qiagen公司)提取FFPE樣本DNA，具體步驟參照Qiagen DNA提取試劑盒步驟。
1.2.1打斷
使用Biorupter打斷儀器進(jìn)行打斷，設(shè)定打斷條件30個(gè)循環(huán)，30s ON/30s OFF，將FFPE樣本DNA打斷成200bp左右的片段，得到打斷后的DNA片段。
1.3末端修復(fù)(End Repair):
(1)預(yù)先從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，將其置于冰盒上化凍并震蕩混勻。單個(gè)樣本配制量參見表1，多樣本可按比例配制Mix。
表1
(2)末端修復(fù)反應(yīng)：向1.5mL的離心管中分裝好25μL Mix，分裝完成并確認(rèn)加入無誤后，加入DNA樣本將1.5mL離心管置于Thermomixer中20℃溫浴30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后使用1.8×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，溶于32μL EB。
1.4末端加“A”
(1)預(yù)先從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，將其置于冰盒上化凍并震蕩混勻。單個(gè)樣本配制量參見表2，多樣本可按比例配制Mix：
表2
(2)末端加“A”反應(yīng)：向1.5mL的離心管中分裝18μL Mix，確認(rèn)無誤后，加入32μL上一步純化回收的DNA。加完后震蕩混勻并離心，將1.5mL離心管置于Thermomixer中37℃溫浴30分鐘。使用1.8×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，溶于18μL EB中。
1.5接頭的連接
(1)預(yù)先從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，將其置于冰盒上化凍并震蕩混勻。單個(gè)樣本配制量參見表3，多樣本可按比例配制Mix：
表3
(2)接頭的連接反應(yīng)：向1.5mL的離心管中分裝27μL Mix，確認(rèn)無誤后，加入18μL上一步純化回收的DNA。加完后震蕩混勻并離心，將樣本管置于Thermomixer中20℃溫浴15分鐘。使用1.8×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，溶于30μL的EB中。
1.6PCR反應(yīng)
(1)從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，其中樣本1使用的標(biāo)簽序列引物為標(biāo)簽引物In1所示的核苷酸序列，樣本2使用的標(biāo)簽序列引物為標(biāo)簽引物In2所示的核苷酸序列。將其置于冰盒上化凍并震蕩混勻。0.2mL的PCR管中配制PCR反應(yīng)體系，多樣本可按比例配制Mix：
表4
(2)設(shè)定PCR程序，PCR反應(yīng)的程序設(shè)定如下：
反應(yīng)結(jié)束及時(shí)將樣品取出放入4℃冰箱保存并按要求退出或關(guān)閉儀器。
(3)用0.9×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，純化后的文庫溶于20μL的ddH2O中。貼好標(biāo)簽，小片段文庫建庫完成。對文庫進(jìn)行Qubit檢測，記錄各個(gè)文庫濃度大小。將文庫送檢安捷倫2100，保存峰圖結(jié)果。
公共引物序列(SEQ ID NO:1)：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
標(biāo)簽引物In1引物序列(SEQ ID NO:2)：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGTAAGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
標(biāo)簽引物In2引物序列(SEQ ID NO:3)：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGGAATAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
1.7準(zhǔn)備雜交文庫
(1)本實(shí)驗(yàn)中，用于提供雜交捕獲反應(yīng)的離子環(huán)境的緩沖液、以及用于洗脫物理吸附或非特異性雜交的清洗液、漂洗液均可從商業(yè)途徑獲得。
(2)準(zhǔn)備雜交文庫：將待雜交的DNA文庫在冰上融化，取總質(zhì)量1μg(在后續(xù)操作步驟中將此DNA文庫稱為樣本文庫)。
(3)制備Ann引物Pool：將樣本文庫Index對應(yīng)的標(biāo)簽引物In1/In2(100μM)及公共引物(100μM)置于冰上融化，各取1000pmol混合(在后續(xù)操作步驟中將此混合物稱為Ann引物pool)。
(4)雜交樣本的制備：向1.5mL EP管中加入5μL COT DNA(Human Cot-1DNA，Life technologies，1mg/mL)以及1μg樣本文庫。向混合物中加入Ann引物pool。用封口膜密封制備好的雜交樣本EP管，調(diào)節(jié)真空干燥儀的溫度至50～60℃，將盛有樣本文庫/COT DNA/Ann引物pool的EP管置于真空裝置中直到完全干燥。
(5)雜交樣本的溶液：向樣本文庫/COT DNA/Ann引物pool的干粉中加入：
7.5μL 2×雜交緩沖液
3μL雜交組分A
至此，EP管中含有以下組分：
表5
1.8準(zhǔn)備雜交文庫
(1)將加入雜交緩沖液的上述混合物渦旋震蕩10秒，充分混勻后最大轉(zhuǎn)速離心10秒。
(2)將上述混合物置于預(yù)先準(zhǔn)備好的95℃加熱模塊上變性10分鐘。取下變性后的混合物，室溫下最大轉(zhuǎn)數(shù)離心10秒。
(3)將上述混合物轉(zhuǎn)移至含有4.5μL捕獲芯片的0.2mL平蓋PCR管中。渦旋震蕩3秒，充分混勻后最大轉(zhuǎn)數(shù)離心10秒。至此，雜交樣品混合物中含有如下組分：
表6
(4)將雜交樣品混合物置于47℃加熱模塊上16小時(shí)。加熱模塊的熱蓋溫度需設(shè)定為57℃，雜交后產(chǎn)物需進(jìn)行后續(xù)洗脫回收操作。
(5)將10×清洗液(Ⅰ，Ⅱ與Ⅲ)、10×漂洗液和2.5×磁珠清洗液配置成1×工作液。
表7
(6)將下列試劑在47℃下加熱模塊中預(yù)熱：
400μL 1×漂洗液
100μL 1×清洗液I
1.9制備親和吸附磁珠
(1)實(shí)驗(yàn)開始前，將鏈霉親和素磁珠(Dynabeads M-280Streptavidin，以下簡稱磁珠)在室溫下平衡30分鐘后，將磁珠充分渦旋混勻15秒。
(2)向1.5mL離心管中分裝100μL磁珠，1個(gè)1.5mL離心管最多可用來制備6個(gè)雜交捕獲所需的磁珠。
(3)將盛有磁珠的離心管置于磁力架上，約5分鐘后小心吸棄上清，將磁珠留在離心管中，加兩倍于磁珠初始體積的1×磁珠清洗液。將離心管從磁力架上取下，渦旋混勻10秒。將盛有磁珠的離心管放回磁力架，吸附磁珠。待溶液澄清，吸棄上清。重復(fù)次步驟，共洗滌兩次。
(4)洗滌完畢后吸棄磁珠清洗液，用磁珠初始體積的1×磁珠清洗液渦旋重懸磁珠。將重懸的100μL磁珠轉(zhuǎn)入0.2mL的PCR管中。將PCR管置于磁力架上吸附磁珠，溶液澄清后吸棄上清。至此，捕獲DNA所需的親和吸附磁珠制備完畢，應(yīng)立即進(jìn)行下步結(jié)合反應(yīng)。
1.10DNA與親和吸附磁珠的結(jié)合及漂洗
(1)將雜交的樣本文庫轉(zhuǎn)入盛有親和吸附磁珠的0.2mL PCR管中，吸打10次，將二者混勻。
(2)將0.2mL PCR管置于47℃加熱模塊45分鐘，每隔15分鐘渦旋混勻一次，使DNA與磁珠結(jié)合。
(3)45分鐘孵育后，向15μL捕獲的DNA樣本中加入47℃預(yù)熱的1×清洗液I 100μL。渦旋混勻10秒。將0.2mL PCR管中的全部組分轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。將1.5mL離心管置于磁力架上吸附磁珠，棄上清。
(4)將1.5mL離心管從磁力架上取下，加入200μL預(yù)熱47℃的1×漂洗液。吸打混勻10次(需迅速操作，防止試劑、樣品溫度低于47℃)?；?勻后樣本置于47℃加熱模塊上5分鐘。重復(fù)此步驟，用47℃的1×漂洗液共洗滌兩次。將1.5mL的離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。
(5)向上述1.5mL離心管中加入200μL室溫的1×清洗液I，渦旋混勻2分鐘。將離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。向上述1.5mL離心管中加入200μL室溫的1×清洗液Ⅱ，渦旋混勻1分鐘。將離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。向上述1.5mL離心管中加入200μL室溫的1×清洗液Ⅲ，渦旋混勻30秒。將離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。
(6)1.5mL離心管從磁力架上取下，加入45μL PCR水，溶解洗脫磁珠捕獲樣本。將磁珠—樣本混合物放在-20℃保存。
1.11捕獲DNA的PCR擴(kuò)增
(1)按下表制備捕獲后PCR mix，制備好后渦旋震蕩混勻。余下的磁珠吸附DNA放在-20℃保存。富集引物F和富集引物R均購自英濰捷基公司。
(2)磁珠吸附DNA PCR的擴(kuò)增程序設(shè)定如下：
(3)雜交捕獲DNA PCR產(chǎn)物的回收純化：用核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，磁珠使用量為0.9×磁珠，純化后的文庫溶于30μL的ddH2O中。貼好標(biāo)簽，雜交捕獲文庫建庫完成。
1.12文庫定量
對文庫進(jìn)行2100Bio Analyzer(Agilent)/LabChip GX(Caliper)及QPCR檢測，記錄文庫濃度。
1.13文庫上機(jī)測序
構(gòu)建好的文庫用NextSeq 550AR進(jìn)行測序。
1.14數(shù)據(jù)處理及分析
對比例
同樣使用樣本1和樣本2利用Illumina公司的TruSeq Amplicon Cancer Panel試劑盒進(jìn)行雜交，具體參照試劑盒的說明書進(jìn)行。
實(shí)施例通過對測序結(jié)果的分析，具體結(jié)果如下：
樣本1中EGFR基因存在SNV：樣本1的EGFR基因以NM_005228為參考序列時(shí)。編碼區(qū)2573位堿基由T突變?yōu)镚，導(dǎo)致EGFR所編碼蛋白的第13位氨基酸由亮氨酸(L)突變?yōu)榫彼?R)，突變頻率發(fā)到70.74％。
樣本1中ERBB2存在CNV：由圖1可知，橫軸為人參考基因組(hg19)坐標(biāo)，中坐標(biāo)為經(jīng)過均一化處理的深度信號值，一般認(rèn)為該信號值在0附近波動為正常。圖1中標(biāo)記ERBB2的區(qū)域?yàn)榇龣z測區(qū)域：可以看到待檢測區(qū)域的深度信號值已明顯偏離了0附近的區(qū)域，故該結(jié)果被認(rèn)為ERBB2陽性，該樣本存在CNV。
樣本2中EML4基因和ALK基因存在融合：EML4基因位于2號染色體第29446588位堿基發(fā)生斷裂，同樣ALK基因位于2號染色體上第42552712位堿基發(fā)生斷裂，EML4與ALK基因重新連接，形成新的EML4-ALK融合基因。
在對比例中，經(jīng)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，樣本1中存在EGFR基因SNV，而且發(fā)生的位置及突變情況與實(shí)施例中結(jié)果一致，但通過對比例的方法未發(fā)現(xiàn)樣本1中ERBB2存在CNV。在樣本2中未發(fā)現(xiàn)中EML4基因和ALK基因存在融合。
為了進(jìn)一步證明本發(fā)明結(jié)果的準(zhǔn)確性，發(fā)明人使用一代測序方法對樣本的SNV情況進(jìn)行驗(yàn)證，并使用RT-PCR和qPCR聯(lián)合的方法驗(yàn)證CNV，同時(shí)使用FISH的方法驗(yàn)證了FUSION，結(jié)果表明該樣本存在SNV、CNV及 FUSION情況，結(jié)果與本發(fā)明檢測的結(jié)果一致，說明本發(fā)明的方法及試劑盒能夠檢測出樣本的SNV、CNV以及FUSION。
工業(yè)實(shí)用性
根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種用于檢測腫瘤FFPE樣本中基因變異的試劑盒。
序列表
<110> 安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司
<120> 用于檢測腫瘤FFPE樣本中基因變異的試劑盒
<130> 1624-2TGCN
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 公共引物
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 58
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 標(biāo)簽引物In1
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGTAAGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 66
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 標(biāo)簽引物In2
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGGAATAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 66
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 標(biāo)簽引物In3
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 66
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 標(biāo)簽引物In4
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACTCGTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 66