本發(fā)明屬于香菇菌種的檢測領(lǐng)域，特別涉及一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國香菇產(chǎn)量已從1983年的1.95萬噸迅速發(fā)展到2015年的766萬噸，占全球香菇總產(chǎn)量的70％以上，改寫了世界食用菌產(chǎn)量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產(chǎn)量差距，有專家預(yù)測，由于中國香菇產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在近10年內(nèi)其將成為世界產(chǎn)量最高的食用菌。中國香菇以其驚人的發(fā)展速度，優(yōu)質(zhì)的品質(zhì)及低廉的成本為世界菇業(yè)人士矚目，中國香菇已風(fēng)靡世界。

優(yōu)質(zhì)菌種在香菇單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產(chǎn)業(yè)中的重要地位。1999年我國簽署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種知識產(chǎn)權(quán)，同時也要加強保護我們國家自己的品種知識產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品種登記制度來真正保護我國的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登記奠定基礎(chǔ)。尤其日本2004年4月1日開始實行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其是香菇的出口構(gòu)成了極大的威脅。就國內(nèi)而言，香菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的現(xiàn)象，不僅給菇農(nóng)帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香菇的快速發(fā)展；而且，隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn)，對香菇栽培菌株質(zhì)量的要求越來越高，需要發(fā)展更為簡便、快速、準確的菌株鑒定技術(shù)，以保證每批次的用種都準確無誤。

面對這種局勢，就需要進一步加快菌種鑒定技術(shù)的研究，在香菇的研究中引進更為有效的菌種鑒定體系。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該指紋圖譜與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高，重復(fù)性好的優(yōu)點。

本發(fā)明的一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜，該指紋圖譜由8對SSR標記組成。SSR標記是基于香菇全基因組測序后開發(fā)的簡單重復(fù)序列片段(SSR)的擴增引物，經(jīng)過對不同香菇品種進行PCR擴增后獲得的多態(tài)性標記。SSR標記具有擴增帶型好，重復(fù)性高的特點。本發(fā)明對大量的SSR引物進行了篩選，獲得了8對多態(tài)性高的引物，用這8對引物組合獲得的圖譜帶型，檢測目前我國主要栽培的40個香菇品種大多都具有專一性。這8對SSR標記的詳細信息如表1。

表1 SSR標記詳細信息列表

本發(fā)明的一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括：

(1)菌絲培養(yǎng)：將香菇菌種轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDB中，23-25℃下避光搖瓶培養(yǎng)，3-4d后收集菌絲；

(2)基因組DNA的提?。河肅TAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度一致；

(3)SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行8對SSR標記的PCR擴增；

(4)電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產(chǎn)物與加樣緩沖液混勻，變性，點樣于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染，顯色，拍照，分析結(jié)果。

所述步驟(2)中的CTAB法提取菌絲的基因組DNA具體工藝包括：

(1)將-20℃冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液，于65℃保溫45-60min，輕搖混勻；

(2)12000rpm、4℃離心20min，取上清液；

(3)在上述上清液中加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入離心管中；

(4)在上述離心管中加入體積比為24∶1的氯仿和異戊醇混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；

(5)在上述離心管中加入2/3體積(相對于步驟(4)中的上清液)的-20℃預(yù)冷的異丙醇，搖動5min，8000rpm、4℃離心10min，去上清；

(6)將得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2-3次，每次8000rpm，室溫離心5min；

(7)加入預(yù)冷的95vol％乙醇，上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；

(8)加入100μL 1×TE(Tris/EDTA)緩沖液，使沉淀溶解；

(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

(10)將得到的DNA提取物于-20℃貯藏備用。

所述步驟(3)中的PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR標記正向引物和反向引物總體積各1.5μL，濃度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH₂O 10.4μL；

PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃5min。

所述步驟(4)中的加樣緩沖液用量為2μL；PCR擴增得到的產(chǎn)物點樣量為3μL。

所述步驟(4)中的變性的具體工藝為：于95℃變性5min，結(jié)束后置于冰水混合物中冷卻3min。

所述步驟(4)中的電泳的工藝參數(shù)為：變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為6％，電泳緩沖液為1×TBE，電壓1000v，電流200mA，功率200W，電泳45min。

所述步驟(4)中的銀染的具體工藝為：電泳完成后卸下并拆開玻璃板，膠板卸下后，用去離子水水洗5-8s，瀝干水分后，在銀染液中避光銀染8min，銀染后，用去離子水水洗5-8s，瀝干水分，放入顯影液中，至顯影后取出水洗后即可讀數(shù)。銀染液、顯影液均可用3-4次。該銀染顯影方法是常規(guī)方法的簡化，在高通量試驗中較為高效實用。

所述銀染液的組成為1.5g AgNO₃和1500ml H₂O；顯影液的組成為16g NaOH、1000ml H₂O和8ml甲醛。

本發(fā)明的一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜的應(yīng)用，是利用香菇基因組簡單重復(fù)序列片段開發(fā)的8對SSR引物，對擴增L9015菌株的總DNA進行PCR擴增，L9015菌種的擴增條帶在收集的40份我國香菇主要栽培品種中具有專一性。表2為本發(fā)明使用的8對SSR引物在40份香菇品種中擴增出的所有等位片段的數(shù)量及編號(按照擴增片段從大到小編號，通過對照50bp ladder DNA marker確定各SSR引物擴增的各等位片段的相對分子量)。菌種L9015使用這8對SSR引物的擴增片段在總等位片段中的編號組合為：(1)(4)(1+3+6)(1+4)(3)(4)(1+4)(1)，表3為菌種L9015擴增片段組合的位置與大小。符合上述等位片段組合的菌種，即是香菇L9015菌種。

表2 SSR引物擴增的所有等位片段信息匯總表

表3菌種L9015擴增的等位片段編號表

有益效果

本發(fā)明與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高，重復(fù)性好的優(yōu)點。檢測所需時間只需要3-4d，而常規(guī)的拮抗試驗所需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要至少3個月的時間；該方法在所收集的我國40個香菇主栽菌種中具有L9015菌種的專一性，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜，其中M是50bp DNA ladder，數(shù)字代表的是所用的8對SSR引物，箭頭所指的是香菇L9015菌種的穩(wěn)定且特異的SSR等位片段組合。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1

(1)菌絲培養(yǎng)：將香菇菌種轉(zhuǎn)接到裝有100ml馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDB的三角瓶中，23-25℃下避光搖瓶培養(yǎng)，3-5d后收集菌絲；

(2)基因組DNA的提?。河肅TAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度一致；

CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括：

a將-20℃冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液，于65℃保溫45-60min，間或輕搖混勻；

b12000rpm、4℃離心20min，取上清液；

c在上述上清液中加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入離心管中；

d在上述離心管中加入體積比為2∶1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；

e在上述離心管中加入2/3體積(相對于步驟(4)中的上清液)的-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖動5min，8000rpm、4℃離心10min，去上清；

f將得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2-3次，每次8000rpm，室溫離心5min；

g加入預(yù)冷的95vol％乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；

h加入100μL 1×TE(Tris/EDTA)緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；

i加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

j將得到的DNA提取物于-20℃冰箱貯藏備用；

(3)SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行基因SSR標記的PCR擴增；

PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR標記正向引物和反向引物總體積各1.5μL，濃度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH₂O 10.4μL；

PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃5min。

(4)電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產(chǎn)物與2μL加樣緩沖液混勻，于95℃變性5min，結(jié)束后置于冰水混合物中冷卻3min，點樣3μL于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為6％，電泳緩沖液為1×TBE，電壓1000v，電流200mA，功率200W，電泳45min，銀染，顯色，拍照，分析結(jié)果。

銀染的具體工藝為：電泳完成后卸下并拆開玻璃板，膠板卸下后，用去離子水水洗5-8s，瀝干水分后，在銀染液(1.5g AgNO₃和1500ml H₂O)中避光銀染8min，銀染后，用去離子水水洗5-8s，瀝干水分，放入顯影液(16g NaOH、1000ml H₂O和8ml甲醛)中，至顯影后取出水洗后即可讀數(shù)。銀染液、顯影液均可用3-4次。該銀染顯影方法是常規(guī)方法的簡化，在高通量試驗中較為高效實用。

采用8對SSR引物對香菇菌株進行PCR擴增，通過對照50bp ladder DNA marker可確定各SSR引物擴增的等位片段的數(shù)量和相對分子量，找到帶型符合編號組合為：(1)(4)(1+3+6)(1+4)(3)(4)(1+4)(1)的菌種，即可確定該菌種為香菇L9015菌種，如圖1中箭頭標注所示。為保證鑒定的準確性，需進行三次重復(fù)實驗。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

<130> 1

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccaaaaagg atttcagcaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaccggagtg gtgtaagtgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagcaggtca gagcaggttc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accgagagca gagtcgagag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctctttgcac cctcaacctc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cagcagtctc ctcttggctc 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ataggatgat tgaacgagca g 21

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

accgtaaggt gggaagaaa 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgccgttcc aaagatac 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tctgtaacgc ttgtggacta 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cattgctcgg atccttcatt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cattgctcgg atccttcatt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gggcgaaaca atttcaggta 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgccatcgt aaggaactcg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acgcgtatcc tcccctaagt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aagcgatatg gatttgacgc 20